Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336

Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 46 336

m BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỀN THỊ BÍCH DIỆP GÓP PHẨN NGHIÊN cứu SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 46.336 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHOÁ 2001-2006) Người hướng dân: N(ri thực hiện: PGS. TS Cao Văn Thu Bộ môn Vì sinh- Sinh học Thời gian thực hiện: Từ 01/2006 đến 05/2006 & Oỹ HÀ NỘI, THÁNG 5/ 2006 m Lời cảm ơn Vói lòng kính trong vả biết ơn sâu sẳc, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thồnh đển thẩy giáo PGỎ.TỔ Cao Văn Thu, ngưòi đỗ trực tiểp hưỏng dẫn, giúp đõ tôi hoồn thành khoá luận này. Tỏi cũng xin chân thành cảm ơn cảc thầy cô, các cán bộ kỹ thuật viên bộ mòn Vi ỏinh-ỏinh Học và các bộ môn khác đã tạo điéu kiện, tận tình giúp đõ tôi trong thòi gian thực hiện khoá luận. Do thòi gian nghiên cửu và trình độ bản thân có hạn. khoả luận không tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ỷ cùa thầy cô, bạtì bè đổng nghiệp đ ể khoá luận hoàn thiện hơn. Tối xỉn h'ân írọng cảm ữn./. Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2006 Sinh Viên Qlạuụễn. ^ íú h CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT AND B.cereus B.puminus B.subtiỉis D(mm) E.coỉi Gy ISP MT MTdd p.mỉrabilis p.aeruginosa s s s.typhi s.ỉutea s.flexneri S.aureus SKLM TS v sv w :Acid deoxyribonucleic. '.Bacillus cereus ATCC 9946. .'Bacillus puminus ATCC 10241 Bacillus subtiỉis ATCC 10241. : Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn. ■.Escherichia coỉi ATCC 25922. :Grey-xám. :Intemationnal Streptomyces Project-Chương Trình (§t^omyceiX)\x6c Tế. :Môi trường. :Môi trường dung dịch. .Proteus mirabiỉis BV 108. '.Pseudomonas aeruginosa VM 201. :Độ lệch thực nghiệm chuẩn hiệu chỉnh. :Spirales-Xoắn. '.Saỉmoneỉa typhi DT 220. ScJ :Sarcina lutea ATCC 9341. :Shigelỉa flexneri DT 112. :StaphỵỊpccus.aureus ATCC 1228. :Sắc kỵ lớp mỏng- :Tham số. :Vi sinh vật. ;White-Trắng. M ỤC LỤC ĐẶT VÂN ĐỂ 1 PHẦN 1, TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về kháng sinh 2 1.1.2 Phân loại kháng sinh 2 1.1.3 Các ứng dụng của kháng sinh 3 1.1.4 Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn 3 1.1.5 Quá trình sản xuất kháng sinh 4 1.2. Xạ khuẩn 5 1.2.1. Đặc điểm chung 5 1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 5 1.2.3. Phân loại Streptomyces 6 1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 6 1.3. Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật 7 1.3.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 8 1.3.2. Đột biến nhân tạ o 8 1.3.3. Bảo quản giống vi sinh vật 8 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9 1.4.1. Phưcíng pháp lên men bề mặt 9 9 11 1,6, Một số nghiên cứu gần đáy về vi sinh, kháng sinh 12 1.6.1. Sự phân lập, hoạt tính kháng nấm và nấm noãn của kháng sinh Staurosporin từ chủng Streptomyces roseoỷỉavus LS - A24 12 1.4.2. Phương pháp lên men chìm ^ 1.5. Tách chiết và tinh chế sản lẽn nieiLphẩiìi sau khỉ 1.6.2. Động học của quá trình lên men sinh tổng hợp các chất kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn Streptomyces QN - 29 và ĐN “ 110 13 PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15 2.1. Nguyên liệu 15 2.1.1. Giống xạ khuẩn — 15 2.1.2 Chủng vi sinh vật kiểm định 15 2.1.3. Các môi trường nuôi cấy 15 2.1.4. Dụng cụ và hoá chất 18 2.2. Phương pháp thực nghiêm 20 2.2.1 Phưcíng pháp giữ giống 20 2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh 20 2.2.3. Phưcmg pháp cải tạo giống vi sinh vật 21 2.2.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 23 2.2.5. Phưcỉng pháp lựa chọn mồi trường lên men tốt nhất — 23 2.2.6. Phưcỉng pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 24 2.2.7. Phưcỉng pháp xác địng độ bền của kháng sinh trong dịch lên men — 24 2.2.8. Phương pháp tách kháng sinh bằng SKLM 25 2.2.9. Phương pháp phân loại Streptomyces 46.336 theo ISP 26 2.3. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 27 2.3.1. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 46.336 trên môi trường phân lập (M T3) 27 2.3.2. Kết quả phân loại theo ISP 28 2.3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy và các vi sinh vật kiểm định của chủng Streptomyces 46.336 29 2.3.4 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 30 2.3.5. Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v 31 2.3.6. Kết quả lựa chọn môi trường lẽn men tốt nhất 33 2.3.7. Kết quả lên men chủng gổc, chủng tốt nhất sau sàng lọc ngẫu nhiên và chủng tốt nhất sau đột biến 34 2.3.8. Lựa chọn dung mồi chiết thích hợp 35 2.3.9. Kết quả SKLM 36 2.3.10. Nghiên cứu một số tính chất của dịch kháng sinh thô 37 PHẨN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 40 3.1. Kết luận 40 3.2. Đề xuất 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ khi penicillin được Alexander Fleming phát hiện (1928) và được chứng minh có tác dụng chữa bệnh (1941), trong hơn nửa thế kỷ qua, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thẩn kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực thuốc trên thế giới. Nhiều bệnh tật nhất là bệnh nhiễm khuẩn đã được đẩy lùi, sức khoẻ và tuổi thọ của con người không ngừng được nâng cao rõ rệt, Song song, tệ sùng bái và lạm dụng kháng sinh cũng phát triển mạnh làm xuất hiện ngày càng nhiều vi khuẩn kháng kháng sinh. Vì vậy việc tìm ra các chất kháng sinh mới luôn là vấn đề thcd sự hấp dẫn các nhà nghiên cứu khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau. ở Việt Nam, hầu hết các thuốc kháng sinh đều được nhập ngoại dưới dạng nguyên liệu, thành phẩm và bán thành phẩm. Do vậy một vấn đề được đặt ra và lúc nào cũng bức bách đó là chúng ta cần phải có sự đầu tư và đẩy mạnh việc nghiên cứu, sản xuất kháng sinh trên qui mô công nghiệp mà trước hết là qui mô phòng thí nghiêm. Trong số các v sv sinh tổng hợp kháng sinh, xạ khuẩn là nhóm có tiềm năng lớn. Chủng Streptomỵces 46.336 được bộ môn Vi sinh - Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội phân lập từ trong đất bùn nước ta. Và để góp phần vào nghiên cứu ban đầu trong việc tìm ra kháng sinh mới, chúng tôi đã chọn đề làì^^Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Steptomyces 46.336'cho khoá luận tốt nghiệp với các mục tiêu: > Xác định tên khoa học của Streptomyces 46.336 theo khoá phân loại ISP. > Chọn lọc, cải tạo giống để tìm ra những biến chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh hcfn chủng gốc. > Bước đẩu nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh trên qui mô phòng thí nghiệm. > Sơ bộ nghiên cứu chiết tách kháng sinh và một số tính chất của dịch lọc kháng sinh thô. PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về kháng sinh. 1.1.1. Định nghĩa. [5 Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt có nguốn gốc vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác, có hoạt tính sinh học cao, ò nồng độ thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách có chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật ) hay ^b ào ung thư. 1.1.2. Phân loại kháng sinh. 4 , [5], [14] Danh sách các kháng sinh được phát minh ngày càng dài thêm mãi. Việc phân loại các kháng sinh là cần thiết vì nó giúp cho các nhà khoa học tốn ít thời gian khi nghiên cứu các kháng sinh mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng, độc tính Có thể phân loại kháng sinh theo nhiều cách khác nhau: - Phân loại kháng sinh theo nguồn gốc. - Dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh. - Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh. - Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hoá học là khoa học nhất. Dựa vào cấu trúc hoá học chia kháng sinh làm các nhóm sau: + Các kháng sinh có chứa đường trong phân tử. + Kháng sinh chứa vòng lacton lớn (macrocỵclic lacton). + Quinon và các kháng sinh cùng họ. + Kháng sinh aminoacid và peptid. + Kháng sinh dị vòng chứa nitơ. + Kháng sinh dị vòng chứa oxy. + Các kháng sinh nhân thơm. 1.1.3. Các ứng dụng của kháng sinh. [5], [8 Đa số các kháng sinh sản xuất được dùng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra nhưng một số kháng sinh có những ứng dụng khác: chống ung thư, chống nấm, dùng trong chàn nuôi, trong trồng trọt và công nghiệp thực phẩm Bởi những ứng dụng rộng rãi này đã làm cho các nhà kinh tế và nhà nghiên cứu kết hợp với nhau rất chặt chẽ nhằm phát huy tối đa tính hiệu quả của kháng sinh. 1.1.4. Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn. [5], - Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một thời gian vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh và hoá trị liệu. - Các kiểu kháng thuốc của vi sinh vật: + Kháng thuốc nhiễm sắc thể bao gồm :kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc do đột biến. + Kháng thuốc ngoài nhiễm gồm đa kháng thuốc do nhân tố -R và các cơ chế di truyén như tải nạp, biến nạp, tiếp hợp. Ngoài ra còn có khái niệm kháng chéo ở các vi khuẩn có cơ chế kháng như nhau đối với các kháng sinh có cấu trúc h o á Ế ậ gần giống nhau. - Vi khuẩn kháng thuốc chủ yếu theo 3 cơ chế: + Thay đổi vị trí hay đích tác dụng của kháng sinh, + Tiết ra những enzym phân huỷ hoặc biến đổi kháng sinh, + Thay đổi tính thấm của màng tế bào. 1.1.5 Quá trình sản xuất kháng sinh. Bã Hình 1: Giứi thiệu sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh. [...]... NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 2.3.1 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 46. 336 trên môi trường phân lập (MT3) Hoạt tính của kháng sinh do chủng Streptomyces 46. 336 sinh tổng hợp trên MT3 được thử trên một sổ vi sinh vật kiểm định, kết quả được trình bày ở bảng 2 : Bảng 2: Kết quả thử tác dụng của kháng sinh do Streptomyces 46. 336 gốc sinh tổng hợp với các vi sinh vật kiểm định v s v kiểm định... chủng Streptomyces 46. 336 phát triển tốt và cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất ưên MT3 sau đó là MT2 Vậy ta chọn MT3 làm môi trường sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 46. 336, chọn hai chủng vi sinh vật kiểm định là Baciilus pumilus và Shigeỉla fiexneri Vì hai chủng này cho vòng vồ khuẩn to và rõ nét 2.3.4 Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên Giống xạ khuẩn Streptomyces. .. Như vâv, kháne sinh c 0 xạ khuẩn Streptomyces 46. 336 sinh tổng hợp có phổ tác dụng khá rộng trên cả vi khuẩn G(+) và vi khuẩn G(-) Do đó chúng tôi quyết định chọn chủng Streptomyces 46. 336 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo 2.3.2 Kết quả phân loại theo ISP - Tiến hành các thực nghiêm để phân loại xạ khuẩn Streptomyces 46. 336 theo ISP, đối chiếu với các đặc điểm phân loại của xạ khuẩn Streptomyces. .. 1.2.4 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces Một ưu điểm nổi bật của kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc Trong số hcfn 10.000 kháng sinh được biết đến trong y học ngày nay thì khoảng 60% kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn và trên 50% trong số đó thuộc chi Streptomyces Một số được giới thiệu ở bảng 1: Bảng 1 ; Một số kháng sinh có nguồn... các tính trạng dẫn đến hoặc là mất (giảm) khả năng tạo ra kháng sinh (đột biến âm) hoặc là tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiểu lần (đột biến dưcíng) Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các tác nhân đột biến 1.3.3 Bảo quản giống vi sinh vật, Bảo quản giống vi sinh vật là công việc hết s ứ c ^ ^ th iế t không phải chỉ... griseus Kháng nấm 9 Nistatin Streptomyces noursei Kháng nấm 10 Pymaricin Streptomyces nataỉnensỉs Kháng nấm 11 Paromomycin Sĩreptomyces rimosus Kháng đơn bào 12 Trichomycin Streptomyces hachifaensis Kháng đơn bào và nấm 13 Bleomycin Streptomyces verticiỉỉum Kháng ung thư 14 Actinomycin D Sreptomyces antihioticus Kháng ung thư 15 Daunombicin 16 Mitomorin c Kháng khuẩn Streptomyces peucetius Kháng ung thư Streptomyces. .. nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces STT Kháng sinh Nguồn gốc Tác dụng 1 Lìncomycin Streptomyces ỉincolnensis Kháng khuẩn 2 Oxytetracyclin Steptomyces rimosus Kháng khuẩn 3 (ầteptomyẽ]^ Streptomyces griseus Kháng khuẩn 4 Vancomycin Streptomyces orientaỉis Kháng khuẩn 5 Kanamycin Streptomyces kanamyceticus Kháng khuẩn 6 Tetracyclin Streptomces aureofaciens Kháng khuẩn 7 Cloramphenicol Streptomyces Venezuela... sinh kháng sinh chống nấm nhóm polyen qúi hiếm Qua nghiên cứu động học của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh và thử nghiệm khả nãng diệt một số nấm gây bệnh ở thực vật của hai chủng xạ khuẩn trên, cho thấy có thể sử dụng dịch nuôi cấy hai chủng xạ khuẩn QN - 29 và ĐN - 110 để xử lý hạt giống cà chua, đậu đỗ, lạc trước khi gieo * v ề động học quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh: Hai... thiêu ở bảng 3 - Đã quan sát và chụp ảnh hình thái xạ khuẩn Streptomyces 46. 336 dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 12 000 và 15 000 lần, kết quả giới thiệu ở hình 2,3 (phần phụ lục) Bảng 3: So sánh đặc điểm của Streptomyces 46. 336 với Streptomyces lusitanus Xạ khuẩn Đặc trưng Streptomyces 46. 336 Streptomyces lusitanus Màu khuẩn ty khí sinh Xám trắng(WGy) Xám trắng(WGỵ) Màu khuẩn ty cơ chất 0... những nghiên cứu ban đầu để tách kháng sinh staurosporin từ Streptomyces roseoflavus và chứng minh hoạt tính chống nấm noãn trên invivo và invitro của nó 1.6.2 Động học của quá trình lên men sình tổng hợp các chất kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn Streptomyces QN - 29 và ĐN -110 [l6 Hai chủng xạ khuẩn Streptomyces QN - 29 và ĐN - 110 được phân lập từ đất khu vực Quảng Nam - Đà nẩng có khả năng sinh kháng