Nghiên cứu tổng hợp thuốc kháng sinh linezolid ở quy mô phòng thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ LUÂN NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP THUỐC KHÁNG SINH LINEZOLID Ở QUY MÔ PHÕNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ LUÂN NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP THUỐC KHÁNG SINH LINEZOLID Ở QUY MÔ PHÕNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS.Văn Thị Mỹ Huệ TS.Nguyễn Quốc Vƣợng HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS Văn Thị Mỹ Huệ TS Nguyễn Quốc Vƣợng, ngƣời tận tụy hƣớng dẫn giúp đỡ em trình thực luận văn Em xin cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình : Ths Nguyễn Thị Huế, Ths Phạm Thị Hằng, Ths Vũ Văn Chiến (Phòng Công Nghệ Hóa Dƣợc – Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam), thầy cô môn, phòng ban, thƣ viện trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội Cuối em xin chân thành cảm ơn gia đình, anh chị em bạn đồng nghiệp động viên tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập nghiên cứu vừa qua Hà nội ngày 30 tháng 03 năm 2017 Học viên Phạm Thị Luân MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Những dẫn chất kháng khuẩn nhóm oxazolindinon 1.2 Tác dụng linezolid 1.2.1 Cơ chế tác dụng linezolid 1.2.2 Liên quan cấu trúc tác dụng 1.3 Các phƣơng pháp tổng hợp linezolid 11 1.4 Các phản ứng liên quan đến quy trình tổng hợp linezolid từ 17 chất trung gian 26 1.4.1 Phản ứng Gabriel 17 1.4.2 Phản ứng acetyl hóa 20 1.5 22 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm linezolid theo USP Pending Monograph 2012 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất 23 2.2 Dụng cụ, thiết bị 24 2.3 Nội dung nghiên cứu 24 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Phƣơng pháp tổng hợp linezolid 25 2.3.2 Phƣơng pháp tinh chế xác định cấu trúc 26 2.3.3 Phƣơng pháp định lƣợng linezolid 26 Chƣơng THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 27 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 27 3.1.1 Nghiên cứu quy trình tổng hợp hợp chất (S)-3-(3-fluoro-4- 27 morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl phthalimid (28) từ chất 5R)-5-(chloromethyl)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)- oxazolidin-2-on (26) 3.1.2 Nghiên cứu phản ứng kh hoá alkyl phtalimid 28 tổng hợp (S)- 31 5(aminomethyl)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)oxazolidin-2-on (17) 3.1.3 Nghiên cứu phản ứng tổng hợp linezolid (1) từ (S)-5(amino 36 methyl)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)oxazolidin-2-on (17) 3.2 TINH CHẾ LINEZOLID 41 3.3 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 42 LINEZOLID VÀ CÁC CHẤT TRUNG GIAN 3.4 KIỂM NGHIỆM LINEZOLID 48 CHƢƠNG BÀN LUẬN 50 4.1 VỀ TỔNG HỢP HÓA HỌC 50 4.1.1 Nghiên cứu quy trình tổng hợp hợp chất (S)-3-(3-fluoro-4- 50 morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl phthalimid (28) từ chất 5R)-5-(chloromethyl)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)- oxazolidin-2-on (26) 4.1.2 Về nghiên cứu phản ứng tổng hợp (S)-5(amino methyl)-3-(3- 53 fluoro-4-morpholinophenyl)oxazolidin-2-on (17) từ 2-(((S)-3-(3flouro-4-morpholinophenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl)methyl isoindolin1,3- dion (28) 4.1.3 Về nghiên cứu phản ứng tổng hợp linezolid (1) từ (S)-5(amino 55 methyl)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)oxazolidin-2-on (17) 4.2 VỀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 56 4.3.VỀ TINH CHẾ VÀ KIỂM NGHIỆM LINEZOLID 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 Tài liệu tham khảo Phụ lục 67 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ac2O Anhydrid acetic Bu Butyl 13 Nuclear Magnetic Resonance 13C (Phổ cộng C-NMR hƣởng từ hạt nhân carbon 13) DCM Dicloro methan DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMAc Dimethyl acetamid DMF N,N dimethyl formamid DMSO Dimethyl sulfoxid EA Ethyl acetat EtOH Ethanol FDA Food and Drug Administration HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence Nuclear Magnetic Resonance 1H (Phổ cộng H-NMR hƣởng từ hạt nhân proton) IPA Isopropyl alcohol IR Infrared spectroscopy (phổ hồng ngoại) MeOH Methanol MRSA Methicillin Resistant Staphyl lococus Aureus MS Mass spectroscopy(Phổ khối lƣợng) RT Room temperature (Nhiệt độ phòng) SKLM Sắc ký lớp mỏng TEA Triethylamin THF Tetrahydrofuran VRE Vancomycin Resistant Enterococci DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Số trang Hình 1.1: Nhân oxazolidinon Hình 1.2: Các dẫn chất 5-halomethyl-3-aryl-2 oxazolidinon Hình 1.3: Một số dẫn chất oxazolidinon Hình 1.4: Một số dẫn chất oxazolidinon Dupont Upjohn Hình 1.5: Cơ chế tác dụng linozelid Hình 1.6: Vai trò nhân oxazolidinon Hình 1.7: Cấu trúc linezolid dẫn xuất oxazolidinon trình th nghiệm lâm sàng Hình 1.8: Những biến tính vòng A Hình 1.9: Những biến tính vòng B 10 Hình 1.10: Những biến tính vòng C 11 Hình 1.11: Sơ đồ tổng hợp linezolid theo phƣơng pháp 12 Pharmacia & Upjohn Hình 1.12: Quy trình tổng hợp Linezolid theo phƣơng pháp Li 13 Hình 1.13: Phƣơng pháp tổng hợp Xu 14 Hình 1.14: Sơ đồ tổng hợp linezolid theo phƣơng pháp 15 Lee Pharma Limited Hình 1.15: Sơ đồ tổng hợp theo phƣơng pháp Zhang 16 cộng 16 Hình 1.16: Sơ đồ tổng hợp theo phƣơng pháp Piccionello cộng 17 Hình 1.17: Sơ đồ tổng hợp theo phƣơng pháp Roberto M R cộng Hình 1.18: Sơ đồ tổng hợp linezolid luận văn 17 18 Hình 1.19: Phản ứng Gabriel 19 Hình 1.20: Các sản phẩm trung gian phản ứng thủy phân Nalkylphthalimid với hydrazin 21 Hình 1.21: Pyridin nhƣ chất xúc tác phản ứng tổng hợp amid 27 Hình 3.1: Sơ đồ tổng hợp (S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2oxo-5-oxazolidinyl methyl phthalimid (28) 32 Hình 3.2: Sơ đồ tổng hợp (S)-5(amino methyl)-3-(3-fluoro-4morpholinophenyl)oxazolidin-2-on (17) 36 Hình 3.3: Sơ đồ phản ứng tổng hợp linezolid (1) 57 Hình 4.1: Phổ khối ESI-MS chất 28 58 Hình 4.2: Phổ khối ESI-MS chất 17 58 Hình 4.3: Phổ khối ESI-MS linezolid (1) 60 Hình 4.4: Phổ 1H-NMR chất 28 61 Hình 4.5: Phổ 1H-NMR chất 17 61 Hình 4.7: Phổ 1H-NMR chất 62 13 Hình 4.8: Phổ C-NMR chất 28 63 Hình 4.9: Phổ 13C-NMR chất 17 63 Hình 4.10: Phổ 13C-NMR chất 64 Hình 4.11: Phổ HMBC chất 17 65 Hình 4.12: Phổ HMBC linezolid DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Bảng 1.1: Tổng kết điều kiện phản ứng chuyển chất 26 thành chất 28 Bảng 1.2: Tổng kết điều kiện phản ứng chuyển chất 28 thành chất 17 Bảng 1.3: Tổng kết điều kiện phản ứng chuyển chất 17 thành chất Bảng 3.1: Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ tới hiệu suất phản ứng tổng hợp chất 28 Bảng 3.2: Khảo sát ảnh hƣởng dung môi đến hiệu suất phản ứng tổng hợp chất 28 Bảng 3.3: Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ mol chất tới hiệu suất phản ứng tổng hợp chất 28 Bảng 3.4: Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ tới hiệu suất phản ứng tổng hợp chất 17 Bảng 3.5: Khảo sát ảnh hƣởng dung môi đến hiệu suất phản ứng tổng hợp chất 17 Bảng 3.6: Kết khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ mol tới hiệu suất tổng hợp chất 17 Bảng 3.7: Kết tổng hợp linezolid acetyl clorid s dụng base khác Bảng 3.8: Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng tổng hợp linezolid Bảng 3.9: Khảo sát ảnh hƣởng dung môi đến hiệu suất phản ứng tổng hợp linezolid Bảng 3.10: Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ mol chất tới hiệu suất tổng hợp linezolid Bảng 3.11: Kết tinh chế linezolid Bảng 3.12: Nhiệt độ nóng chảy linezolid chất trung gian Bảng 3.13: Số liệu phổ IR chất 28, 17 Bảng 3.14: Kết đo phổ MS chất 28, 17 Bảng 3.15: Kết phân tích số liệu phổ 1H-NMR Bảng 3.16: Kết phân tích phổ 13C-NMR Số trang 20 20 21 29 30 31 33 34 35 38 39 39 40 42 43 44 44 45 46 Phụ lục 8.: Phổ 13 C-NMR Linezolid Phụ lục 9: Phổ MS (S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl phthalimid (28) Phụ lục 10: Phổ MS (S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl amin (17) Phụ lục 11: Phổ MS linezolid (1) Phụ lục 12: Phổ IR (S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl phthalimid (28) 100 95 90 85 2950.7cm-1 80 2860cm-1 75 1384.96cm-1 2818.7cm-1 %T 70 713.53cm -1 1450.27cm -1 65 1006.68cm-1 843.37cm-1 60 723.71cm-1 1114.83cm-1 55 50 943.55cm-1 1517.28cm-1 45 1407.69cm-1 1738.47cm -1 40 1237.53cm-1 1312.63cm-1 35 1713.99cm-1 30 27 4000 3500 3000 2500 2000 cm-1 1500 1000 500450 100 90 532.03cm-1 80 1384.96cm-1 70 713.53cm -1 %T 1006.68cm-1 1171cm-1 1450.27cm-1 60 843.37cm-1 723.71cm-1 1114.83cm-1 50 40 819.43cm-1 1517.28cm-1 943.55cm-1 1407.69cm-1 1738.47cm -1 1237.53cm-1 1312.63cm-1 1713.99cm-1 30 20 18 2229 2000 1500 1000 500 184 cm-1 Sample Name Description Saved or unsaved State LZ Sample 004 By Administrator Date Friday, March 17 2017 Saved Spectrum quality check summary The Quality Checks not report any warnings for the sample Phụ lục 13: Phổ IR (S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl amin (17) 101 100 98 96 3581.5cm-1 663.93cm-1 94 3383.6cm-1 2959cm-1 3346.5cm-1 92 606.81cm-1 1332.74cm-1 2901.2cm-1 %T 752.53cm-1 1256.56cm-1 90 1051.9cm-1 2843.5cm-1 894.29cm-1 1194.26cm-1 88 799.95cm-1 938.47cm-1 1175.99cm-1 86 84 873.60cm-1 1273.32cm-1 1733.93cm-1 1520.14cm-1 82 80 79 4000 1425.47cm-1 3500 3000 2500 2000 cm-1 1500 1233.08cm-1 1113.27cm-1 1000 500450 100 98 96 606.81cm-1 663.93cm-1 94 92 1332.74cm-1 90 1256.56cm-1 %T 752.53cm-1 1051.9cm-1 894.29cm-1 1194.26cm-1 88 799.95cm-1 938.47cm-1 1175.99cm-1 86 84 1733.93cm-1 1520.14cm-1 82 1425.47cm-1 873.60cm-1 1273.32cm-1 1233.08cm-1 1113.27cm-1 80 78 78 2167 2000 1500 1000 500 110 cm-1 Sample Name Description Saved or unsaved State Lz Sample 005 By Administrator Date Friday, March 17 2017 Saved Spectrum quality check summary The Quality Checks not report any warnings for the sample Phụ lục 14: Phổ IR linezolid (1) 100 98 96 94 2979.5cm-1 92 %T 1474.41cm-1 90 851.01cm-1 88 86 84 1077.58cm-1 1536.71cm-1 2855.8cm-1 1445.15cm -1 1328.70cm-1 1115.42cm-1 3363.02cm-1 1747.69cm-1 1410.00cm-1 1220.25cm-1 1144.14cm-1 82 80 79 4000 1675.05cm-1 3500 3000 2500 2000 cm-1 1516.49cm-1 1500 1236.75cm-1 1000 500450 100 98 493.58cm-1 96 592.34cm-1 94 681.46cm-1 92 1474.41cm-1 %T 90 851.01cm-1 1536.71cm-1 88 1077.58cm-1 907.89cm-1 86 1328.70cm-1 84 1115.42cm-1 1220.25cm-1 1747.69cm-1 1410.00cm-1 82 1144.14cm-1 1445.15cm-1 80 1675.05cm -1 1236.75cm-1 1276.4cm-1 1516.49cm-1 78 76 2258 2000 1500 1000 500 184 cm-1 Sample Name Description Saved or unsaved State Lz Sample 001 By Administrator Date Friday, March 17 2017 Saved Spectrum quality check summary The Quality Checks not report any warnings for the sample HỒ SƠ KIỂM NGHIỆM I THÔNG TIN CHUNG Tên mẫu kiểm nghiệm: Nguyên liệu Linezolid Ngày tiến hành: 21/03/2017 II THÔNG TIN KIỂM NGHIỆM/ANALYTICAL INFORMATION: Dạng bào chế: Nguyên liệu Tổng số phép th thực hiện/Total of performed tests: TÊN PHÉP THỬ: Định lƣợng: Phƣơng pháp HPLC 1.1 Thiết bị - Hóa chất, dung môi – Chất chu n * Thiết bị Mã thiết bị Hạn hiệu chuẩn - Cân phân tích Mettler MS105 VKN/VL/01.11 11/2017 - Máy HPLC Shimadzu LC 20A VKN/VL/06.26 02/2018 - Cân kỹ thuật VKN/VL/02.06 09/2017 * Hóa chất, dung môi Hãng - Amoni dihydrophosphat Prolabo 13A310014 04/2017 - Methanol Merck I811107 601 31/12/2018 Số lô Hạn sử dụng * Chất chuẩn - Linezolid: hàm lƣợng 99,0 % nguyên trạng, Lot: C10058233 1.2 Phƣơng pháp thử * Điều kiện sắc ký: - Cột : Phenomenex Rp18 (5 µm, 150 mm x 4,6 mm) - Pha động: Dung dịch đệm - Methanol (75 : 25) (Dung dịch đệm : Hòa tan 0,23 g amoni dihydrophosphat 1000 ml nƣớc) - Tốc độ dòng: 2,0 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 µl - Detector: 251 nm - Nhiệt độ cột: 50 oC * Chuẩn bị mẫu: - Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 12,5 mg chuẩn Linezolid vào bình định mức 25 ml, thêm ml methanol, siêu âm đến tan hoàn toàn, thêm dung dịch đệm vừa đủ, lắc Hút 2,0 ml dung dịch pha loãng với pha động vừa đủ 20,0 ml - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 50,0 mg nguyên liệu Linezolid vào bình định mức 100 ml, thêm 25 ml methanol, siêu âm đến tan hoàn toàn, thêm dung dịch đệm vừa đủ, lắc Hút 2,0 ml dung dịch pha loãng với pha động vừa đủ 20,0 ml Tiêm dung dịch vào hệ thống sắc ký * Kết mc1 (mg) Sc1 mc2 (mg) Sc2 13,55 1620100 13,56 1616303 1629650 1613843 1624087 1616778 1627043 1629752 1627179 Trung bình 1626302 1615641 RSD % 0,23 0,10 Hệ số đáp ứng = Sc1/Sc2 * mc2/mc1 = 1,01 X% ( nguyên trạng ) = S t mc  99,0 100  10   Sc mt 25  10 mc (mg) Sc mt (mg) St X% (nguyên trạng) 13,55 1626302 49,60 1484728 98,76 13,55 1626302 52,46 1561691 98,22 13,55 1626302 51,94 1541782 97,94 TB 98,31 RSD % 0,43 Năng suất quay cực - Yêu cầu: - o đên -14 o 20 oC 2.1 Thiết bị - Hóa chất, dung môi * Thiết bị Mã thiết bị Hạn hiệu chuẩn - Cân phân tích Mettler MS105 VKN/VL/01.11 11/2017 - Máy đo suất quay cực SH VKN/VL/20.02 02/2018 * Hóa chất, dung môi Hãng - Cloroform Prolabo Số lô 15F110505 Hạn sử dụng 04/2018 2.2 Phƣơng pháp thử * Chuẩn bị mẫu: - Dung dịch mẫu th : Cân 0,4618 g chế phẩm 50 ml cloroform, siêu âm phút * Tiến hành: - Đo suất quay cực dung dịch mẫu th 20 oC, mẫu trắng cloroform - Cóng đo có chiều dài l = dm * Kết quả: [α]20D =  l C  100 αtrắng α th α -0.002 -0.092 -0.090 -0.002 -0.092 -0.090 -0.002 -0.092 -0.090 -0.002 -0.093 -0.091 -0.002 -0.093 -0.091 -0.002 -0.093 -0.091 -0.002 -0.092 -0.090 -0.002 -0.092 -0.090 αtb = -0,02 αtb = -0,092 αtb = -0,090 C %= [α]20D = 0,4618  0,9831 50  l C x100 =  100 = 0.9080  0,090 0,9080   100 = - 9.9 o ... việc nghiên cứu tìm qui trình tổng hợp thuốc kháng sinh đạt hiệu cao, giảm giá thành thuốc xa chủ động đƣợc nguồn nguyên liệu nƣớc, hƣớng hợp lý Luận văn Nghiên cứu tổng hợp thuốc kháng sinh linezolid. .. Nghiên cứu tổng hợp thuốc kháng sinh linezolid quy mô phòng thí nghiệm đƣợc thực với mục tiêu sau: Tổng hợp đƣợc kháng sinh linezolid quy mô phòng thí nghiệm từ (5R)-5(cloromethyl)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-oxazolidin-2-on... DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ LUÂN NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP THUỐC KHÁNG SINH LINEZOLID Ở QUY MÔ PHÕNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời