Tiến hành chiết kháng sinh trong dịch lọc sau khi lên men bằng các dung môi; butylacetat, cIoroform, n~ butanol, diclomethan tại các pH 3,7,10. Đánh giá hoạt tính kháng sinh của pha đung môi hữu cơ bằng phưcmg pháp khoanh giấy lọc, pha nước bằng phưcíng pháp giếng thạch kết quả được trình bày ở bảng 9:
Bảng 9: Kết quả chiết kháng sinh với các dung môi khác nhau:
Dung môi Tham B.pumiỉus
số pH3 pH7 pHlO DMHC N DMHC N DMHC N n-Butanol D 20,90 11,97 25,11 0 23,53 0 s 0,37 0,12 -OilS:?: 0 0,36 0 Butylacetat D 18,50 20,35 21,20 15,81 22,04 10,60 s 0,78 0,93 1,01 0,43 1,10 0,72 chloroform D 15,44 19,51 16,14 17,23 20,13 17,30 s 1,32 0,80 0,14 0,63 0,94 0,16 Diclomethan D 16,21 17,50 15,50 20,76 17,43 19,01 s 1,52 0,68 0,25 1,04 0,58 0,28 Nhân xét:
Qua bảng trên cho thấy các dung môi cloroform, butylacetat, diclomethan có thể chiết được kháng sinh từ dịch lọc nhưng hiệu suất chiết không caọ Riêng chỉ có n-butanol chiết được hoàn toàn kháng sinh ở pH 7,10 nhưng chiết tốt nhất ở pH 7. Vậy ta chọn dung môi n-butanol ở pH7 để chiết kháng sinh.
2.3.9. Kết quả sắc ký lớp mỏng.
- Sau khi chiết kháng sinh từ dịch lên men(^sarigMung môi n-butanol ở pH = 7. Sử dụng dịch chiết này để chấm sắc ký lớp mỏng. Tiến hành sắc ký trên 5 hệ dung môi khác nhau để xác định thành phần kháng sinh và làm cơ sở cho tinh chế sau nàỵ Kết quả sắc ký được giải thích ờ bảng 10 và hình 7(phụ
lục)
- Các hệ dung môi:
Hệ 1: chloroform: metanol; NH4OH 25% = 2:2:1. Hệ 2: n-butanol: etanol: dimetyl formamid =3:1:1. Hệ 3: butylacetat: aceton: trietylamin = 1:2:1. Hệ 4: diclomethan: propanol = 2:3.
Hệ 5: dimetyl formamid: diclomethan = 1:2.
Bảng 10: Kết quả sắc ký lớp mỏng.
Hệ dung môi Rf
uv vsv Hiện màu thuốc
thử 1 - 0,91 - 2 - 0 - 0,93 - 3 - 0,85 - 4 - 0 - 0,89 - 5 - 0,96 - Nhàn xét:
- Kết quả hiện hình kháng sinh bằng vi sinh vật cho thấy có ít nhất hai thành phần kháng sinh trong dịch lên men.
- Các thành phần kháng sinh không hiện màu dưới ánh sáng u v và không có phản ứng màu với thuốc thử Ninhydrin.
2.3,10, Nghiên cứu một số tính chất của dịch kháng sinh thò,
*) Ảnh hưởng của pH đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc.
Điểu chỉnh pH dịch lọc về các pH 3,5,7,9,11, thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch sau 1,5,7 ngàỵ Kết quả được trình bày ở bảng 11:
Bảng 11: Kết quả ảnh hưỏng của pH đến độ ổn định của hoạt tính kháng sình.
pH Tham số B,pumilus
Sau 1 ngày Sau 5 ngày Sau 7 ngày
3 D 20,88 19,49 17,63 s 0,35 0,65 0,34 5 D 19,30 18,59 16,51 s 0,36 0,68 0,81 7 : mi21 L,83-. I I 21,46 ^ 21'38 .. 11-^ : ề Ễ - m , . : \ Ế * '*# 63" ■ lí 0,30 9 D 22,60 21,58 19,83 s 0,76 0,69 0,67 11 5 22,85 21,13 20,26 s 0,57 0,92 0,29 Nhân xét:
- Kháng sinh do chủng Streptomyces 46.336 tổng hợp tưcỉng đối bền
vững trong một khoảng pH rộng.
- Tại pH = 7 kháng sinh bền vững nhất, do đó bảo quản dịch lên men ở pH = 7 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theọ
^)Độ ổn định của hoạt tính kháng sinh trong dịch lọc theo thỉri gian.
Dịch lọc được bảo quản ở pH=7, 2°c sau 1 thời gian đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phưcfng pháp giếng thạch. Kết quả được giới thiệu ở bảng 12:
Bảng 12:Hoạt tính kháng sinh của dịch lọc theo thời gian.
Thời gian B.pumỉlus
D
Sau 1 ngày 21,75 0,75
Sau 70 ngày 20,13 0.41
Nhân xét: Theo thời gian hoạt tính kháng sinh của dịch lọc khá bền vững. Như vậy có thể bảo quản dịch lọc ở pH=7 trong tủ lạnh lâu dài để tiến hành các nghiên cứu tiếp theọ
’^)Độ ổn định của hoạt tính kháng sinh trong dịch chiết bằng dung môi hữu cơ theo thời gian.
Dịch chiết n-butanol pH=7 được bảo quản trong tủ lạnh. Sau một thời gian thử hoạt tính kháng sinh bằng phưcfng pháp khoanh giấy lọc.Kết quả được giới thiệu ở bảng 13:
Bảng 13:Hoạt tính kháng sinh của dịch chiết n-butanoỉ theo thời gian.
Thơi gian B.pumỉlus
D s
Sau 1 ngày 25,04 0,36
Sau 10 ngày 23,17 0,21
Nhản xét:
Sau 10 ngày hoạt tính kháng sinh trong dịch chiết n-butanol vẫn khá ổn định. Tuy nhiên không thể bảo quản dịch chiết kháng sinh bằng n-butanol ở
pH=7 trong một thời gian quá dài mà phải sử dụng luôn cho các nghiên cứu tiế p .
*)Độ bền của kháng sinh với nhiệt.
Dịch lên men sau khi lọc bỏ sinh khối đem đun sôi trực tiếp 10 phút và đun cách thuỷ 30 phút, rồi để nguội và đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phưcmg pháp giếng thạch .Kết quả được giới thiệu ở bảng 14:
Bảng 14:Độ bền của kháng sinh vói nhiệt.
Thòi gian đun B.pumỉlus
D s
Không đun 23,86 0,28
10 phút 22,97 0,51
30 phút 23,35 0,49
Nhán xét:
Qua bảng trên cho thấy kháng sinh do chủng Streptomyces 46.336 sinh
3.1. Kết luận.
Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm chúng tôi đã hoàn thành được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả sau:
- Chủng Streptomyces 46,336 có các đặc điểm giống như Streptomyces lusitanus. Do đó về cơ bản có thể kết luận tên khoa học của Streptomyces
46.336 la Streptomyces lusitanus.
- Sau cải tạo giống bằng phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến
bằng ánh sáng u v , chúng tôi đã chọn được một số biến chủng có hoạt tính
kháng sinh cao hơn chủng gốc.
- Trong số các dung môi đã khảo sát, dung môi chiết được hoàn toàn kháng sinh do Streptomyces 46.336 sinh tổng hợp là n - butanol ở pH 7.
- Sau khi tiến hành tách kháng sinh từ dịch lên men bằng sắc ký lớp mỏng với 5 hệ dung môi khác nhau, sơ bộ kết luận có ít nhất hai thành phần kháng sinh có hoạt tính.
- Kháng sinh đo chủng Streptomyces 46.336 sinh tổng hợp có một số
đặc điểm sau:
+ Là kháng sinh có phổ tác dụng khá rộng.
+ Tương đối bền vững trong khoảng pH rộng và kháng sinh ổn định nhất ở pH=7
+ Khá bền với nhiệt độ và thời gian bảo quản.
3.2. Đề x u ấ t.
- Tiếp tục nghiên cứu các điều kịên về đột biến và điều kiện lên men tối ưu để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cần đi sâu nghiên cứu các phương pháp thích hợp để chiết tách và tinh chế các thành phần kháng sinh và xác định cấu trúc hoá học của các thành phần đó.
- Có thể tiến hành thử tác dụng dược lý và độc tính của kháng sinh nếu
TẢĨ LIẺU THAM KHẢỌ
1. Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình v s v học công nghiệp, NXB khoa học và kỹ thuật, tr.167-186.
2. Kiều Khắc Đôn, Nguyễn Lệ Phi (2001), Vi sinh học, Trường Đại Học Dược
Hà Nộị
3. Nguyễn Hữu Hồng(1993),Bàỉ’ giảng vỉ sinh vật học công nghiệp, NXB
Khoa học-Kỹ thuật, tr.26-33.
4. Từ Minh Koóng(2004^, Cơ sở công nghệ sinh học và sản xuất dược phẩm,
NXB Y Học.
5. Từ Minh Koóng(chủ biên) (2001),^ỹ thuật sản xuất dược phẩm, Trường
Đại Học Dược Hà Nội, Tr. 142-193.
6. Lê Xuân Phương (2001), Vi sình vật công nghiệp, NXB Xây Dựng, tr.67-
278.
7. Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Khoa hoc-kỹ thuật, tr.9-
49.
8. Cao Văn Thu (1998), Bài giảng vê kháng sinh và vitamin, Trường Đại Học
Dược Hà Nộị
9. Trịnh Thị Phương Dung (2005),’Wg/ỉỉ‘ên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 2 ớ .i/2 ”.Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ 2000-2005.
10 .Trần Tích(chủ biên) (1998), Thực Tập hoá phân tích, Trường Đại Học
Dược Hà Nội, tr.65-74.
11. Lưcfng Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp,Tr.94-
118.
12. Hồ Viết Quí (2000), Chiết tách, phân chia xác định các chất hằng dung môi hữu cơ, NXB Khoa học Kỹ thuật, T l, Tr.9-56.
13.ẸB,Shirling and D,Gottlieb(1972), Type Strain o f Streptomyces, Int.
14. Mai Tất TỐ (chủ biên), Dược Lý Học tập // f20ỡ4),Trường Đại Học Dược
Hà Nội, Tr.l 12-162.
15. Hee Park, Jung Lee, In Hwang, Bong Yun, Beom Kim, Byung Hwang,
Isolation and antifungal and antinomycete activities o f Staurosporine from Streptomyces roseoflavus strain LS-A24, J Ind Microbiol Biotechnol. 2006
Apr 12::i PubmedỊ rscholarl [Select! IHideỊ
16. Đỗ Thu Hà.” Động học của quá trĩnh lên men sinh tổng hợp các chất kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn QN - 29 và ĐN - 110 phân lập từ đất khu vực Quảng Nơm - Đà Nẵng'\ Trường Đại Học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng.
http://www.kid.edụvnA)ankh/zipfiles/dt - hạ
17. Nguyễn Đại Nam (2005). “Gỡp phấn nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh
PHỤ LỤC
/
Hình 2 :Bề mặt bào tử (Độ phóng đại 15 000 lần).
Hình 4 ;Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau sàng lọc ngẫu nhiên. (VSV kiểm định ìkịểaẽciỊứs pumilus)
Hình 5 :Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của dịch lọc sau khi lên men chìm(VSV kiểm định pumilus).
Hình 6 :Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau khi chiết kháng sinh bằng dung mối hữu cơ(VSV kiểm định \à(B accư^pum ilus).