* Nguyên tắc: Mẫu thử được đưa vào môi trường thạch trong hộp petri đã cấy vi sinh vật kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử khuy ếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành các vòng vô khuẩn có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ kháng sinh tưcmg ứng.
* Tiến hành:
- Chuẩn bị giống vi sinh vật kiểm định:
Vi sinh vật kiểm định được cấy vào môi trường canh thang (đối với vi khuẩn), môi trường Sabouraud (đối với nấm men) và dung dịch Tween 80 0,5% (đối với nấm mốc). Nuôi cấy ở 37®c (đối với vi khuẩn), 28 - 30^c (đối với Candida albicans) trong 18 - 24giờ.
- Cấy vi sinh vật kiểm định vào môi trường thạch thường:
Môi trường thạch thường được tiệt trùng ở 12l”c/20phút, để nguội tới 45 - 50^C rồi cấy giống vi sinh vật kiểm định vào theo tỷ lệ Vgiống ; Vmôi trường=l :40 lắc đều đổ mẫu thử ra các đĩa petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩạ
- Đưa mẫu thử vào môi trường chứa vi sinh vật kiểm định:
+ Nếu mẫu thử là khối ứiạch chứa kháng sinh: Đặt khối thạch
ệ - 6,0mm lên bề mặt mẫu thử chứa vi sinh vật kiểm định, (phưcíng pháp khối thạch).
+ Nếu mẫu thử là dung dịch (dịch lên men, dịch chiết nước...). Đục tạo các giếng trên môi trường, rồi nhỏ mẫu thử vào (phương pháp giếng thạch).
+ Nếu mẫu thử là dịch chiết kháng sinh ưong dung môi hữu cơ: Dùng khoanh giấy lọc {ệ ^ 6mm ) đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy nhẹ cho khô, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy vi sinh vật kiểm định (phưcmg pháp khoanh giấy lọc).
- Nuôi cấy:
Các đĩa petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37^c (đối với vi khuẩn) trong 18 - 24giờ, trong 24 - 48giờ (đối với vi nấm).
- Đánh giá kết qủa:
Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước k e jrf^ n g fjc ô độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, xử lý theo cồng thức:
Ỳ. Di Ỳ ( D i - D )
D ---
n V n-1
D : Đường kính trung bình vòng vô khuấn,
Dị. Đường kính vòng vô khuẩn thứ i,
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh, n: SỐ thí nghiệm làm song song.
2.2.3. Phưorng pháp cải tạo giống vi sinh vật. a) Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên.
- Pha hỗn dịch bào tử:
Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 46.336 cho vào ống nghiêm chứa lOml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở nồng độ pha loãng 10 ' (định ước), lấy Iml hỗn hợp bào tử này cho vào 9ml nước cất vô trùng thu được nồng độ 10'^, tiếp tục pha loãng đến 10
- Cấy bào tử:
Dùng Pìpet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10'“^ đến 10'^, nhỏ lên bề mặt thạch MT3 trong đĩa petrị Dùng que trang
vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch trên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa petri cho mỗi nồng độ pha loãng. Cho các đĩa vào tủ ấm ủ ở 30°c ư-ong 6 ngàỵ
- Phép chọn lọc ngẫu nhiên:
Sau 6 ngày nuôi cấy, chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển tốt, mọc riêng rẽ, cấy zigzac lên bề mặt MT3 trong đĩa petri, ủ ấm ở 30°c trong 6 ngày rồi lấy ra thử hoạt tính kháng sinh bằng phưcfng pháp khối thạch. Từ đó ỉựa chọn ra 3 - 5 dạng chủng có hoạt tính cao nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theọ
b) Phucfng pháp đột biến bằng ánh sáng ư v .
- Pha hỗn dịch bào tử:
Pha tương tự như phưcmg pháp chọn lọc ngẫu nhiên, sau đó lấy Iml hỗn dịch bào tử 10 * pha loãng đến nồng độ 10'^ làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa petri vô trùng.
- Đột biến dưới tác dụng cùa ánh sáng u v :
Đĩa petri chứa 9ml hỗn dịch bào tử được đem chiếu ánh sáng u v với khoảng cách và thời gian thích hợp (khoảng cách 60 cm, thời gian chiếu là 5 phút) sau đó lấy ra để chỗ tối 2giờ rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ ì ơ \
- Cấy bào tử sau đột biến:
Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml mẫu chứng nồng độ 10'^ và 0,1 ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở các nồng độ 10'^, cho vào các đĩa petri có chứa MT3. Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch. Mỗi độ pha loãng chia làm 3 đĩạ Nuôi cấy ở 30®c trong 6 ngàỵ
Sau 6 ngày nuôi cấy, đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo
cồng thức:
%sống sót = = a :100
No Nm: SỐ khuẩn lạc phát triển sau đột biến.
No; Số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
- Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau đột biến tưcmg tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên.
- Làm song song với 1 mẫu chứng.
- % biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:
%biến đổi hoạt tính = =xlOO
Do
Trong đó: D i: Là đường kính vòng vô khuẩn trung bình của biến chủng thứ ị
Do: Là đường kính vòng vồ khuẩn trung bình của mâu chứng.
Dựa vào kết quả thu được lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theọ
2.2.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp.
- Chủng Streptomyces 46.336 sau khi phân lập được cấy trên các môi
trường dinh dưõíng khác nhau để xác định môi trường nuôi cấy thích hợp nhất. - Các môi trường 1,2,3,4,5,6,7 sau khi pha chế được hấp tiệt trùng ở lll^^c/iophút rồi đổ ra các đĩa petri vô trùng ( 20ml/đĩa ).
- Cấy zigzac một vòng que cấy bào tử Streptomyces 46.336 lên bề mặt thạch của các môi trường trên, ủ ở 30®c trong 6 ngàỵ
- Thử hoạt tính kháng sinh bằng phưcỉng pháp khối thạch. Mỗi môi trường làm 3 mẫu song song.
2.2.5. Phương pháp lựa chọn mồi trường lên men tốt nhất. - Tạo giống cấp I:
Chủng giống Streptomyces 46.336 sau khi nuôi cấy trên thạch nghiêng (MT3) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa lOOml MT3đ bằng lOml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 30±0,l°C,tốc độ quay 145-150 vòng/phút trong 48 giờ.
- Lên men:
Sau 48giờ nhân giống, giống cấp I được cấy vào các bình nón 500ml chứa lOOml các môi trường lên men khác nhau để chọn môi trường lên men tốt nhất với tỷ lệ: Vgiống : V môi trường lên men = 1; 10. Các bình lên men lắc ở 30 ± 0,1” c , tốc độ quay 145-150 vòng/ phút.
2.2.6. Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ.
* Mục đích: Xác định dung môi và pH chiết tối ưụ * Tiến hành; ở đây ta dùng phương pháp chiết 1 lần.
- Dịch lọc được điều chỉnh về các pH 3,7,10 bằng dung dịch NaOH 20% và HCl IM.
- Chiết dịch lọc đã điều chỉnh pH với các dung môi khác nhau: + Dịch lọc và dung môi được cho vào bình gạn theo tỷ lệ:
Vdung m ô i; Vdịch lọc = 1:5
+ Lắc vài lần, để phân lớp trong 1 - 2giờ. + Gạn riêng lớp dung môi và lớp dịch lọc.
- Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của lớp dung môi và lớp dịch lọc sau mỗi lần chiết bằng phưcíng pháp khoanh giấy lọc và phưcíng pháp giếng thạch.
2.2.7. Phương pháp xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lén men.
* Ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh:
- Mục đích: Xác định mức độ ảnh hưởng của các pH khác nhau lên độ bền vững của kháng sinh từ đó có thể biết được pH có thể tiến hành bảo quản kháng sinh.
- Tiến hành: Dùng pipet cho vào 5 ống nghiệm mỗi ống 5ml dịch lọc, chỉnh pH trong các ống tương ứng là 3,5,7,9,11 bằng dung dịch NaOH IN và HCl IN để vào tủ lạnh. Sau 1 ngày chỉnh lại pH trong các ống nghiệm về pH trung tính rồi đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phưcfng pháp giếng thạch.
Tiếp tục xác định ảnh hưởng của pH sau 5 ngày,7 ngày tưcfng tự như trên.
* Thòi gian bảo quản kháng sinh;
- Mục đích: Xác định độ bền vững của kháng sinh sau thời gian bảo quản, đây là tiêu chí rất quan trọng của kháng sinh.
- Tiến hành: Dịch lọc và dịch chiết kháng sinh được bảo quản ở pH thích hợp trong tủ lạnh sau 1 thời gian được lấy ra thử hoạt tính kháng sinh bằng phưcmg pháp giếng thạch và phưcmg pháp khoanh giấy lọc.
2.2.8. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM).
- Bản mỏng sắc ký được cắt cho có kích thước phù hợp, đem hoạt hoá ở 110®c/ 30phút. Dung môi được pha theo đúng tỷ lệ cho vào bình sắc ký (chiều dày lớp dung môi không quá Icm). Dùng mao quản đường kính 0,5mm chấm dịch chiết có chứa hoạt chất cần sắc ký lên bản mỏng 10 - 20 lần, để khô tự nhiên sau mỗi lần chấm hay cho vào tủ sấy ở nhiệt độ < 50°c. Đặt bản mỏng vào bình sắc ký theo qui định cho dung môi chạy 3/4 bản mỏng, lấy ra đánh dấu vết dung môi chạy và sấy nhẹ cho khô.
- Xác định vết bằng các phưcỉng pháp. + Soi đèn tử ngoại:
Bản mỏng sắc ký đã được trộn với chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoạị Khi soi đèn tử ngoại, vết chất thử sẽ có mẩu sẫm trên đèn huỳnh quang sáng.
+ Phưcỉng pháp hiện hình v s v :
Đặt bản mỏng sắc ký vào đĩa petri vô trùng, đổ môi trường thạch thường tiệt trùng đã có vi sinh vật kiểm định vào, ủ ấm ở nhiệt độ 37“c trong
18 - 24giờ. Vòng vô khuẩn xuất hiện nếu có kháng sinh. + Phát hiện bằng thuốc thử hiện màu:
Phun thuốc thử hiện màu lên bản mỏng, sấy khô ở 60°c/10phút để phát hiện vết.
+ TínhRf: Rf=
Dv : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết. Ddm : Khoảng cách dung môi chạỵ
2.2.9. Phương pháp phân loạ/ Streptomyces 46,336 theo ISP,
* Xác định đặc điểm hình thái và sác tô hoà tan:
- Cấy bào tử Streptomyces 46.336 đã đủ số ngày tuổi ( 6 - 1 0 ngày) trên bề mặt thạch nghiêng của các môi trường ISPl, ISP3, ISP4, ISP5 đã hấp tiệt trùng, ủ à 30°c. Quan sát màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất sau
7,14,21 ngàỵ
* Các đặc điểm cần chú ý:
Khi quan sát màu của khuẩn ty khí sinh ta có thể gặp các màu: Trắng (W), Xám (Gy), Vàng (Y)...Nếu màu không xác định ký hiệu X, màu rơi vào khoảng giữa hai màu thì ghi ký hiệu của cả hai màu (ví dụ: WGy).
Đối với khuẩn ty cơ chất: Nếu xuất hiện màu thì ký hiệu là 1, ngược lại ký hiệu là 0.
Sắc tố hoà tan: Nằm ngay trong môi trường có màu đỏ, vàng, xanh lá cây, xanh da trời, nâu, tím. Nếu có ký hiệu 1, ngược lại ký hiệu 0.
* Phương pháp xác định sắc tố melanoid:
- Cấy chủng Streptomyces 46.336 lên bề mặt thạch nghiêng các môi
trường ISP6, ISP7, ủ b 30®c cho phát triển.
- Quan sát ở ngày thứ 2 và ngày thứ 4. Nếu có ký hiệu 1, ngược lại ký hiệu 0.
^ Phương pháp xác định hình dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử.
- Chủng Streptomyces 46.336 từ 10 - 16 ngày tuổi đem xác định hình
dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử nhờ kính hiển vi điện tử có độ phóng đại từ 10000 - 300001ần.
- Dạng chuỗi bào tử: Thẳng (R), uốn cong (RF), móc câu (RA), xoắn (S), nếu chuỗi bào tử có nhiều đặc điểm thì ghi đầy đủ (ví dụ: SRA).
- Bề mặt bào tử có các dạng sau; Phẳng nhẩn (sm), gai (sp), mụn cơm (wa), tóc (ha).
* Phương pháp xác định khả năng tièu thụ nguồn Carbon.
- Nuôi cấy bào tử trên các môi trường chứa các nguồn carbon khác nhau (ISP9), với chứng âm chỉ có ISP9 (không có đường), chứng dưcỉng là glucose, ủ ở
- Sau 1 0 - 1 6 ngày thì đem ra đánh giá kết quả. Nếu ở nguồn đường nào mà bào tử phát triển mạnh hơn hoặc tucfng đưcfng ống chứng dương thì ký hiệu (+), còn nếu chủng không phát triển hoặc phát triển yếu hơn so với chứng âm thì ký hiệu (-), nếu chủng phát triển yếu hơn đáng kể so vctì chúng dương nhưng phát triển mạnh hơn chứng âm thì đánh dấu ( ± )
2.3. KẾT QỦA THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT.
2.3.1. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 46.336
trên môi trường phân lập (MT3).
Hoạt tính của kháng sinh do chủng Streptomyces 46.336 sinh tổng hợp
trên MT3 được thử trên một sổ vi sinh vật kiểm định, kết quả được trình bày ở bảng 2 :
Bảng 2: Kết quả thử tác dụng của kháng sinh do
Streptomyces 46.336 gốc sinh tổng hợp với các vi sinh vật kiểm định.
v s v kiểm định G(+) D(mm) v s v kiểm định G(-) D(mm) B.cere us 20,09 Ẹcoli 21,56 B.puminus 22,64 p.mirabiỉis 21,47 B.subtiỉis 20,58 p .aeruginosa 0 s.lutea 19,98 s.typhi 19,68 s.aureus 21,23 s.flexneri 22,75
Nhân xét: Như vâv, kháne sinh c0 xạ khuẩn Streptomyces 46.336 sinh
tổng hợp có phổ tác dụng khá rộng trên cả vi khuẩn G(+) và vi khuẩn G(-). Do đó chúng tôi quyết định chọn chủng Streptomyces 46.336 để tiến hành các
2.3.2. Kết quả phân loại theo ISP.
- Tiến hành các thực nghiêm để phân loại xạ khuẩn Streptomyces
46.336 theo ISP, đối chiếu với các đặc điểm phân loại của xạ khuẩn
Streptomyces lusỉtanus, kết quả giới thiêu ở bảng 3.
- Đã quan sát và chụp ảnh hình thái xạ khuẩn Streptomyces 46.336
dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 12 000 và 15 000 lần, kết quả giới thiệu ở hình 2,3 (phần phụ lục).
Bảng 3: So sánh đặc điểm của
Streptomyces 46.336 với Streptomyces lusitanus.
Xạ khuẩn
Đặc trưng Streptomyces 46.336 Streptomyces lusitanus Màu khuẩn ty khí sinh Xám trắng(WGy) Xám trắng(WGỵ)
Màu khuẩn ty cơ chất 0 0
Sắc tố melanoid 0 0
Sắc tố hoà tan 0 0
Chuỗi bào tử s(xoắn) s(xoắn)
Bề mặt bào tử sm (nhẩn) sm (nhẵn) L-arabinose + + D-Xylose + + Inositol + + Manitol + + Fructose + + Rhamnose + + Sacarose + + Raffinose - - Nhân xétĩ
Như vây về cơ bản kết luận chủng Streptomyces 46.336 có tên khoa học là; Sĩrepíomỵces lusitanus.
2.3.3, Lựa chọn môi trường nuôi cấy và các vi sinh vật kiểm định của Ị[ chủng Streptotnyces 46.336.
Kết quả khảo sát để lựa chọn môi trường nuôi cấy được giới thiệu ở bảng 4.
Bảng 4: Hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 46.336 trén 7 loại môi trường và 10 vi sinh vật kiểm định.
Vi khuẩn TS M Tl MT2 ' i ® MT4 MT5 MT6 MT7 B.cereus D 14,27 20,14 8,62 12,41 11,81 0 s 1,10 0,27 0,37 1,25 1,63 0 B,puminus 17,98 22,47 16,15 12,56 8,68 %'sS j-i- • ---ÍÍÍẼm ĩ ĩ m Ị'1.,; S R 0,58 0,96 B.subtiỉis D 13,64 18,75 8,29 13,94 8,06 7,83 s 1,07 0,86 0,46 1,66 0,16 0,37 s.ỉutea D 13,55 18,14 9,53 14,63 0 0 s 0,91 0,82 t a t ® 0,84 0,87 0 0 S.aureus D 15,20 20,35 21,12 7,48 14,76 8,56 0 s 0,73 1,10 0,29 , i i ü i 0,52 1,05 0,92 0 Ẹcoli D 13,72 19,56 9,95 14,46 10,53 0 s 0,42 0,98 0,64 1,38 1,01 0 p.mỉrabiỉis D 10,92 19,30 0 13,75 7,94 7,87 s 0,53 1,08 0 0,73 0,24 0,39 p .aeruginosa D 0 0 0 • -ftp.' •• • • 0 0 0 0 s 0 0 0 0 0 0 s.typhi D 16,32 18,63 19,41 0 15,11 11,54 0 s 0,71 0,89 0 1,53 0,76 0 s.flexneri , 21,52 2 ẩ 0 ■ * ^ ... fl3 ,7 7 14,54 8,72 .-HnCh.- WSê 0,Ố5 1,15 . 0,65 0,76
Nhân xét: Từ bâng kết quả trên cho thấy chủng Streptomyces 46.336
phát triển tốt và cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất ưên MT3 sau đó là MT2. Vậy ta chọn MT3 làm môi trường sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 46.336, chọn hai chủng vi sinh vật kiểm định là Baciilus pumilus và Shigeỉla
fiexnerị Vì hai chủng này cho vòng vồ khuẩn to và rõ nét.
2.3.4. Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên.
Giống xạ khuẩn Streptomyces 46.336 được sàng lọc ngẫu nhiên để chọn ra dạng chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất. Thử bằng phưcfng pháp khối thạch, kết quả được giói thiệu ở bảng 5 sau:
BảngS; Kết quả chọn lọc ngẫu nhỉén KH dạng B. pumilus 5. /ỉexnerì chủng D s D s 1 21,73 1,29 22,13 1,01 2 22,68 0,73 22,54 0,57 3 20,61 1,14 21,97 0,86 4 18,73 1,39 19,13 1,85 5 19,29 0,37 20,81 0,85 6 20,39 0,77 22,57 0,30 7 21,56 0,54 22,19 0,95 Ị r " 2 3 ^ " í: . . 0,83 9 21,43 1,04^ 23,07 0,40 10 22,03 0,31 22,96 0,78 I I 22,98 ■ 0:41 Ề t ì m ề ẳ m 0,58 12 21,42 1,28 21,49 1,35