Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13

Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13 Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 13 13

BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI PHẠM THỊ HÀ GÓP PHẦN NGHIÊN cứu SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 13.13 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c sĩ KHOÁ Người hướng dẫn Nơi thực hiện Thời gian thực hiện TS. Cao Văn Thu Phòng Vi sinh - Kháng sinh Bộ môn Công nghiệp Dược 15/02/2004 - 15/05/2004 Hà Nội, tháng 5 năm 2004 í LỜI CẨM Ơ5V Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới: Thầy giáo - TS Cao Văn Thu, người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện khoá luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong toàn trường đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Nhân đây tôi xin cảm ơn cấc thầy cô và các cán bộ kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược - trường Đại học Dược Hà Nội đã mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận này. Tôi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn tới bạn bè và gia đình đã giúp đỡ tôi trong học tập và hoàn thành khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2004 Sinh viên Pham Thi Hà MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ĐẬT VẤN ĐỂ 1 PHÂN I. TỔNG QUAN 2 1.1. Vài nét về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa 2 1.1.2. Đơn vị kháng sinh 2 1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2 1.1.4. Sơ đồ tổng quát sản xuất một kháng sinh 2 1.1.5. Nguồn gốc và phổ tác dụng của một số chất kháng sinh 4 1.2. Đặc điểm của xạ khuẩn 4 1.2.1. Đặc điểm chung 4 1.2.2. Đặc điểm chi Streptomyces 5 1.3. Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ chi Streptomyces 7 1.3.1. Phương pháp giữ giống 7 1.3.2. Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn 7 1.3.3. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8 1.3.4. Chiết, tách sản phẩm sau khi lên men 11 1.4. Một sốthành tựu trong nghiên cứu xạ khuẩn Streptomyces 12 1.4.1. Phân lập kháng sinh kháng nấm có chứa phospho từ 12 Streptomyces kanamyceticus Mg 1.4.2. Quá trình loc kẽm nhờ sinh khối Streptomyces rimosus đã xử lý 12 1.4.3. Ảnh hưởng của giai đoạn tiền lên men trong lên men acid 13 clavulanic PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 14 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 14 2.1.1. Nguyên vật liệu 14 2.1.2. Các phương pháp thực nghiệm 18 2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 25 2.2.1. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 25 13.13 trên môi trường phân lập 1 (MT1) 2.2.2. Kết quả phân loại theo ISP 25 2.2.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy và các v sv kiểm định của 26 chủng Streptomyces 13.13 2.2.4. Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên 28 2.2.5. Kết quả đột biến bằng ánh sáng tử ngoại 29 2.2.6. Kết quả lựa chọn môi trường lên men 30 2.2.7. Lựa chọn biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh 30 cao nhất khi lên men chìm 2.2.8. Ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh 31 2.2.9. Lựa chọn dung môi chiết thích hợp của dịch lên men 32 2.2.10. Lựa chọn biến chủng sau đột biến có khả năng sinh tổng 33 hợp kháng sinh cao nhất trong lên men chìm 2.2.11. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh trong sinh khối 34 2.2.12. Kết quả sắc ký lớp mỏng 34 2.2.13. Thử độ ổn định của kháng sinh trong dịch chiết 35 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 36 3.1. Kết luận 36 3.2. Đề xuất 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT Be Bacillus cereus ATCC 9946 Bp Bacillus pumilus ATCC 10241 Bs Bacillus subtilis ATCC 6633 D (mm) Đường kính vòng vô khuẩn Ec Escherichia coli ATCC 25922 Gy Grey - xám G Gram ha Hairy - tóc rối ISP Chương trình Streptomyces Quốc tế MT Môi trường MTdd Môi trường dung dịch Pro Proteus mirabilis BV 108 Ps Pseudomonas aeruginosa VM 201 RA Rectinaculiaperti - móc câu, một vòng xoắn đơn RAS Rectinaculiapertipirales - xoắn lò so có móc câu s Độ lệch thực nghiệm đã hiệu chỉnh Sal Salmonella typhi DT 220 Shi Shigella flexneri DT 112 SL Sarcina lutea ATCC 9341 Sm Smooth - nhẵn Sp Spiny - gai Sta Staphylococcus aureus ATCC 1228 VK Vi khuẩn v s v Vi sinh vật Wa Warty - sần sùi Y Yellow - vàng ĐẶT VẤN ĐỂ Phần lớn các loại kháng sinh được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng hiện nay đều có nguồn gốc vi sinh vật. Kháng sinh đầu tiên được phát minh là Penicillin sau đó là Streptomycin được xem là thần dược của loài người. Danh sách các kháng sinh cứ kéo dài thêm mãi. Song việc sử dụng kháng sinh chưa hợp lý đã làm xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn kháng kháng sinh và làm cho kháng sinh không còn là thần dược nữa. Cuộc đua tranh giữa các vi sinh vật kháng kháng sinh và ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh đang tiếp diễn với quy mô và tốc độ ngày càng lớn. Song trong giai đoạn phát triển mới của công nghệ vi sinh, con người hoàn toàn có thể cải tạo ra được những vi sinh vật có khả năng sản xuất ra kháng sinh với hiệu suất cao nhất trong đó chi xạ khuẩn Streptomyces sinh kháng sinh chiếm hơn 60% trong số hơn 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới. Và để góp phần vào việc nghiên cứu bước đầu trong công cuộc tìm kháng sinh mới, tại Bộ môn Công nghiệp Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, đã tiến hành phân lập và nghiên cứu một số chủng Streptomyces có trong đất ở Việt Nam. Qua quá trình thực nghiệm chúng tôi lựa chọn khoá luận có tiêu đề "Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 13.13" với các nội dung: - Chọn biến chủng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất bằng chọn lọc ngẫu nhiên và đột biến cải tạo giống. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và sinh lý nhằm phân loại xác định tên khoa học của chủng Streptomyces 13.13. - Nghiên cứu môi trường nuôi cấy, môi trường lên men và điều kiện lên men. - Nghiên cứu quy trình chiết, tách kháng sinh. 1 PHẦN I. TỔNG QUAN 1.1. Vài nét về kháng sinh [2], [6], [9], [10] 1.1.1. Định nghĩa [6], [10] Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh. Song có thể nêu lên một định nghĩa được coi là hoàn chỉnh nhất: Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật trong các nguồn tự nhiên khác nhau có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật ) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp. 1.1.2. Đơn vị kháng sinh [6], [10] Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml (đv/ml) dung dịch hay 1 mg chế phẩm (đv/mg), thường dùng đơn vị (đv) kháng sinh. Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong 1 thể tích môi trường xác định có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định. Mỗi kháng sinh có đơn vị hoạt tính sinh học riêng. 1.1.3. Cơ chê tác dụng của kháng sinh [6], [10] Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất khác nhau của tế bào v s v gây bệnh. Có một số cơ chế chế đã biết khá chi tiết, tuy nhiên trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết chính xác. Ở đây chúng tôi giới thiệu một số cơ chế tác dụng chính: - Tác dụng lên thành tế bào v sv (penicillin, vancomycin). - Tác dụng lên màng nguyên sinh chất (polymicin, amphotericin). - Tác dụng lên quá trình tổng hợp acid nhân (quinolon, rifampicin). - Tác dụng lên quá trình tổng hợp protein (erythromycin, cloramphenicol). - Tác dụng lên quá trình trao đổi chất hô hấp (antimycin, oligomycin). - Tác dụng lên quá trình trao đổi chất trung gian (Co-trimoxazol). 1.1.4. Sơ đồ tổng quát sản xuất một kháng sinh [6], 19], [LO] Quá trình sản xuất kháng sinh được giới thiệu tổng quát trong sơ đồ ở hình 1. 2 Hình 1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh. 1.1.5. Nguồn gốc và phổ tác dụng của một sô chất kháng sinh /2], [10] Bang l : Nguồn gốc và phổ tác dụng của một sô chất kháng sinh Kháng sinh Nguồn gốc Phổ tác dụng Penicillin Penillium chrysogenum VK gram (+) Griseofulvin Penillium griseofulvum Nấm Erythromycin Streptomyces erythreus VK G (+) Clotetracyclin Streptomyces aureofaciens VK G (+) và (-) Neomycin Streptomyces fradiae VK G (+), (-) Kanamycin s. kanamyceticus VK G (-) Gentamicin Micromonospora purpurea VK G (-) Lincomycin Streptomyces lincolnensis VK G (+) Vancomycin Streptomyces orientalis VK G (+) Streptomycin Streptomyces griseus VK G (-) và VK lao 1.2. Đặc điểm của xạ khuẩn (Actinomycetes) [1], [2], [3], [12], [16] 1.2.1. Đặc điểm chung [L], [2], [L2] Xạ khuẩn là một lớp vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Trong mỗi gam đất nói chung thường có trên 1 triệu xạ khuẩn (tính theo số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch). Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí hoặc vi hiếu khí, có cấu tạo dạng sợi (khuẩn ty), phân nhánh, phát triển tốt trong khoảng 26 - 37°c. Các xạ khuẩn phân lớp Actinomycetes có đặc điểm: - Đường kính xạ khuẩn 0,5 - 1,5 Ịim, -Thành tế bào có dạng kết cấu lưới dày 10-20 nm, - Màng tế bào không có cellulose, kitin , dày 7,5-10 nm, - Cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn là bào tử trần, phân chia theo kiểu phân bào vô tính. 4 - Khuẩn lạc: thô ráp, dạng phấn không trong suốt, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ, que cấy không di chuyển được khuẩn lạc. Theo một sô khoá phân loại, có thể phân loại xạ khuẩn theo sơ đồ sau: Hình 2: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn. 1.2.2. Đặc điểm chi Streptomyces [2], [1], [3], [12], [16] • Đặc điểm hình thái: Hệ sợi của xạ khuẩn chi Streptomyces bao gồm khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất. Khuẩn ty cơ chất nằm sâu trong môi trường nuôi cấy thể đặc. Khuẩn ty khí sinh phát triển là đặc điểm đặc trưng chủ yếu của chi Streptomyces và được hình thành theo hai cách: - Khuẩn ty khí sinh sơ cấp bắt đầu phát triển từ các bào tử nảy mầm. - Khuẩn ty khí sinh thứ cấp được phát triển từ một số khuẩn ty cơ chất, một số khuẩn ty cơ chất khác phát triển thành khuẩn ty dinh dưỡng. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh hình thành chuỗi bào tử. Quan sát chuỗi bào tử dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 7500 - 15000 lần, xác định số bào từ tối đa của chuỗi mang bào tử trưởng thành, có thể đơn, đôi, một chuỗi gồm 3-10 bào tử, chuỗi lớn hơn 10-50 bào tử thậm chí 100 bào tử. Trên môi trường nuôi cấy thích hợp chọn đặc điểm đặc trưng nhất và xác định hình dạng chuỗi bào tử: thẳng (R), uốn cong (RF), móc câu (RA), xoắn lò xo (S). Nếu chuỗi bào tử có nhiều đặc điểm thì ghi đầy đủ (ví dụ: xoắn lò xo có móc câu SRA). 5 [...]... Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 13. 13 trên môi trường phân lập 1 (MT1): Chủng Streptomyces 13. 13 được nuôi cấy trên môi trường phân lậpl (MT1) có chứa v s v kiểm định Kết quả được trình bày ở bảng 4 Bảng 4: Hoạt tinh kháng sinh của chủng Streptomyces 13. 13 trên MT1 và một sô vsv kiểm định vsv kiểm định Bc Bp Bs D (mm) 8,43 12,98 8,76 SL Sta Ec Pro 14,14 13, 00 13, 54 13, 96 Ps... bảng 4, quyết định chọn chủng Streptomyces 13. 13 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo 2.2.2 Kết quả phân loại theo ISP: Chủng Streptomyces 13. 13 được nuôi cấy trên các môi trường ISP Các kết quả được trình bày ở bảng 5 và hình 4, 5 (phần phụ lục) 25 Bảng 5: So sánh đặc điểm của Streptomyces 13. 13 với Streptomyces versipellis stt Các đặc điểm phân loại Streptomyces 13. 13 Streptomyces versipellis GyW-xám... định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch Kết quả được trình bày ở bảng 10 30 Bảng 10: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của 3 biến chủng 21,22, 30 sau khi lên men chìm Biến chủng Shi SL ĩ) (111111) s D (111111) s 21 12,80 0,20 13, 01 0,74 22 13, 18 0,70 14,45 0,85 30 13, 30 0,17 13, 26 0,76 Nhận xét: Từ kết quả bảng 10 cho thấy biến chủng 22 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất Trong... versipellis 2.2.3.Lựa chọn m ôi trường nuôi cấy và các vsv kiểm định của chủng Streptom yces 13. 13: Tiến hành thử hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces 13. 13 trên 7 loại MT và 10 vsv kiểm định theo phương pháp đặt khối thạch Kết quả được trình bày ở bảng 6 26 Bảng 6: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces 13. 13 trên 7 loại MT và 10 MT Tham MT1 MT2 vsv kiểm định MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 C h ủ n g... chứa phospho từ Streptomyces kanamyceticus Mg [13] Kanamycin là một kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid được tạo thành từ Streptomyces kanamyceticus Indrani Datta và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu một lượng lớn được tạo ra từ Streptomyces kanamyceticus có khả năng tổng hợp Kanamycin bằng tác động đột biến để tạo ra chủng mới nhằm sản xuất hợp chất kháng sinh mới chống lại Aspergilus niger. Qua quá... 1.3 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ chi Streptomyces [2], [6], [7], [8], [9], [10], [15] 1.3.1 Phương pháp giữ giống Ị9]y ỊỊ0],ỊỊ5] - Giữ giống trên môi trường thạch - Giữ giống trên cát vô trùng - Giữ giống trên đất vô trùng - Giữ giống trên hạt ngũ cốc - Giữ giống bằng phương pháp đông khô 1.3.2 Phương pháp cải tạo giông xạ khuẩn [2]y [6], IP], [10], [15] ♦ Mục đích: v s v sinh kháng sinh. .. 0,55 134 ,29 18,08 0,27 130 ,16 30.18 18,61 0,19 126,86 18,38 0,19 132 ,32 30.19 18,59 0,42 126,72 16,15 0,30 116,27 30.21 19,48 0,26 132 ,76 17,76 0,22 127,86 N hân xét: Như vậy sau đột biến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của biến chủng 30 tăng lên rõ rệt Chọn 3 biến chủng 30.17; 30.18; 30.21 có % biến đổi hoạt tính dương cao nhất đối với cả Shigella flexneri và Sarcina ỉutea để tiến hành các nghiên cứu. .. tính kháng sinh trong dịch lên men Kết quả được trình bày ở bảng 9 Bảng 9: Kết quả thử hoạt tính kháng sình sau khi lên men của biến chủng 30 Shi MT lên men SL ĩ) (111111) s D (mm) s MT3 dd 13, 38 0,05 13, 52 0,23 MT4dd 10,20 0,14 11,28 0,23 MT5 dd 0,00 0,00 0,00 0,00 Nhân xét: Từ kết quả bảng 8 nhận thấy MT3dd là môi trường lên men chìm tốt nhất Như vậy chủng Streptomyces 13. 13 có khả năng sinh tổng hợp. .. Hoạt tính kháng sinh của dung môi và dịch lọc chỉnh về pH trung tính sau mỗi lần chiết được kiểm tra bằng phương pháp khoanh giấy lọc Chọn dung môi chiết tốt nhất để định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo • Phương pháp xác định kháng sinh nội bào: Rửa sinh khối với nước cất, sấy ở t°c 40 - 50°c đến khô (48h) sau đó nghiền với dung môi đã lựa chọn để chiết kháng sinh nội bào, thử hoạt tính kháng sinh bằng... 21 (kết quả ở bảng 7) khi lên men bề mặt sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất nhưng khi lên men chìm lại cho giá trị thấp nhất Các dịch lọc được giữ lại để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo 2.2.8 Ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh: Dịch lên men được đưa vào các ống nghiệm và điều chỉnh đến các pH = 3, 5, 7, 9, 11 Sau 5 ngày thử lại hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch, kết quả . chọn khoá luận có tiêu đề " ;Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 13. 13" với các nội dung: - Chọn biến chủng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất bằng chọn lọc ngẫu. chi Streptomyces 5 1.3. Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ chi Streptomyces 7 1.3.1. Phương pháp giữ giống 7 1.3.2. Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn 7 1.3.3. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh. HÀ GÓP PHẦN NGHIÊN cứu SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 13. 13 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c sĩ KHOÁ Người hướng dẫn Nơi thực hiện Thời gian thực hiện TS. Cao Văn Thu Phòng Vi sinh