Góp phàn nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 183

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ THÚY GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.24 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ THÚY GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.24 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths. Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh và Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN               ThS. Lê Thị Thu Hương  B-     Tôi xin chân thà                      -                        m.                                                            Sinh viên    MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cƣơng về kháng sinh 2 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 2 1.1.2. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh 2 1.1.4. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới 3 1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn 3 1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 3 1.2.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4 1.2.3. Phân loại xạ khuẩn 4 1.2.4. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 5 1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 5 1.3.1. Mục đích 5 1.3.2. Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên 6 1.3.3. Đột biến cải tạo giống 6 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn 6 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 7 1.4.1. Định nghĩa 7 1.4.2. Các phương pháp lên men 7 1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 8 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh 8 1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 8 1.5.2. Các phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng 9 1.6. Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 10 1.6.1. Phổ tử ngoại – nhìn thấy (phổ UV-VIS) 10 1.6.2. Phổ hồng ngoại (phổ IR) 10 1.6.3. Phân tích khối phổ 11 1.7. Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomyces nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh 11 1.8. Nghiên cứu kháng sinh natamycin sản xuất bởi Streptomyces lydicus (quá trình lên men, chiết suất, tinh chế và một số tính chất) 12 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 13 2.1.1. Nguyên vật liệu 13 2.1.2. Máy móc thiết bị 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 16 2.2.2. Chủng giống, cải tạo giống 16 2.2.3. Lên men, chiết tách kháng sinh 16 2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm 17 2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 17 2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 17 2.3.3. Phân loại xạ khuẩn theo ISP 18 2.3.4. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 19 2.3.5. Sàng lọc ngẫu nhiên 20 2.3.6. Đột biến bằng ánh sáng UV 20 2.3.7. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 21 2.3.8. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 22 2.3.9. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 22 2.3.10. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng……… 22 2.3.11. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột và sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 23 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25 3.1. Xác định tên khoa học của Streptomyces 183.24 25 3.2. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh 26 3.2.1. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 26 3.2.2. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 27 3.2.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 28 3.2.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2…………………………………….29 3.2.5. Kết quả chọn môi trường lên men chìm 30 3.2.6. Kết quả chọn chủng lên men 30 3.2.7. Độ bền với pH, nhiệt 31 3.3. Chiết suất và tinh chế kháng sinh từ dịch lọc 32 3.3.1. Kết quả chọn pH chiết 33 3.3.2. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 34 3.3.3. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh 34 3.3.4. Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 34 3.3.5. Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 35 3.4. Kết quả độ nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 38 3.4.1. Nhiệt độ nóng chảy 38 3.4.2. Phổ tử ngoại 38 3.4.3. Phổ hồng ngoại 39 3.4.4. Phổ khối 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 - Kết luận 40 - Đề xuất 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ 1 16S rADN 16S Ribosomal acid deoxyribonucleic 2 ADN Acid deoxyribonucleic 3 ATCC American type culture collection (Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ) 4 B.pumilus Bacillus pumilus 5 DM Dung môi 6 DMHC Dung môi hữu cơ 7 ĐB1 Đột biến lần 1 8 ĐB2 Đột biến lần 2 9 Gr(+) Gram dương 10 Gr(-) Gram âm 11 ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) 12 IR Investor relations 13 KS Kháng sinh 14 HTKS Hoạt tính kháng sinh 15 MS Mass Spectometry 16 MT Môi trường 17 MTdt Môi trường dịch thể 18 S.flexneri Shighella flexneri 19 UV-VIS Ultraviloet- Visible 20 SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên 21 VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG STT Ký hiệu Nội dung Trang 1 Bảng 2.1 Các vi khuẩn kiểm định 13 2 Bảng 2.2 Các dung môi đã sử dụng 15 3 Bảng 3.1 Các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 183.24 và Streptomyces lydicus 25 4 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 183.24 trên MT1, MT2, MT6 26 5 Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của sàng lọc ngẫu nhiên 27 6 Bảng 3.4 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của đột biến lần 1 28 7 Bảng 3.5 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của đột biến lần 2 29 8 Bảng 3.6 Kết quả chọn môi trường lên men chìm 30 9 Bảng 3.7 Kết quả chọn chủng lên men 30 10 Bảng 3.8 Độ bền của kháng sinh với nhiệt 31 11 Bảng 3.9 Độ bền của kháng sinh với pH 31 12 Bảng 3.10 Kết quả chọn pH chiết 32 13 Bảng 3.11 Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký 33 14 Bảng 3.12 Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 34 15 Bảng 3.13 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn của chạy cột lần 1 35 16 Bảng 3.14 Màu sắc từ phân đoạn 7 đến 14 của sắc ký cột lần 1 35 17 Bảng 3.15 Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 36 [...]... tiêu sau đây: - Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183. 24 - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Xác định các điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh, sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng về kháng sinh 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh Năm 1929 thuật ngữ "chất kháng sinh" được Alexander Fleming mô tả... cấu trúc tương tự Do vậy, đẩy mạnh nghiên cứu kháng sinh mới có hiệu quả điều trị cao, độc tính thấp, ít bị kháng đang là một nhu cầu cấp thiết Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces Đây là cơ sở để tôi chọn đề tài: Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183. 24” làm khóa luận tốt nghiệp... thuật gây đột biến, dung hợp tế bào, tái tổ hợp gen ) đã tạo ra những chủng có khả năng tổng hợp kháng sinh cao gấp nhiều lần so với ban đầu Bên cạnh đó, tổng hợp và bán tổng hợp kháng sinh từ các khung hóa học sẵn có cũng đạt được những thành tựu đáng kể với sự xuất hiện của chloramphenicol, cephalosporin bán tổng hợp, macrolid,… [9],[12],[19],[35] 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm... nhiên, việc nghiên cứu kháng sinh mới đang có xu hướng giảm dần theo thời gian do chi phí, nhân lực còn hạn chế Đó chính là nguyên nhân các hãng dược phẩm đang có xu hướng từ bỏ cam kết triển khai nghiên cứu thuốc kháng sinh mới Trong khi đó, việc sử dụng kháng sinh chưa hợp lý gây ra tình trạng kháng thuốc ngày càng nghiêm trọng và xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật kháng chéo với các kháng sinh có cấu... mặt pha tĩnh [5] - Tinh chế bằng nhựa trao đổi ion hoặc bằng phức chất 10 1.6 Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh Sau quá trình tách chiết, tinh chế thì việc phân tích phổ của thành phần kháng sinh tinh khiết thu được nhằm định hướng cấu trúc kháng sinh là khâu then chốt trong nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh 1.6.1 Phổ tử ngoại – nhìn thấy (phổ UV-VIS) Nguyên lý: quang phổ tử ngoại xuất hiện... phát triển kháng sinh mới Một trong các thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh và các chất kháng VSV Tuy nhiên, các VSV đã và đang phát triển tính kháng với các kháng sinh hiện có bằng các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền Do vậy, cần phải có các kháng sinh mới có tác dụng hiệu quả lên các vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là các hợp chất chống khối u và vật ký sinh Ngoài... là có khả năng kích hoạt các cụm gen câm có khả năng sinh tổng hợp Quá trình này hỗ trợ việc xác định các chất hoạt hoá sinh tổng hợp kháng sinh Sự biểu hiện của các cụm gen chuyển hóa thứ cấp trong Streptomycetes được điều khiển bởi gen hoạt hóa Tăng số lượng bản sao làm tăng sản xuất kháng sinh hoặc kích hoạt các cụm gen câm có khả năng sinh tổng hợp Đặc tính này đã được sử dụng cho các nhân bản của... thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát [7],[20],[22] Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn [9] 1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh 1.5.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm trao... Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như kháng sinh, vitamin, acid hữu cơ, các enzym… nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều [8] Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa, được tích lũy bên trong tế bào (nội bào) hay phóng thích ra ngoài môi trường (ngoại bào) Các chủng xạ khuẩn cùng loài có thể sản sinh các kháng sinh khác... khí sinh (màu sắc của bề mặt), sắc tố melanoid [8] 1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1 Mục đích Xạ khuẩn thuần chủng phân lập từ tự nhiên thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp Do đó, để thu được kháng sinh có hoạt tính và hiệu suất sinh tổng hợp cao đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp . GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183. 24 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths. Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh và Sinh. gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi chọn đề tài: Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183. 24” làm khóa luận tốt nghiệp với các. đột biến, dung hợp tế bào, tái tổ hợp gen ) đã tạo ra những chủng có khả năng tổng hợp kháng sinh cao gấp nhiều lần so với ban đầu. Bên cạnh đó, tổng hợp và bán tổng hợp kháng sinh từ các khung