Góp phần nghiên cứu kháng sinh do streptomyces 182 15 tổng hợp được

Nghiên cứu sinh hoá về sản xuất kháng sinh từ chi xạ khuẩn Streptomyces: phân lập, lên men, tách chiết và các tính chất sinh học .... DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình PH.1 Sơ đồ tổng quát sinh

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến

PGS TS Cao Văn Thu người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi từ những ngày đầu

bước vào nghiên cứu khoa học cho tới khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên giảng dạy công tác tại bộ môn Vi sinh - Sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại Học Dược Hà Nội; Khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội; Viện Công nghệ Dược phẩm quốc gia; Viện Hàn Lâm khoa học

và công nghệ Việt Nam; Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy

cô giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ tôi trong suốt năm năm học tại trường để tôi có được những kiến thức và các kỹ năng cần thiết

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình nơi đã sinh ra, nuôi dưỡng và dạy dỗ để tôi có được thành quả như ngày hôm nay Cảm ơn những người bạn, người em đã hỗ trợ và đồng hành trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Do thời gian, phương tiện, kinh phí, kiến thức của bản thân còn hạn chế, chắc chắn khóa luận này không tránh khỏi thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô, bạn bè để khóa luận này được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2017

Sinh viên NGUYỄN THỊ THẢO

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 2

1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.3 Phân loại kháng sinh 2

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3

1.1.5 Ứng dụng của kháng sinh 3

1.1.6 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 4

1.2 Đặc điểm xạ khuẩn 4

1.2.1 Đặc điểm hình thái và kích thước 4

1.2.2 Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng 5

1.2.3 Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn 5

1.2.4 Phân loại xạ khuẩn 5

1.2.5 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 5

1.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh 6

1.4 Cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn 6

1.4.1 Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn 6

1.4.2 Bảo quản giống xạ khuẩn 7

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 7

1.5.1 Khái niệm lên men 7

1.5.2 Các phương pháp lên men 8

1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 8

1.6 Chiết tách, tinh chế kháng sinh 9

1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 9

1.6.2 Chiết xuất kháng sinh 9

1.6.3 Tách và tinh chế kháng sinh 9

1.7 Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh 10

1.7.1 Phổ hồng ngoại (IR) 10

1.7.2 Phổ tử ngoại - khả kiếm (UV - VIS) 11

1.7.3 Phổ khối (MS) 11

1.7.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 11

1.8 Một số nghiên cứu liên quan đến Streptomyces 11

1.8.1 Nghiên cứu sinh hoá về sản xuất kháng sinh từ chi xạ khuẩn Streptomyces: phân lập, lên men, tách chiết và các tính chất sinh học 11

1.8.2 Streptomyces vietnamensis sp Nov, một streptomycete có sắc tố khuếch tán màu xanh tím phân lập được từ đất tại Việt Nam 12

1.8.3 Có bao nhiêu loại kháng sinh được sản xuất bởi streptomyces 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 14

2.1.1 Nguyên vật liệu 14

2.1.2 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống 17

2.2.2 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh 17

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc kháng sinh thu được 17

2.3 Phương pháp thực nghiệm 17

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 17

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 17

2.3.3 Phương pháp cải tạo và chọn giống 18

2.3.4 Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh 20

2.3.5 Các phương pháp chiết tách, tinh chế kháng sinh 21

2.3.6 Sơ bộ xác định cấu trúc và tính chất kháng sinh thu được 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM, NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh 24

3.1.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 182.15 24

3.1.2 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 24

3.1.3 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 25

3.1.4 Kết quả đột biến hoá học cải tạo giống lần 3 26

3.2 Kết quả lên men chọn môi trường nuôi cấy tối thích 27

3.3 Kết quả chọn chủng lên men tốt nhất 28

3.4 Kết quả sắc ký 29

3.4.1 Kết quả chạy sắc ký lần 1 29

3.4.2 Kết quả chạy sắc ký lần 2 30

3.4.3 Kết quả chạy sắc ký lần 3 31

3.5 Kết quả sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh 32

3.5.1 Kháng sinh 1 32

3.5.2 Kháng sinh 2 36

3.5.3 Kháng sinh 3 37

3.6 Bàn luận 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

AND Acid 2’-deoxyribonucleic

CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm

phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ)

CW Cell wall (thành tế bào)

CM Cytoplasmic membrane (màng tế bào chất)

D Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn

Dd Dung dịch

ĐBUV1 Đột biến UV lần 1

ĐBUV2 Đột biến UV lần 2

ĐBHH Đột biến hoá học

L-DAP L-diaminopimelic acid

Dmhc Dung môi hữu cơ

NMR Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)

S Sai số thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

SKLM Sắc ký lớp mỏng

SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên

UV Utra Violet (tử ngoại)

UV – VIS Ultra Violet - Visible (tử ngoại - khả kiếm)

V Thể tích

v/v Thể tich/thể tích

VK Vi khuẩn

VSV Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 14

Bảng 2 2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 14

Bảng 2 3: Các dung môi sử dụng 15

Bảng 2 4: Các hoá chất sử dụng 16

Bảng 3 1: Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên 24

Bảng 3 2: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1 25

Bảng 3 3: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2 26

Bảng 3 4: Kết quả thử HTKS sau đột biến hoá học 27

Bảng 3 5: Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men tối thích 28

Bảng 3 6: Kết quả thử HTKS chọn chủng lên men tốt nhất 28

Bảng 3 7: Kết quả thử HTKS và SKLM sau chạy sắc ký cột lần 1 29

Bảng 3 8: Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 2 30

Bảng 3 9: Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 3 31

Bảng 3 10: Kết quả phổ IR của KS1 33

Bảng 3 11: So sánh nhiệt độ nóng chảy, phổ UV của KS1 và Actinomycin X2 33

Bảng 3 12: So sánh phổ NMR của KS1 và Actinomycin X2 35

Bảng 3 13: Kết quả phổ IR của KS2 36

Bảng 3 14: Kết quả phổ IR của KS3 37

Bảng PB 1: Một số kháng sinh do các chủng Streptomyces tạo ra………… phụ lục

Bảng PB 2: Kết quả thử HTKS sau SLNN phụ lục Bảng PB 3: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV1 phụ lục Bảng PB 4: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV2 phụ lục Bảng PB 5: Kết quả thử HTKS sau đột biến hoá học phụ lục

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình PH.1 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh

Hình PH.2 Xạ khuẩn cấy zigzac trên đĩa Petri và khuẩn lạc sau đột biến UV

Hình PH.3 Thử HTKS bằng 3 phương pháp khối thạch, giếng thạch, khoanh

giấy lọc

Hình PH.4 Bình chứa dịch lên men

Hình PH.5 Sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng

Hình PH.6 Hiện hình bằng VSV

Hình PH.7 Kháng sinh tinh khiết

Hình PH.8 Đo nhiệt độ nóng chảy của KS2 và KS1

Hình PH.9 Phổ tử ngoại của hháng sinh 1

Hình PH.10 Phổ tử ngoại của kháng sinh 2

Hình PH.11 Phổ tử ngoại của kháng sinh 3

Hình PH.12 Phổ khối của kháng sinh 1

Hình PH.13 Phổ khối của kháng sinh 2

Hình PH.14 Phổ hồng ngoại của kháng sinh 1

Hình PH.15 Phổ hồng ngoại của kháng sinh 2

Hình PH.16 Phổ hồng ngoại của kháng sinh 3

Hình PH.17 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của KS1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc phát minh ra kháng sinh được coi là một trong những thành tựu khoa học lớn nhất của con người trong thế kỷ XX, giúp cứu sống hàng triệu người khỏi các căn bệnh do vi khuẩn gây ra Tuy nhiên, một thực trạng đang nhận được sự quan tâm cấp thiết trên toàn cầu đó là tình trạng “đề kháng kháng sinh” Theo CDC, mỗi năm tại Hoa Kỳ có ít nhất 2 triệu người bị nhiễm vi khuẩn có khả năng kháng thuốc kháng sinh và ít nhất 23.000 người chết mỗi năm do hậu quả trực tiếp của tình trạng này [21] Một nghiên cứu lâm sàng tại Oxford năm 2013 cho biết, tỷ lệ vi

khuẩn E.coli kháng với kháng sinh carbapenem đã đạt mức cao Trong số 26 nước

báo cáo thì tỷ lệ kháng cao nhất tại Ấn Độ 11 %, Việt Nam đứng thứ 2 là 9 %, sau

đó đến Bulgaria Tỷ lệ vi khuẩn này kháng với kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 lên đến hơn 60 % Colistin là lựa chọn điều trị cuối cùng cho nhiễm trùng đe dọa

tính mạng do Enterobacteriaceae kháng carbapenem nhưng hiện tượng kháng

colistin gần đây đã được phát hiện ở một số nước và khu vực và nó đồng nghĩa với việc bệnh nhân sẽ tử vong do không có thuốc điều trị [22], [29]

Với tình hình đó, thách thức đặt ra cho các nhà khoa học trong cuộc chiến chống lại các vi khuẩn kháng thuốc là việc tìm kiếm các loại kháng sinh mới, cải tạo, nâng cao khả năng kháng khuẩn của kháng sinh

Chi xạ khuẩn Streptomyces có nhiều loài xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp

các kháng sinh đa dạng về cấu trúc và hoạt tính kháng khuẩn cao Do đó, tại bộ môn

Vi sinh - Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội tôi chọn đề tài: “ Góp phần nghiên

cứu kháng sinh do Streptomyces 182.15 tổng hợp được” với những mục tiêu:

- Tiến hành chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp

kháng sinh

- Tiến hành lên men, chiết tách, tinh chế để thu kháng sinh tinh khiết

- Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh

Năm 1928, Alexander Flemming tình cờ phát hiện ra hiện tượng xung quanh các tảng nấm, vi khuẩn bị tiêu diệt tạo thành vòng vô khuẩn Năm 1929, ông công

bố hiện tượng đó trước công chúng và đồng thời nói rằng ông chưa thể chiết tách được penicillin từ nấm Năm 1940, Howard Walter Florey và Ernst Boris Chain đã chiết xuất thành công penicillin Năm 1943, penicillin được áp dụng vào điều trị Sau đó, nhiều kháng sinh đã được tìm ra Cùng với việc tìm ra những kháng sinh mới, công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện Con

đường tổng hợp và bán tổng hợp cũng dần phát triển [30]

1.1.2 Định nghĩa kháng sinh

Có nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh

Định nghĩa được coi là tương đối hoàn chỉnh: “Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn gốc tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm,…) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp” [9]

1.1.3 Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách phân loại kháng sinh: Dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh, dựa vào cấu trúc hóa học,

phân loại theo dược động học - dược lực học, theo nguồn gốc,… [1], [3], [4], [11]

Trong đó, phân loại theo cấu trúc hóa học được sử dụng nhiều nhất

Dựa vào cấu trúc hóa học, kháng sinh được chia thành các nhóm sau:

- Nhóm β-lactam:

+ Penicillin: benzylpenicillin, oxacillin, ampicillin,…

+ Cephalosporin: cephalexin, cefotaxim, cefaclor,…

+ Các β-lactam khác: cacbamazepim, chất ức chế β-lactamase,…

- Nhóm Aminoglycosid: streptomycin, gentamicin,…

- Nhóm macrolid: erythromycin, clarithromycin,…

- Nhóm lincosamid: lincomycin, clandamycin,…

- Nhóm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol,…

- Nhóm tetracyclin: tetracyclin, doxycyclin,…

- Nhóm peptid:

+ Glucopeptid: vancomycin,…

+ Polypeptid: polymicin, bacitracin,…

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Các cơ chế tác dụng chủ yếu:

- Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: beta-lactam, vancomycin,…

- Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn: cloramphenicol,…

- Ức chế tổng hợp acid nucleic: griseofulvin, actinomycin,…

- Thay đổi tính thấm của màng sinh chất: colistin, polymicin,… [1], [3], [9],

[18], [34]

1.1.5 Ứng dụng của kháng sinh

1.1.5.1 Trong y học

Kháng sinh không chỉ sử dụng trong phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn

mà còn được dùng để điều trị các loại bệnh phổ biến do nấm gây ra và các bệnh ung

thư (ung thư vú, phổi, dạ dày,…) [9], [26], [30], [33]

1.1.5.2 Trong nông nghiệp

Trong chăn nuôi: Phòng và điều trị bệnh cho động vật, chất kích thích tăng trọng gia súc, gia cầm, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với tác dụng ức chế và loại

bỏ sự hoạt động của VK gây bệnh đường tiêu hoá, hô hấp [9], [26]

Trong trồng trọt: Thuốc bảo vệ thực vật, đem lại hiệu quả kinh tế cao, khắc phục được nhược điểm của các thuốc hóa học (hiện tượng kháng thuốc, ô nhiễm, chất độc

tồn dư,…) [9], [26]

1.1.5.3 Trong công nghiệp thực phẩm

Chất bảo quản thực phẩm: nisin, subtilin, clotetracyclin,… ưu điểm: thời gian khử trùng bằng nhiệt ngắn đi, nhiệt độ khử trùng giảm Nồng độ kháng sinh rất thấp, bảo quản được lâu dài, chất lượng tốt hơn, vitamin không bị phá hủy, hương vị

ít bị biến đổi [8], [9], [10], [26]

1.1.6 Sơ đồ tổng quát lên men sinh tổng hợp kháng sinh

Được giới thiệu ở hình PH.1 phần phụ lục [14], [17]

1.2 Đặc điểm xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), là các VK

Gr(+), có tỷ lệ G + C > 55 % Phân bố rộng rãi trong đất, nước, bùn,… [6], [18]

1.2.1 Đặc điểm hình thái và kích thước

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, phát triển thành dạng sợi phân nhánh

Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn

ty của xạ khuẩn thường không có vách ngăn, không tự đứt đoạn, đường kính 0,3 –2,0 µm, màu sắc rất phong phú: trắng, đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen, [13], [18]

- Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản, là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng

- Khuẩn ty khí sinh: khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh

Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của khuẩn ty khí sinh xuất hiện chuỗi bào tử

Bào tử trần là cơ quan sinh sản của xạ khuẩn, có hình tròn, bầu dục, hình

que, hình trụ,… Bề mặt bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vảy, có gai, có lông

Khuẩn lạc xạ khuẩn: Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn Đặc điểm: không trơn ướt, thường ở dạng rắn chắc, thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, hoặc đường tròn đồng tâm,… [6], [18]

1.2.2 Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng

Streptomyces thuộc xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ phát triển tối thích

22 - 32oC, pH tối thích 6,5 - 7,5

Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxy hóa cao Để phát triển chúng

phân giải các hydratcarbon làm nguồn dinh dưỡng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit [13], [18]

1.2.3 Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn

Cấu tạo gồm 3 phần: Thành tế bào, màng tế bào và tế bào chất Thành tế bào

xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CWI, có chứa L-diaminopimelic acid (L-ADP)

và glycin [15], [18]

1.2.4 Phân loại xạ khuẩn

Nhiều khoá phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học trên thế giới xây dựng: Waksman, Krassilnhikov, Gauze,…

Phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces theo khoá phân loại ISP của

E.B.Shirling & Gottlieb được sử dụng rộng rãi, khoá phân loại dựa vào các đặc trưng:

- Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử

- Đặc điểm sinh lý học: khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và khả năng sử dụng các nguồn đường [5], [18], [27]

Ngày nay, người ta cũng thường sử dụng phương pháp giải trình tự gen 16S

rADN để phân loại Streptomyces Ưu điểm là cho kết quả khá chính xác, đáng tin

cậy [6], [18]

1.2.5 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces

Đặc tính quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình thành kháng sinh,

60 -70 % xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều kháng sinh có cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau Bảng PB.1 giới thiệu

một số chất kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces [6], [13], [26]

1.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh

Để phân lập trước tiên người ta lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: Đất, bùn, nước ở sông hồ,…đem phân lập thuần khiết những vi sinh vật sinh kháng sinh bằng các phương pháp đặc trưng và cấy trên các môi trường chọn lọc

Các phương pháp phân lập: Phương pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch; phương pháp cấy trực tiếp đất lên bề thạch đã chứa VSV kiểm định; phương pháp làm giàu đất bằng VSV kiểm định; phương pháp thêm kháng sinh vào môi trường phân lập; phương pháp phân lập VSV sinh kháng sinh chống ung thư [9]

1.4 Cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn

VSV tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất tự nhiên thường có hoạt tính thấp Vì vậy, để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp [9]

1.4.1 Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn

Mục đích:

- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: tạo ít bọt hơn, rút ngắn thời gian lên men,…

- VSV chỉ tạo 1 sản phẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho tách chiết và tinh chế

- Sinh tổng hợp các chất mới với tác dụng mới [4], [9]

1.4.1.1 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên

Các VSV luôn có các biến dị tự nhiên với tần số khoảng 10-10 - 10-5 trong ống giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau Trong đó, có những biến chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 20 – 30 % các biến chủng khác Cần phải chọn lấy cá thể có HTKS cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp [4], [9]

1.4.1.2 Đột biến cải tạo giống

Chọn lọc tự nhiên chưa đáp ứng được yêu cầu của công nghiệp, cần thiết phải dùng đến các phương pháp đột biến nhân tạo

Các tác nhân đột biến bao gồm:

+ Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia Rơnghen và các bức xạ ion hoá khác Khả năng gây đột biến của ánh sáng UV phụ thuộc vào bước sóng, cường độ, khoảng cách và thời gian chiếu ánh sáng UV

+ Tác nhân hoá học: Nitrozoguanidin, HNO2, ethylenimin,…

+ Tác nhân sinh học: Các yếu tố di truyền vận động

Để tạo ra các biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao, phải tiến hành đột biến bậc thang kết hợp với các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp cận hữu tính, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần

Sau khi đột biến, hầu hết các VSV chết Trong số các biến chủng sống sót, có biến chủng có HTKS tăng (đột biến dương) hoặc giảm (đột biến âm) Cần SLNN sau đột biến để chọn ra các biến chủng có HTKS cao để nghiên cứu tiếp [4], [9]

1.4.2 Bảo quản giống xạ khuẩn

Việc bảo quản giống đóng vai trò rất quan trọng Nếu việc bảo quản giống không tốt thì tỷ lệ sống sót thấp, không duy trì được các tính trạng tốt đã được phát hiện

Các phương pháp bảo quản: Bảo quản lạnh, bảo quản lạnh sâu, phương pháp đông khô, phương pháp cấy truyền giữ giống [9]

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.5.1 Khái niệm lên men

Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong những điều kiện nhất định nhằm tích luỹ các sản phẩm trao đổi chất có ích từ chính các VSV hoặc từ các thành phần

tế bào

Kháng sinh là sản phẩm bậc 2, tạo thành lúc gần kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, gần hoặc vào chính pha cân bằng [6], [9], [17], [18]

1.5.2 Các phương pháp lên men

1.5.2.2 Lên men chìm

Là phương pháp lên men mà VSV phát triển trong môi trường lỏng

Ưu điểm: Hiệu suất quá trình lên men cao; giữ được vô trùng; dễ kiểm soát toàn bộ; dễ cơ giới hoá, tự động hoá; tốn ít diện tích, nhân công

Nhược điểm: Chi phí cho trang thiết bị lớn (thiết bị chuyên dụng, chịu được

áp lực, vô trùng tuyệt đối), cần cán bộ chuyên môn hoá, có kinh nghiệm; không thể

xử lý cục bộ

Các kiểu lên men chìm: Lên men mẻ (gián đoạn), lên men có bổ sung, lên men liên tục, lên men bán liên tục [4], [9], [16]

1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

pH môi trường: Ảnh hưởng do tác dụng trực tiếp của ion H+ hay OH – đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzym hoặc tác dụng gián tiếp

Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng, kiểu sinh sản, hình thái, trao đổi chất, nhu cầu dinh dưỡng của VSV Nhiệt độ thấp VSV không phát triển, nhiệt độ cao VSV bị chết do biến tính protein và ADN Vì vậy, thiết bị lên men cần

có bộ phận trao đổi nhiệt hữu hiệu để duy trì nhiệt độ sinh trưởng tối ưu cho VSV

Độ hoà tan oxy và thông khí: Thiếu oxy sẽ phá vỡ trao đổi chất trong tế bào, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hoà tan oxy tương thích với tốc độ sử dụng oxy

của VSV Một số VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm tàng

Như vậy, trong sản xuất cần nghiên cứu kỹ các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men để tối ưu hoá các điều kiện tạo thuận lợi cho sinh tổng hợp các chất mong muốn [4], [9], [16]

1.6 Chiết tách, tinh chế kháng sinh

1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh

Đóng vai trò rất quan trọng vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp Để thu được kháng sinh có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách, tinh chế thích hợp [9], [14]

1.6.2 Chiết xuất kháng sinh

Là phương pháp tách một hay một số chất ra khỏi hỗn hợp Đó là quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và một pha rắn (cân bằng lỏng - rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng lỏng - lỏng)

Với kháng sinh ngoại bào: Tồn tại trong dịch lên men người ta ứng dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng

Với kháng sinh nội bào: Tiến hành chiết lỏng - rắn Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự khuyếch tán của kháng sinh vào dung môi chiết [8],[9],[15]

1.6.3 Tách và tinh chế kháng sinh

Là nhóm các phương pháp hoá học, vật lý và hoá lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến một hỗn hợp đơn giản, và từ hỗn hợp đơn giản đến tách riêng từng chất

Bao gồm các phương pháp: chiết, thẩm thấu, sắc ký

 Phương pháp sắc ký:

Nguyên lý tách: mẫu phân tích hoà tan trong pha động => cho qua pha tĩnh liên tục và không hoà lẫn vào pha tĩnh => các chất tan trong mẫu sẽ di chuyển qua

pha tĩnh với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh - pha động - chất tan => các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc ký đồ nhờ tốc độ di chuyển khác nhau [2], [15]

ddm: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm)

Phát hiện các chất phân tích trên bản mỏng: Chiếu đèn UV, thuốc thử hiện màu, nhìn bằng mắt thường,…

1.7.2 Phổ tử ngoại - khả kiếm (UV - VIS)

Phổ UV - VIS là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng hay số sóng Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại làm thay đổi mức năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản E0 lên trạng thái kích E1, E2,…

Phổ UV - VIS được sử dụng để định tính bằng cách so sánh với phổ của chất chuẩn đã có sẵn (về vị trí cực đại, cực tiểu và tỷ lệ mật độ quang giữa các bước sóng đó), tuy nhiên phổ UV - VIS là phổ cho khá ít thông tin về cấu trúc nên vẫn thường

sử dụng phổ IR để xác định cấu trúc [2], [33]

1.7.3 Phổ khối (MS)

Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ

bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Tín hiệu tương ứng với các ion được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau, tập hợp lại thành phổ khối (MS) [2], [33]

1.7.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Cộng hưởng từ hạt nhân được xem là một phương pháp ưu việt áp dụng vào việc nghiên cứu, biện giải và xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ Có rất nhiều hạt nhân được nghiên cứu nhưng Hydro và Carbon là phổ biến nhất [2], [33]

Phối hợp các phương pháp trên để biện giải cấu trúc kháng sinh

1.8 Một số nghiên cứu liên quan đến Streptomyces

1.8.1 Nghiên cứu sinh hoá về sản xuất kháng sinh từ chi xạ khuẩn

Streptomyces: phân lập, lên men, tách chiết và các tính chất sinh học

Tunicamycin là một kháng sinh nucleotid được phân lập từ dịch lên men

chủng Streptomyces T - 4 Theo đặc điểm hình thái học, sinh lý, sinh hoá và phân tích chuỗi 16S rADN chủng T - 4 được xác định là Streptomyces torulosus Trong

các thử nghiệm in vivo, nó chống lại một số vi sinh vật gây bệnh như:

Staphylococcus aureus, NCTC 7447; Micrococcus lutea, ATCC 9341; Bacillus subtilis, NCTC 10400; Bacillus pumilus, NCTC; Klebsiella pneumonia, NCIMB

9111; Escherichia coli, NCTC 10416; Pseudomonas aeruginosa, ATCC 10145;

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763; Candida albicans, IMRU 3669; Aspergillus flavus, IMI 111023; Aspergillus niger IMI 31276; Aspergillus fumigatus ATCC

và phân tử khối của kháng sinh là 2350C và 865 đvC, phổ UV cho đỉnh hấp thụ cực đại tại 260 nm, phổ IR có 26 đỉnh Công thức được xác định là C38H62N4O16 và

được xác nhận rằng hợp chất được sản xuất bởi Streptomyces torulosus, T - 4 là

kháng sinh Tunicamycin [23]

1.8.2 Streptomyces vietnamensis sp Nov, một streptomycete có sắc tố khuếch tán

màu xanh tím phân lập được từ đất tại Việt Nam

Một xạ khuẩn được đặt tên là GIMV4.0001, được phân lập từ mẫu đất rừng tại Việt Nam Chúng tạo ra các sợi khuẩn ty khí sinh có màu trắng và sắc tố khuếch tán màu xanh tím trên môi trường thạch tổng hợp của Gauze Màu sợi nấm bề mặt không nhạy cảm với pH Quan sát chuỗi bào tử chủng GIMV4.0001 dưới kính hiển

vi thấy chuỗi bào tử thẳng, dài, hình trụ, và thông tin về hoá định dạng khẳng định

rằng chủng này thuộc các chi Streptomyces Chủng có sinh sắc tố melanoid nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn đối với Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Bacillus subtilis, Candida albicans hoặc Penicillium citrinum Phân tích trình tự gen

16S rADN của chủng GIMV4.0001 cho thấy chủng có sự tương đồng cao nhất

(99,4 %) là Streptomyces bikiniensis ATCC 11062 Tuy nhiên, sự liên quan DNA - DNA giữa chủng GIMV4.0001 và S.bikiniensis ATCC 11062 được tìm thấy chỉ là 50,3 % Chủng GIMV4.0001 cũng có thể được phân biệt với S.bikiniensis ATCC

11062 (T) và các loài Streptomyces có trình tự gen 16S rADN giống nhau cao (98 –

99 %) dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá Trên cơ sở tính chất sinh lý

và phân tử của nó, rõ ràng là chủng GIMV4.0001 đại diện cho một loài mới thuộc

chi Streptomyces, mà tên Streptomyces vietnamensis sp.Nov được đề xuất Loại

chủng là GIMV4.0001 (= CCTCC M 205.143 = IAM 15.340) [31]

1.8.3 Có bao nhiêu loại kháng sinh được sản xuất bởi streptomyces

Streptomyces là chi lớn nhất sản sinh ra kháng sinh trong giới vi sinh vật

được phát hiện cho đến nay Số lượng các hợp chất diệt VK được báo cáo từ các loài thuộc chi này mỗi năm đã tăng gần như theo cấp số nhân trong khoảng hai thập

kỷ, đạt được đỉnh điểm vào những năm 1970, và suy giảm đáng kể vào cuối những năm 1980 và 1990 Số liệu tích lũy cho thấy một đường cong sigmoid có độ dốc nhỏ hơn nhiều những gì dự đoán từ phương trình toán học Tác giả đã cố gắng chỉ

ra một mô hình toán học phù hợp cho đường cong này để ước tính số lượng các kháng sinh chưa được khám phá từ chi này cũng như để dự đoán các xu hướng tìm kiếm trong tương lai gần Một mô hình giả định rằng những nỗ lực sàng lọc được khuyến khích bởi thành công của những năm trước và xác suất tìm ra kháng sinh mới đã được cung cấp phù hợp sau khi tối ưu hóa các thông số Mô hình này ước tính tổng số các hợp chất kháng khuẩn mà chi này có thể sản xuất được có thể là 100.000 - một phần nhỏ trong số đó đã được xác định cho đến nay Sự suy giảm độ dốc đường cong dường như là do sự suy giảm trong các nỗ lực tìm kiếm chứ không phải là sự cạn kiệt của các hợp chất Độ dốc sẽ trở thành con số không trong một hoặc hai thập kỷ tới, nhưng nếu những nỗ lực sàng lọc được duy trì liên tục, tỷ lệ phát hiện các hợp chất mới sẽ không giảm trong vài thập kỷ tới [28]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: Giống xạ khuẩn Streptomycs 182.15 có HTKS mạnh

nhất được lưu sau đề tài nghiên cứu năm 2016

 Giống VSV kiểm định: Các chủng VSV kiểm định do bộ môn

Vi sinh - Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp:

Bacillus pumilus ATCC 6633, Shighella flexneri DT 112

 Môi trường nuôi cấy:

 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 2 1: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Thành phần

MT

NaCl (g)

Cao thịt (g)

Pepton (g)

Thạch (g)

Nước

Canh thang 0,5 0,3 0,5 0 100 (vđ)

7,0 - 7,4 Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,6 - 1,8 100 (vđ)

 Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2 2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Thành phần (g) MT1 MT2 MT6

Tinh bột 2 2 2 KNO3 0,1

KCl 0,05 NaNO3 0,2 CaCO3 0,2 (NH4)2SO4 0,2

K2HPO4 0,05 0,1

MgSO4.7H2O 0,05 0,05 NaCl 0,05 0,1 Cao nấm men 0,5 Thạch 1,8 2 2 Nước vđ (ml) 100 100

pH 6,8 - 7,2

 Các môi trường dịch thể (MTdt): Thành phần tương ứng như MT nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch

- Chú ý: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, nuôi cấy VSV kiểm định, môi

trường lên men được tiệt trùng ở 118 - 1200C trong 30 phút

 Dung môi: Các dung môi đã được sử dụng được giới thiệu trong bảng 2.3

Bảng 2 3: Các dung môi sử dụng Dung môi Khối lượng riêng (g/ml) Nhiệt độ sôi ( 0 C)

Aceton, Xilong - Trung Quốc 0,79 56

n-butanol, Xilong - Trung Quốc 0,81 116 - 118 n-hexan, Merck - Đức 0,655 68

Ethanol, Xilong - Trung Quốc 0,789 - 0,791 78,3

 Hoá chất: Các hoá chất đã sử dụng được giới thiệu ở bảng 2.4

Bảng 2 4: Các hoá chất sử dụng Các hoá chất sử dụng Hãng sản xuất Quy cách đóng gói

Tinh bột Việt Nam Túi 1kg

KNO3 Trung Quốc Lọ 0,5 kg KCl Trung Quốc Lọ 0,5 kg NaNO3 Trung Quốc Lọ 0,5 kg NaNO2 Trung Quốc Lọ 0,5 kg CaCO3 Trung Quốc Lọ 0,5 kg (NH4)2SO4 Trung Quốc Lọ 0,5 kg

K2HPO4 Trung Quốc Lọ 0,5 lít MgSO4.7H2O Trung Quốc Lọ 0,5 kg NaCl Trung Quốc Lọ 0,5 kg Cao nấm men Đức Lọ 0,5 kg Cao thịt Đức Lọ 0,5 kg Thạch Việt Nam Túi 10 g

Pepton Trung Quốc Lọ 0,5 kg NaOH Trung Quốc Viên

HCl 0,1 N Trung Quốc Lọ 0,5 lít

2.1.2 Máy móc, thiết bị, dụng cụ

- Đèn UV (λ = 254 nm), nguồn phát Toshiba 60 W, điện thế 220 V

- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030

- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210, cân phân tích Sartorius BP 121S

- Tủ ấm Menmert, Binder Tủ lạnh Deawoo, Sanyo Tủ cấy vô trùng Aura VF

48, tủ sấy SL Shellab

- Máy lắc Taitec Bio - Shaker BR 300Lf

- Máy đo UV - VIS Hitachi U - 1900, máy đo phổ MS - Xevo TQMS, máy đo

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống

- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên lựa chọn các dạng chủng có HTKS cao nhất

- Đột biến bằng ánh sáng UV, tác nhân hoá học HNO2 để nâng cao HTKS của

Streptomyces 182.15

2.2.2 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh

- Từ các biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng có khả năng lên men tạo

kháng sinh mạnh nhất tiến hành lên men sinh tổng hợp kháng sinh

- Tách kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

- Chạy sắc ký cột, SKLM để tinh chế kháng sinh

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc kháng sinh thu được

- Xác định một số đặc điểm vật lý: màu sắc, hình dạng bột kháng sinh

- Xác định: Nhiệt độ nóng chảy, đo phổ IR, phổ UV, phổ MS, phổ NMR

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

Mục đích: Bảo quản các chủng giống thuần khiết đã phân lập, chủng giống

sau mỗi lần SLNN, đột biến nhân tạo để giữ lại cho các nghiên cứu tiếp theo

Tiến hành: Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp (MT1), ủ cho phát triển ở 28 - 290C Sau 6 - 8 ngày xạ khuẩn phát triển tốt, cho các ống giống vào bảo quản tủ lạnh ở 20C, định kỳ 3 - 6 tháng cấy

chuyển

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

Nguyên tắc: Kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch dinh dưỡng đã

cấy VSV kiểm định, ức chế sự phát triển của VSV tạo thành vòng vô khuẩn

Tiến hành:

- Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml

MT canh thang, ủ ở 370C trong 18 - 24 h (đối với vi khuẩn) để tạo hỗn dịch VSV có nồng độ 107 - 108 tế bào/ml

- Cấy hỗn dịch VSV vào MT thạch thường đã tiệt trùng và để nguội đến 45

-500C với tỷ lệ 2,5 : 100 (105 tế bào/ml), lắc đều, đổ ra đĩa Petri vô trùng với

thể tích 20 ml/đĩa

- Đưa mẫu thử vào MT kiểm định theo phương pháp khối thạch (hình PH.3)

- Các đĩa Petri đã đặt mẫu thử được ủ ở 370C trong 18 - 24 h Mỗi mẫu thử

tiến hành song song 3 đĩa/1 loại VSV kiểm định

Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer

Đánh giá kết quả dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, xử lý theo công thức:

Trong đó: D : đường kính trung bình vòng vô khuẩn (mm)

D i: đường kính vòng vô khuẩn thứ i (mm)

s: độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n: số thực nghiệm tiến hành song song (thường n=3)

2.3.3 Phương pháp cải tạo và chọn giống

2.3.3.1 Phương pháp chọn chủng có HTKS cao bằng SLNN

 Mục đích: Chọn lọc ngẫu nhiên các cá thể có HTKS cao nhất so với các cá thể khác từ ống giống thuần khiết

 Tiến hành:

Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Steptomyces 182.15 cho

vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở nồng độ pha loãng 10-1 (định ước) Sau đó, pha loãng lần lượt đến

10-6 bằng nước vô trùng

Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở các nồng độ 10-4, 10-5, 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT1 trong đĩa Petri Dùng que

chang dàn đều hỗn dịch bào tử Tiến hành trên 3 đĩa cho mỗi nồng độ pha loãng Cho các đĩa vào ủ tủ ấm 280C trong 6 ngày cho xuất hiện khuẩn lạc mọc riêng rẽ

Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Sau 6 ngày chọn các khuẩn lạc đặc thù mọc riêng

rẽ, rồi lấy cấy zigzac (Hình PH.2), sau 5 - 6 ngày đem thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

2.3.3.2 Đột biến cải tạo giống bằng ánh sáng UV

 Mục đích: Cải tạo những chủng có HTKS cao sau SLNN nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp KS

 Tiến hành:

Pha hỗn dịch bào tử như phần sàng lọc ngẫu nhiên, được hỗn dịch bào tử ở nồng độ pha loãng 10-1 (định ước)

Sau đó, hút chính xác 1 ml hỗn dịch bào tử đem pha loãng đến nồng độ 10-6

để làm mẫu chứng, 9 ml còn lại đem đi đột biến

Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9 ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ

10-1 đổ ra đĩa Petri (không đậy nắp) được chiếu ánh sáng UV ( = 254 nm), khoảng cách 60 cm, thời gian 4 - 5 phút, sau đó lấy ra, để chỗ tối 2 h, rồi dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử sau đột biến và pha loãng đến nồng độ 10-4, 10-5bằng nước vô trùng

Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml mẫu chứng 10-6 và 0,1 ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở nồng độ 10-4, 10-5 vào các đĩa Petri có chứa sẵn MT1 sau đó dùng que chang vô trùng dàn đều, mỗi nồng độ pha loãng tiến hành trên 3 đĩa Các đĩa Petri sau đó được ủ ở nhiệt độ 280C trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc (Hình PH.2)

Đếm khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:

% độ sống sót = × 10 × 100 % Trong đó: Nm: trung bình số khuẩn lạc trong mẫu có nồng độ bào tử 10-k

No: trung bình số khuẩn lạc trong mẫu chứng

Tiến hành sàng lọc các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như phần SLNN Làm song song mẫu chứng Phần trăm biến đổi HTKS được xác định theo công thức:

% biến đổi HTKS = D × 100 % Trong đó:D : đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột

biến (mm)

Do: đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng (mm)

Sau đột biến, lựa chọn ra những chủng có đột biến dương cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo

2.3.3.3 Đột biến cải tạo giống bằng tác nhân hoá học HNO 2

 Mục đích: Cải tạo các chủng có HTKS cao sau đột biến UV để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp KS

 Nguyên tắc: HCl + NaNO2 = NaCl + HNO2

 Tiến hành:

Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 182.15 cho

vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng, lắc đều được nồng độ 10-1 (định ước), hút 1,0 ml pha loãng đến nồng độ 10-6 để làm mẫu chứng

Đột biến bằng acid nitrơ: 9 ml hỗn dịch bào tử còn lại được cho thêm

0,0621 g NaNO2 Điều chỉnh pH xuống 4,5 để 2 - 3 phút, chỉnh pH lên 7 - 8 bằng HCl 0,1N và NaOH 0,1N Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml pha loãng đến nồng độ

10-4, 10-5

Cấy bào tử sau đột biến: Làm tương tự đột biến UV Tính toán kết quả, chọn lọc các chủng tốt nhất tương tự đột biến UV để làm các nghiên cứu tiếp theo

2.3.4 Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh

 Nguyên tắc: Xác định các môi trường nuôi cấy bề mặt tối thích cho việc sản xuất kháng sinh

 Mục đích: chọn được chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất

để định hướng cho sản xuất công nghiệp

 Tiến hành:

Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 182.15 sau khi nuôi cấy trên

thạch nghiêng đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500 ml chứa 100 ml MTdt bằng 10 ml nước vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28 ± 0,10C, tốc độ quay 130 vòng/phút trong vòng 48 h

Sau 48 h, giống cấp 1 được cấy vô trùng sang các bình nón 500 ml chứa 100

ml MT1dt với tỷ lệ V giống : V môi trường = 1 : 10 Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28 ± 0,10C, tốc độ quay 130 vòng/phút trong vòng 120 h nữa (Hình PH.4)

Sau 120 h lọc bỏ sinh khối lấy dịch lên men thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch (Hình PH.3)

2.3.5 Các phương pháp chiết tách, tinh chế kháng sinh

2.3.5.1 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ

 Mục đích: Xác định pH và dung môi thích hợp để tách kháng sinh ra khỏi hỗn hợp dịch lọc lên men

 Tiến hành:

Kế thừa các nghiên cứu trước: tại pH = 3 kháng sinh có hoạt tính cao nhất và

ổn định nhất, với dung môi hữu cơ ethylacetat thì kháng sinh chiết được với hiệu suất cao nhất

Tiến hành chỉnh dịch lọc lên men về pH = 3 bằng HCl 0,1N và NaOH 0,1N Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với ethylacetat: Cho dịch lọc và dung môi vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi : V dịch lọc = 1 : 5 Sau đó lắc kỹ, để yên trong 1 h cho phân lớp Tách riêng lấy lớp dung môi và dịch lọc

Sau mỗi lần chiết, lớp dung môi và lớp nước được thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc (Hình PH.3)

2.3.5.2 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay

Pha dung môi hữu cơ thu được sau khi chiết dịch lên men được cô bằng máy cất quay chân không Cắn được cạo, hoà tan bằng methanol, tráng sạch cho vào đĩa Petri sạch khô, sấy, cân

2.3.5.3 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng SKLM

 Mục đích: Nhận biết sơ bộ mẫu thử có bao nhiêu thành phần

 Tiến hành:

Bản mỏng được hoạt hoá ở 1100C/30 phút Pha hỗn hợp dung môi theo đúng

tỷ lệ, để yên 30 phút cho bão hoà dung môi Dùng mao quản đường kính 0,2 - 0,5

mm chấm các phân đoạn lên trên bản mỏng, chấm 3 - 5 lần, để khô tự nhiên sau đó cho vào bình dung môi để chạy sắc ký

Xác định vết kháng sinh theo các phương pháp: Nhìn bằng mắt thường (những vết có màu), soi đèn tử ngoại, hiện màu hoá học, hiện hình VSV Hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt trùng, đổ một lớp mỏng môi trường kiểm định lên bề mặt bản mỏng Để tủ ấm 370C, ủ trong 18 - 24 h, vòng vô khuẩn xuất hiện nếu vết là kháng sinh

Tính hệ số Rf

2.3.5.4 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột

 Mục đích: Tinh chế và tách riêng các thành phần trong bột kháng sinh

 Chuẩn bị:

- Mẫu thử: Bột kháng sinh thu được sau khi cất quay chân không dịch chiết dung môi hữu cơ

- Dung môi: Pha đúng tỷ lệ

- Chuẩn bị cột: Đường kính cột 1cm, dài 50 cm, rửa sạch, tráng cồn, sấy khô

- Chất nhồi cột: Silicagel 60F254 Merck cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm Cân khoảng

6 - 8 g, hoạt hoá ở 1100C/30 phút rồi đưa lên cột

- Đưa mẫu thử lên cột: Bột kháng sinh thô được hoà tan trong một lượng tối thiểu methanol, rồi trộn với khoảng 1 g silicagel đã hoạt hoá Sấy khô ở

500C, cho lên cột để ổn định trong 30 phút

 Chạy cột: Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5 ml/phút Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch khô, 3 - 5 ml/một phân đoạn (Hình PH.5)

 Xác định các phân đoạn chính chứa kháng sinh cần tách: Thử HTKS các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc Các phân đoạn có HTKS được tiến hành chạy SKLM với hệ dung môi tách tốt nhất Các phân đoạn chính là các phân đoạn có vết Rf tương đương và có HTKS mạnh

Các phân đoạn chứa cùng một chất được gộp, cất quay, thu bột kháng sinh tinh khiết => kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi: hoà tan kháng sinh bằng một lượng tối thiểu hệ dung môi chạy sắc ký, sau đó thêm từ từ n-hexan tới khi dung dịch đục dần (khoảng 4 - 5 lần Vdung môi), để kết tinh qua đêm trong tủ lạnh => lọc, rửa, sấy khô ở 500C thu được KS tinh khiết

2.3.6 Sơ bộ xác định cấu trúc và tính chất kháng sinh thu được

Xác định một số đặc điểm vật lý: Màu sắc, hình dạng bột kháng sinh =>

Quan sát bằng mắt thường

Bột kháng sinh tinh khiết được đem đi đo các thông số:

- Nhiệt độ nóng chảy: Chuẩn bị mẫu, đo tại bộ môn Công nghiệp Dược, Đại học Dược Hà Nội

- Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Chuẩn bị mẫu và gửi đi đo tại các Trung tâm chức năng

Sơ bộ dự đoán cấu trúc kháng sinh: Biện giải công thức dựa vào các kết quả thu được

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM, NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh

3.1.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 182.15

Từ chủng giống Streptomyces 182.15 chúng tôi đã tiến hành SLNN trên môi

trường phân lập MT1, thu được 33 biến chủng và đem thử HTKS bằng phương

pháp khối thạch với VSV kiểm định (B.pumilus và S.flexneri) Bảng kết quả chi tiết

xem phụ lục bảng PB.2 Kết quả chính được trình bày ở bảng 3.1 dưới đây:

Bảng 3 1: Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên

Sau khi SLNN, nhận thấy 3 chủng SLNN.15; SLNN.18; SLNN.21 có HTKS

mạnh nhất trên cả hai VSV kiểm định => đem nhân giống, bảo quản để tiến hành

các nghiên cứu tiếp theo

3.1.2 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1

Tiến hành đột biến chủng SLNN.15 bằng ánh sáng UV = 254 nm, khoảng cách 60 cm, thời gian 5 phút Chúng tôi chọn được 33 biến chủng, tỷ lệ sống sót sau

đột biến là 0,260 % Tiến hành thử HTKS bằng phương pháp khối thạch với các

biến chủng trên thu được 8 biến chủng có HTKS tốt nhất được trình bày ở bảng 3.2, kết quả chi tiết được trình bày ở bảng PB.3 phần phụ lục:

Bảng 3 2: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1

Sau đột biến UV lần 1 của chủng SLNN.15, thu được biến chủng

ĐBUV1.26; ĐBUV1.23; ĐBUV1.29 có HTKS tăng mạnh sẽ được lưu giữ lại cho

các nghiên cứu tiếp theo Trong đó, biến chủng ĐBUV1.26 có HTKS tăng mạnh

nhất, trên B.pumilus (108,43 %), S.flexneri (105,45 %) => đem đột biến UV cải tạo

giống lần 2

3.1.3 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2

Đem biến chủng ĐBUV1.26 đột biến cải tạo lần 2 bằng ánh sáng UV Kết quả thu được sau đột biến có tỷ lệ sống sót là 0,769 % và 33 biến chủng đem đi thử

HTKS bằng phương pháp khối thạch thu được kết quả chi tiết trình bày ở bảng

PB.4 phần phụ lục, kết quả chính được trình bày ở bảng 3.3:

Bảng 3 3: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2

Sau đột biến UV cải tạo giống lần 2 từ biến chủng ĐBUV1.26 ta thu được

biến chủng ĐBUV2.12 có HTKS tăng lên trên cả B.pumilus (110,45 %) và

S.flexneri (105,70 %) Ba biến chủng ĐBUV2.12; ĐBUV2.8; ĐBUV2.10 có HTKS

mạnh nhất được giữ lại để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

3.1.4 Kết quả đột biến hoá học cải tạo giống lần 3

Chủng ĐBUV2.12 có HTKS mạnh nhất sau đột biến UV cải tạo giống lần 2

sẽ được đem đi đột biến hoá học bằng HNO2 Kết quả thu được có tỷ lệ sống sót sau

đột biến là 0,708 %, tiến hành thử HTKS thu được 8 biến chủng có HTKS mạnh nhất trình bày ở bảng 3.4:

Bảng 3 4: Kết quả thử HTKS sau đột biến hoá học

Đột biến hoá học từ biến chủng ĐBUV2.12 ta thu được biến chủng có hoạt

tính mạnh nhất là ĐBHH.15 với HTKS tăng lên ở cả B.pumilus (113,81 %) và

S.flexneri (106,71 % ) Ba biến chủng có HTKS mạnh nhất là ĐBHH.15;

ĐBHH.24; ĐBHH.2 được giữ lại cho các nghiên cứu tiếp theo

3.2 Kết quả lên men chọn môi trường nuôi cấy tối thích

Sử dụng MT1dt để tạo giống cấp 1, sau đó lên men trên 3 môi trường là MT1, MT2, MT6 để lựa chọn một môi trường nuôi cấy tối thích Dịch sau lên men được loại sinh khối và đem thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch thu được kết

quả ở bảng 3.5:

Bảng 3 5: Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men tối thích Môi trường

Nhận xét:

Kết quả lên men Streptomyces 182.15 trên MT1dt cho HTKS mạnh nhất =>

MT1dt là môi trường nuôi cấy tối thích, các nghiên cứu về sau sẽ được tiến hành

trên môi trường MT1

3.3 Kết quả chọn chủng lên men tốt nhất

Tiến hành lên men 11 biến chủng thu được từ SLNN, đột biến cải giống

Streptomyces 182.15 trên MT1dt Dịch lọc thu được sẽ loại bỏ sinh khối đem thử

HTKS bằng phương pháp giếng thạch thu được kết quả ở bảng 3.6:

Bảng 3 6: Kết quả thử HTKS chọn chủng lên men tốt nhất

Biến chủng

B.pumilus S.flexneri

SLNN.15 21,87 0,61 20,57 0,60 SLNN.21 21,26 0,26 20,38 0,79 ĐBUV1.23 23,69 0,27 21,98 0,14 ĐBUV1.26 23,66 0,32 22,21 0,47 ĐBUV1.29 23,29 0,39 21,36 0,33 ĐBUV2.8 24,23 0,46 22,07 0,26 ĐBUV2.10 24,13 0,29 22,09 0,65 ĐBUV2.12 24,51 0,46 22,19 0,48

ĐBHH.2 24,12 0,57 22,69 0,28

ĐBHH.24 24,75 0,24 23,04 0,13

Nhận xét:

Như vậy biến chủng ĐBHH.15 khi lên men dịch thể cho HTKS mạnh nhất

=> Đề tài chọn biến chủng ĐBHH.15 để tiến hành lên men sinh tổng hợp KS

3.4 Kết quả sắc ký

3.4.1 Kết quả chạy sắc ký lần 1

Dịch lọc các lần lên men gộp lại được 6,5 lít, đem chiết bằng dung môi

ethylacetate ở pH = 3 thu được 500 ml dịch chiết, cất quay thu được 0,5200 g KS

thô

Cho lượng kháng sinh thô trên chạy sắc ký cột với hệ dung môi butylacetate : aceton : triethylamin (1 : 2 : 1) Lấy 20 phân đoạn, 3 ml/1 phân đoạn cho vào ống nghiệm sạch, khô Thử HTKS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy

lọc tẩm kháng sinh Kết quả số liệu thu được ở bảng 3.7:

Bảng 3 7: Kết quả thử HTKS và SKLM sau chạy sắc ký cột lần 1

- HTKS tăng dần từ phân đoạn 2 đến phân đoạn 9 sau đó giảm dần đến phân

đoạn 16 Các phân đoạn chính là 6 - 9 có HTKS mạnh nhất

- Các phân đoạn vẫn chứa nhiều vết => hệ dung môi ta sử dụng chỉ có tác

dụng loại tạp, chưa tách riêng được chất

- Gộp các phân đoạn chính (6 - 9), cất quay chân không thu được 0,3700 g kháng sinh tinh chế lần 1

- Hiệu suất đạt 71,15 %, kháng sinh có màu đỏ sau khi loại tạp

3.4.2 Kết quả chạy sắc ký lần 2

Cho 0,3700 g kháng sinh tinh chế lần 1 cho chạy sắc ký với hệ dung môi ethylacetate : methanol : n-hexan (28 : 1 : 1), lấy 27 phân đoạn, mỗi phân đoạn 3ml, chấm SKLM chạy bằng chính hệ DM ethylacetat : methanol : n-hexan (28 : 1 : 1)

Phát hiện vết bằng mắt thường và hiện hình VSV bằng B.pumilus (Hình PH.6) Kết

quả Rf các phân đoạn như sau:

Bảng 3 8: Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 2 Phân đoạn R f vết 1 R f vết 2 R f vết 3 Ghi chú