Góp phần nghiên cứu kháng sinh do streptomyces 182 15 tổng hợp được

BỘ Y TẾ TRƯ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC C HÀ N NỘI  NGUYỄN THỊ THẢO Mã sinh viên: 1201545 GÓP PHẦN N NGHIÊN CỨU C U KHÁNG SINH DO STREPTOMYCES 182.15 TỔNG HỢP ĐƯỢC KHÓA LUẬN LU TỐT NGHIỆP DƯỢC CS SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THẢO Mã sinh viên: 1201545 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO STREPTOMYCES 182.15 TỔNG HỢP ĐƯỢC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh – Sinh học HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS TS Cao Văn Thu người thầy trực tiếp hướng dẫn từ ngày đầu bước vào nghiên cứu khoa học hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy công tác môn Vi sinh - Sinh học, môn Công nghiệp Dược trường Đại Học Dược Hà Nội; Khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội; Viện Công nghệ Dược phẩm quốc gia; Viện Hàn Lâm khoa học công nghệ Việt Nam; Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, hướng dẫn giúp đỡ hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ suốt năm năm học trường để có kiến thức kỹ cần thiết Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình nơi sinh ra, nuôi dưỡng dạy dỗ để có thành ngày hôm Cảm ơn người bạn, người em hỗ trợ đồng hành suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Do thời gian, phương tiện, kinh phí, kiến thức thân hạn chế, chắn khóa luận không tránh khỏi thiếu sót, mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô, bạn bè để khóa luận hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Sinh viên NGUYỄN THỊ THẢO MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh .2 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.1.5 Ứng dụng kháng sinh .3 1.1.6 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 1.2 Đặc điểm xạ khuẩn 1.2.1 Đặc điểm hình thái kích thước 1.2.2 Đặc điểm sinh lý dinh dưỡng 1.2.3 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 1.2.4 Phân loại xạ khuẩn 1.2.5 Khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces .5 1.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh 1.4 Cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn 1.4.1 Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn 1.4.2 Bảo quản giống xạ khuẩn .7 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh .7 1.5.1 Khái niệm lên men 1.5.2 Các phương pháp lên men 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 1.6 Chiết tách, tinh chế kháng sinh .9 1.6.1 Vai trò chiết tách tinh chế kháng sinh 1.6.2 Chiết xuất kháng sinh 1.6.3 Tách tinh chế kháng sinh 1.7 Sơ xác định cấu trúc kháng sinh 10 1.7.1 Phổ hồng ngoại (IR) 10 1.7.2 Phổ tử ngoại - khả kiếm (UV - VIS) 11 1.7.3 Phổ khối (MS) 11 1.7.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 11 1.8 Một số nghiên cứu liên quan đến Streptomyces 11 1.8.1 Nghiên cứu sinh hoá sản xuất kháng sinh từ chi xạ khuẩn Streptomyces: phân lập, lên men, tách chiết tính chất sinh học 11 1.8.2 Streptomyces vietnamensis sp Nov, streptomycete có sắc tố khuếch tán màu xanh tím phân lập từ đất Việt Nam 12 1.8.3 Có loại kháng sinh sản xuất streptomyces 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 14 2.1.1 Nguyên vật liệu 14 2.1.2 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 16 2.2 Nội dung nghiên cứu .17 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống 17 2.2.2 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh 17 2.2.3 Sơ xác định số tính chất cấu trúc kháng sinh thu 17 2.3 Phương pháp thực nghiệm 17 2.3.1 Nuôi cấy giữ giống xạ khuẩn 17 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán .17 2.3.3 Phương pháp cải tạo chọn giống 18 2.3.4 Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh 20 2.3.5 Các phương pháp chiết tách, tinh chế kháng sinh 21 2.3.6 Sơ xác định cấu trúc tính chất kháng sinh thu .23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM, NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh 24 3.1.1 Kết sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 182.15 .24 3.1.2 Kết đột biến UV cải tạo giống lần .24 3.1.3 Kết đột biến UV cải tạo giống lần .25 3.1.4 Kết đột biến hoá học cải tạo giống lần .26 3.2 Kết lên men chọn môi trường nuôi cấy tối thích 27 3.3 Kết chọn chủng lên men tốt 28 3.4 Kết sắc ký .29 3.4.1 Kết chạy sắc ký lần 29 3.4.2 Kết chạy sắc ký lần 30 3.4.3 Kết chạy sắc ký lần 31 3.5 Kết sơ xác định cấu trúc kháng sinh 32 3.5.1 Kháng sinh 32 3.5.2 Kháng sinh 36 3.5.3 Kháng sinh 37 3.6 Bàn luận 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .39 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT AND B.pumilus CDC CW CM D Dd ĐBUV1 ĐBUV2 ĐBHH L-DAP Dmhc Gr(+) Gr(-) HTKS IR ISP KS MC MS MT MTdt NMR S.flexneri S SKLM SLNN UV UV – VIS V v/v VK VSV Acid 2’-deoxyribonucleic Bacillus pumilus ATCC 6633 Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ) Cell wall (thành tế bào) Cytoplasmic membrane (màng tế bào chất) Đường kính trung bình vòng vô khuẩn Dung dịch Đột biến UV lần Đột biến UV lần Đột biến hoá học L-diaminopimelic acid Dung môi hữu Gram dương Gram âm Hoạt tính kháng sinh Ifrared (hồng ngoại) International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) Kháng sinh Mẫu chứng Mass Spectrometry (phổ khối) Môi trường Môi trường dịch thể Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) Shighella flexneri DT 112 Sai số thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh Sắc ký lớp mỏng Sàng lọc ngẫu nhiên Utra Violet (tử ngoại) Ultra Violet - Visible (tử ngoại - khả kiếm) Thể tích Thể tich/thể tích Vi khuẩn Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định .14 Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 14 Bảng 3: Các dung môi sử dụng .15 Bảng 4: Các hoá chất sử dụng .16 Bảng 1: Kết thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên 24 Bảng 2: Kết thử HTKS sau đột biến UV lần .25 Bảng 3: Kết thử HTKS sau đột biến UV lần .26 Bảng 4: Kết thử HTKS sau đột biến hoá học 27 Bảng 5: Kết thử HTKS chọn môi trường lên men tối thích 28 Bảng 6: Kết thử HTKS chọn chủng lên men tốt 28 Bảng 7: Kết thử HTKS SKLM sau chạy sắc ký cột lần 29 Bảng 8: Kết SKLM phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 30 Bảng 9: Kết SKLM phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 31 Bảng 10: Kết phổ IR KS1 33 Bảng 11: So sánh nhiệt độ nóng chảy, phổ UV KS1 Actinomycin X2 33 Bảng 12: So sánh phổ NMR KS1 Actinomycin X2 35 Bảng 13: Kết phổ IR KS2 36 Bảng 14: Kết phổ IR KS3 37 Bảng PB 1: Một số kháng sinh chủng Streptomyces tạo ra………… phụ lục Bảng PB 2: Kết thử HTKS sau SLNN phụ lục Bảng PB 3: Kết thử HTKS sau đột biến UV1 phụ lục Bảng PB 4: Kết thử HTKS sau đột biến UV2 phụ lục Bảng PB 5: Kết thử HTKS sau đột biến hoá học phụ lục DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình PH.1 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh Hình PH.2 Xạ khuẩn cấy zigzac đĩa Petri khuẩn lạc sau đột biến UV Hình PH.3 Thử HTKS phương pháp khối thạch, giếng thạch, khoanh giấy lọc Hình PH.4 Bình chứa dịch lên men Hình PH.5 Sắc ký cột sắc ký lớp mỏng Hình PH.6 Hiện hình VSV Hình PH.7 Kháng sinh tinh khiết Hình PH.8 Đo nhiệt độ nóng chảy KS2 KS1 Hình PH.9 Phổ tử ngoại hháng sinh Hình PH.10 Phổ tử ngoại kháng sinh Hình PH.11 Phổ tử ngoại kháng sinh Hình PH.12 Phổ khối kháng sinh Hình PH.13 Phổ khối kháng sinh Hình PH.14 Phổ hồng ngoại kháng sinh Hình PH.15 Phổ hồng ngoại kháng sinh Hình PH.16 Phổ hồng ngoại kháng sinh Hình PH.17 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân KS1 Hình PH.17 17: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân củaa kháng sinh Bảng PB 2: Kết thử HTKS sau SLNN Kết Biến chủng B.pumilus (mm) S.flexneri s (mm) s 21,57 0,72 20,31 0,51 20,71 0,32 20,38 0,20 20,73 0,61 20,62 0,19 21,83 0,15 20,60 0,85 20,20 1,10 20,21 0,29 18,32 0,96 18,19 1,08 21,22 1,17 20,34 1,70 22,62 0,65 21,84 0,41 20,85 0,64 21,97 0,36 10 19,98 0,85 19,53 0,81 11 22,17 0,70 21,14 0,75 12 20,08 0,59 20,14 0,41 13 20,50 0,89 20,75 0,37 14 20,10 1,59 19,81 1,28 15 24,59 0,45 23,19 0,50 16 21,17 0,38 20,67 0,47 17 20,83 0,61 20,39 0,97 18 23,59 0,43 22,37 0,28 19 21,83 0,32 21,45 0,15 20 20,83 1,00 20,10 0,71 21 24,22 0,43 22,09 0,09 22 20,81 0,74 20,48 0,68 23 21,90 0,39 20,98 0,94 24 20,79 0,29 20,73 0,95 25 22,15 0,13 20,97 0,24 26 20,44 0,99 19,98 0,59 27 18,81 1,39 17,53 0,64 28 21,70 0,36 21,43 0,14 29 20,19 0,65 19,90 0,56 30 20,85 0,65 20,91 0,46 32 20,47 1,60 19,99 0,23 33 22,56 0,27 19,93 0,47 Bảng PB 3: Kết thử HTKS sau đột biến UV1 Kết Biến B.pumilus (mm) S chủng S.flexneri % Biến đổi (mm) s HTKS % Biến đổi HTKS 23,97 0,70 102,74 21,99 0,48 99,91 24,09 0,23 103,26 21,79 0,25 99,03 21,53 0,54 92,29 20,48 0,45 93,06 23,26 0,53 99,69 22,55 0,55 102,48 22,42 1,50 96,09 21,03 0,50 95,55 24,33 0,85 104,26 21,32 0,62 96,88 23,89 0,53 102,40 20,06 0,32 100,24 24,61 0,88 105,49 22,17 0,95 100,76 23,78 0,92 101,91 21,33 0,60 96,91 10 22,24 1,29 95,31 20,68 0,79 93,97 11 24,13 0,42 103,40 22,71 0,66 103,21 12 21,82 0,38 93,51 19,85 0,38 90,18 13 23,99 0,75 102,80 22,61 0,52 102,74 14 21,05 0,45 90,23 19,65 0,73 89,31 15 21,73 0,55 93,14 19,66 0,55 89,34 16 23,82 0,98 102,09 22,32 0,82 101,42 17 22,66 0,76 97,11 20,28 0,59 92,15 18 21,83 0,47 93,57 18,67 1,79 84,82 19 23,03 0,42 98,69 22,13 0,76 100,58 20 22,35 0,42 93,94 21,92 0,79 101,54 21 23,53 0,82 100,83 22,05 0,60 100,18 22 23,60 0,60 101,14 20,12 0,43 91,43 23 25,03 0,44 107,29 22,91 0,43 104,09 24 23,92 0,21 102,51 22,18 0,60 100,79 25 23,82 0,76 102,09 22,29 0,41 101,30 26 25,30 0,32 108,43 23,21 0,37 105,45 27 23,29 0,86 99,83 22,13 0,68 100,58 28 21,84 0,99 93,60 19,35 0,59 87,94 29 24,76 0,21 106,11 22,53 0,36 102,36 30 23,33 0,48 100,00 22,19 0,48 100,82 31 22,32 0,27 95,66 19,89 0,04 90,37 32 21,25 0,50 91,09 19,29 0,33 87,67 33 22,30 0,33 95,57 21,39 0,31 97,21 MC 23,33 0,49 100,00 22,01 0,23 100,00 Bảng PB 4: Kết thử HTKS sau đột biến UV2 Kết Biến B.pumilus (mm) s chủng S.flexneri % Biến đổi (mm) s HTKS % Biến đổi HTKS 24,63 0,70 104,67 23,19 1,03 24,43 0,82 103,80 22,60 24,94 0,72 105,98 22,85 0,40 101,84 23,64 0,60 100,45 23,01 2,05 102,53 24,59 0,50 104,48 23,33 1,18 103,95 23,73 0,67 100,85 23,61 1,67 105,20 25,37 0,30 107,82 23,49 0,47 104,69 24,54 0,40 104,28 22,81 0,50 101,63 10 24,92 0,21 105,89 23,02 0,17 102,58 11 23,53 0,58 99,97 23,16 0,60 103,21 12 25,99 0,19 110,45 23,72 0,15 105,70 13 24,52 1,31 104,19 23,04 0,50 102,67 14 22,24 1,03 94,50 23,45 0,81 104,52 15 23,37 0,33 99,29 23,37 1,09 104,16 16 24,39 0,82 103,63 22,54 0,52 100,45 17 23,00 0,48 97,73 22,99 2,22 102,44 18 23,13 0,44 98,27 23,46 1,41 104,55 19 23,85 0,20 101,33 22,63 0,42 100,83 0,46 103,36 100,71 20 24,46 0,67 103,94 23,03 0,32 102,64 21 23,43 1,22 99,58 21,24 0,94 94,65 22 20,97 0,81 89,12 20,64 1,18 91,98 23 20,71 1,78 88,02 20,06 0,47 89,39 24 22,05 0,19 93,68 21,77 0,21 97,00 25 21,16 0,07 89,92 20,72 0,21 92,34 26 22,29 0,92 94,70 20,73 0,75 92,36 27 23,75 0,23 100,91 21,83 0,56 97,27 28 23,51 0,25 99,89 23,99 0,41 106,92 29 23,30 1,06 99,01 21,59 0,92 96,23 30 23,83 0,76 101,27 23,19 0,71 103,33 31 21,65 0,39 91,98 22,45 0,42 100,06 32 21,70 0,28 92,21 22,14 0,47 98,66 33 23,77 0,20 101,02 21,85 0,29 97,39 MC 23,53 0,39 100,00 22,44 0,31 100,00 Bảng PB 5: Kết thử HTKS sau đột biến hoá học Kết Biến B.pumilus (mm) s chủng S.flexneri % Biến đổi (mm) s HTKS % Biến đổi HTKS 25,90 0,59 105,37 23,02 0,28 100,23 26,99 0,78 109,79 23,85 0,91 103,86 24,13 0,47 98,18 22,85 0,20 99,48 25,82 0,56 105,04 23,13 0,49 100,70 24,57 0,55 99,96 23,09 0,58 100,52 24,39 1,06 99,24 22,83 0,73 99,39 22,59 0,49 91,89 18,84 0,33 82,03 24,94 0,21 101,46 22,51 0,29 98,00 23,45 0,69 95,42 21,00 0,51 91,44 10 26,09 0,59 106,16 23,51 0,42 102,38 11 24,92 0,41 101,38 22,62 0,27 98,49 12 22,54 0,95 91,70 19,85 0,57 86,42 13 25,26 1,25 102,77 23,03 0,43 100,26 14 23,90 0,85 97,23 22,25 1,19 96,89 15 27,97 0,21 113,81 24,51 0,66 106,71 16 25,32 0,43 103,01 23,15 0,57 100,78 17 23,55 0,25 95,82 21,35 1,28 92,98 19 24,65 0,34 100,27 23,03 0,90 100,26 20 25,06 0,38 101,95 23,52 0,36 102,41 21 26,23 0,51 106,70 23,29 0,52 101,39 22 24,68 0,32 100,41 22,52 0,77 98,06 23 24,73 0,64 100,60 23,26 0,50 101,28 24 27,31 0,63 111,12 24,59 0,42 107,08 25 24,10 0,39 98,05 21,65 0,57 94,25 26 24,63 1,28 100,19 22,03 0,82 95,94 27 24,15 0,73 98,24 22,15 0,64 96,46 28 25,13 0,52 102,22 22,68 0,61 98,75 29 24,57 0,38 99,95 21,94 0,38 95,53 30 25,01 0,58 101,76 22,37 0,72 97,42 31 25,03 0,51 101,84 23,14 0,04 100,75 33 24,54 0,57 99,84 23,22 0,49 101,10 MC 24,58 0,37 100,00 22,97 0,25 100,00 ... Mã sinh viên: 12 0154 5 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO STREPTOMYCES 182. 15 TỔNG HỢP ĐƯỢC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh – Sinh. .. dạng cấu trúc hoạt tính kháng khuẩn cao Do đó, môn Vi sinh - Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội chọn đề tài: “ Góp phần nghiên cứu kháng sinh Streptomyces 182. 15 tổng hợp được với mục tiêu: -... nhân nghiên cứu Hydro Carbon phổ biến [2], [33] Phối hợp phương pháp để biện giải cấu trúc kháng sinh 1.8 Một số nghiên cứu liên quan đến Streptomyces 1.8.1 Nghiên cứu sinh hoá sản xuất kháng sinh