Nghiên cứu kháng sinh do streptomyces 183 211 tổng hợp được

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỮU CHIẾN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO STREPTOMYCES 183.211 TỔNG HỢP ĐƯỢC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : ThS. Nguyễn Liên Hương Nơi thực hiện : Bộ môn Vi sinh - Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Liên Hương đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên đang giảng dạy, công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện hóa học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo, cán bộ nhân viên trong trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này. Do còn hạn chế về thời gian, phương tiện, kinh phí và trình độ của bản thân, chắc chắn khóa luận này không tránh khỏi thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô và bạn bè để khóa luận này được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, Ngày 12tháng 5 năm 2014 Sinh viên NGUYỄN HỮU CHIẾN MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Phân loại kháng sinh 2 1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3 1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh 3 1.1.5. Giới thiệu về tính kháng kháng sinh 3 1.1.6. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 4 1.2. Đại cương về xạ khuẩn. 4 1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4 1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces 5 1.2.3. Một số khóa phân loại của xạ khuẩn 5 1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 6 1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 6 1.3.1. Mục đích 6 1.3.2. Chọn giống có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên 6 1.3.3. Đột biến cải tạo giống 7 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn 8 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8 1.4.1. Khái niệm lên men 8 1.4.2. Các phương pháp lên men 9 1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 10 1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 10 1.5.2. Chiết xuất 11 1.5.3. Tinh chế 11 1.6. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 12 1.6.1. Phổ tử ngoại – khả kiến 12 1.6.2. Phổ hồng ngoại 12 1.6.3. Phổ khối MS 12 1.7. Geosmin và các chất bay hơi liên quan trong phản ứng sinh học – nuôi cấyStreptomyces citreus CBS109.60 13 1.8. Streptomyces vietnamensis sp. Nov, một streptomycete có sắc tố khuếch tán màu xanh tím phân lập được từ đất tại Việt Nam 13 1.9. Phân lập một polyene mới có phổ kháng nấm rộng từ Streptomyces sp. MTCC 5680 14 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15 2.1.1. Nguyên vật liệu 15 2.1.2. Máy móc, thiết bị 19 2.2.Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1. Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.211 19 2.2.2. Chọn lọc, cải tạo giống 19 2.2.3. Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh 20 2.2.4. Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được 20 2.3. Phương pháp thực nghiệm 20 2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20 2.3.2. Phân loại Streptomyces 183.211 theo ISP 20 2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 21 2.3.4. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 22 2.3.5. Sàng lọc ngẫu nhiên 23 2.3.6. Đột biến 23 2.3.7. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 24 2.3.8. Xác định độ bền nhiệt, pH của kháng sinh trong dịch lên men 25 2.3.9. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 25 2.3.10. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 26 2.3.11. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 26 2.3.12. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 26 2.3.13. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 27 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 28 3.1. Xác định tên khoa học của Streptomyces 183.211 28 3.2. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 29 3.3. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 30 3.4. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 31 3.5. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 32 3.6. Kết quả chọn môi trường lên men chìm 33 3.7. Kết quả chọn chủng lên men 33 3.8. Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt 34 3.9. Kết quả chọn dung môi và pH chiết xuất kháng sinh 35 3.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 36 3.11. Kết quả sắc ký cột lần 1 37 3.12. Kết quả sắc ký cột lần 2 38 3.13. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và đo phổ của kháng sinh 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40  Kết luận 40  Kiến nghị 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic DM Dung môi dd Dung dịch ĐB Đột biến Gr Gram Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm ISP InternationalStreptomyces project (Chương trình Streptomyces quốc tế) IR Hồng ngoại – Infrared HTKS Hoạt tính kháng sinh MC Mẫu chứng MS Phố khối – Mass spectrometry MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên UV Tử ngoại – Ultraviolet VSV Vi sinh vật B. subtilis Bacillus subtilis S. flexneri Shighella flexneri   Đường kính trung bình s Sai số chuẩn có hiệu chỉnh DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học Bảng 2.1:Các chủng VSV kiểm định Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.4: Các dung môi sử dụng Bảng 3.1: Các đặc điểm của Streptomyces 183.211 và Streptomyces citreus Bảng 3.2: Kết quả chọn môi trường nuôi cấy Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 3.4:Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1 Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2 Bảng 3.6: Kết quả chọn môi trường lên men chìm Bảng 3.7: Kết quả chọn chủng lên men Bảng 3.8: Kết quả thử độ bền với pH Bảng 3.9: Kết quả thử độ bền với nhiệt Bảng 3.10: Kết quả chọn dung môi và pH chiết Bảng 3.11: Kết quả sắc ký chọn hệ DM Bảng 3.12: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 1 Bảng 3.13: Kết quả sắc ký lớp mỏng của các phân đoạn sau chạy cột lần 2 Bảng P1: Một số kháng sinh do các chủng Streptomyces tạo ra DANH MỤC CÁC HÌNH Hình P1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh Hình P2: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn Hình P3: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn Hình P4: Hình ảnh hiển vi chuỗi bào tử của Streptomyces 183.211 Hình P5: Hình ảnh hiển vibề mặt bào tử của Streptomyces 183.211 Hình P6: Nuôi cấy xạ khuẩn bề mặt Hình P7: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch Hình P8: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc Hình P9: Thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch Hình P10: Bình chứa dịch lên men chọn môi trường Hình P11: Phổ UV-VIS Hình P12: Phổ IR Hình P13: Phổ MS 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ khi kháng sinh được tìm ra và ứng dụng rộng rãi thì đã có rất nhiều căn bệnh do vi khuẩngây ra từng được coi là nan y đã được chữa trị thành công. Nhưng các nghiên cứu gần đây cho thấy ngày càng có nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh kháng lại các kháng sinh có sẵn, nhiều kháng sinh trước đây đã không còn tác dụng trên một số chủng gây bệnh nữa. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra kháng sinh mới luôn là vấn đề cần thiết và luôn được cả thế giới quan tâm. Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ, khoa học kỹ thuật, kháng sinh mới thường được tổng hợp theo 3 hướng chính: tổng hợp hóa học, bán tổng hợp và sinh tổng hợp. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp kháng sinh rất đa dạng và phong phú có thể là vi khuẩn, xạ khuẩn hay vi nấm. Trong đó, chi xạ khuẩn Streptomyces có nhiều loài xạ khuẩn có khả năng tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và khả năng kháng khuẩn hơn cả. Ngoài ra một số loài trong chi này còn tổng hợp được các chất chữa ung thư. Do đó, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu kháng sinh do Streptomyces 183.211 tổng hợp được ”với mục tiêu sau: - Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.211. - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Xác định các điều kiện tối thích để lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh - Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được. 2 CHƯƠNG I:TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về kháng sinh 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, ) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp. [7], [13] 1.1.2. Phân loại kháng sinh Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về các đặc điểm khác . [5,7,14] Sau đây là một số nhóm kháng sinh phân loại theo cấu trúc hóa học :[5,7,14] Bảng 1.1 :Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học Nhóm kháng sinh Kháng sinh cụ thể  - lactam Penicillin, Cephalexin Phenicol Chloramphenicol Aminosid Streptomycin, Tobramycin Macrolid Erythromycin, Clarithromycin Lincosamid Lincomycin, Lindamycin Tetracyclin Tetracyclin, Doxycyclin Peptid Vancomycin, Polymycin Quinolon Floxacin, Levofloxacin Cotrimoxazol Cotrimoxazol [...]... của Streptomyces Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh nhất và có cấu trúc phức tạp Trong tổng số các kháng sinh đã tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% được tổng hợp từ Streptomyces Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn được trình bày ở bảng P1phần phụ luc.[4,13] 1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1 Mục đích Các VSV thuần chủng được. .. NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 3.1 Xác định tên khoa học của Streptomyces 183. 211 Nuôi cấy Streptomyces 183. 211 trên các môi trường ISP, đối chiếu với đặc điểm của một số chủng Streptomyces Kết quả so sánh được trình bày ở bảng sau: Bảng3.1: Các đặc điểm của Streptomyces 183. 211 và Streptomyces citreus Đặc điểm Streptomyces 183. 211 Streptomyces citreus Màu khuẩn ty khí sinh Y Y Màu khuẩn ty cơ chất 1 1 Sắc tố melanoid... que trang,giấy lọc, giấy thử pH, bông,… 2.2.Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183. 211 - Xác định các đặc điểm ISP của Streptomyces 183. 211 - So sánh với đặc điểm ISP của một số chủng Streptomyces để xác định tên khoa học của Streptomyces 183. 211 2.2.2 Chọn lọc, cải tạo giống - Lựa chọn MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 183. 211 - Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn các dạng... khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều.[4,10,13] Trong số hơn 16.000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khoảng 55-60% là do xạ khuẩn tạo ra Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzym (amylase, cellulose, protease…), cũng như các hợp chất... gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu.[13,14] 4 Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận Kháng thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng nòi VSV nhất định đối với một số kháng sinh nhất định nào đó Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính thấm tế bào, do các enzym vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa các con đường trao đổi... thuận lợi nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn 1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.5.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp Tùy vào đặc tính của loài vi sinh vật mà kháng sinh có thể nằm trong sinh khối hoăc trong... polyene mới có phổ kháng nấm rộng từ Streptomyces sp MTCC 5680 Một kháng sinh polyene macrolid mới PN0005 3được phân lập từ dịch lên men của Streptomyces sp.chủng MTCC - 5680 Chủng này được phân lập từ vùng đất núi màu mỡ ở Naldehra, Himachal Pradesh, Ấn Độ Hợp chất PN00053 đã được tinh khiết hóa thông qua các bước khác nhau của kỹ thuật sắc ký và sinh học, các đặc điểm của kháng sinhnày được xác định bằng... các enzym vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa các con đường trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác dụng.[13][14] 1.1.6 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh được giới thiệu ở hình P1 phần phụ lục [8,12] 1.2 Đại cương về xạ khuẩn Xạ khuẩn(Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên,... cao hoạt tính của Streptomyces 183. 211 20 2.2.3 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh - Từ 3 MT nuôi cấy bề mặt tốt nhất, chọn một MT lên men chìm tốt nhất - Từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn chủng(biến chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Tìm dung môi hữu cơ và pH chiết dịch kháng sinh tốt nhất - Tìm hệ DM khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất -... hoạt tính dương cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo 2.3.7 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh - Nguyên tắc: Xác định các MT nuôi cấy bề mặt tối ưu cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các MTdt tương ứng - Tiến hành: + Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 183. 211 sau khi nuôi cấy trên thạch nghiêng đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml . cứu kháng sinh do Streptomyces 183. 211 tổng hợp được ”với mục tiêu sau: - Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183. 211. - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. tạo ra nhiều kháng sinh nhất và có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% được tổng hợp từ Streptomyces. Một số kháng sinh có nguồn. khác mà hoạt chất không tác dụng.[13][14] 1.1.6. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh được giới thiệu ở hình P1 phần phụ lục. [8,12] 1.2. Đại