Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ streptomyces 184 29

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN ANH DŨNG Mã sinh viên: 1201100 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.29 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy giáo, PGS.TS Cao Văn Thu – ngƣời tận tình hƣớng dẫn em từ ngày đầu nghiên cứu khoa học tới hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy công tác Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Bộ môn Công nghiệp Dƣợc, Viện Công nghệ Dƣợc phẩm quốc gia trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội; Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ em trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu toàn thể Thầy Cô giáo, cán bộ, viên chức trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập trƣờng Cuối cùng, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm, động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nhƣ thực khóa luận Do thời gian làm thực nghiệm nhƣ kiến thức thân có hạn, khóa luận nhiều thiết sót Em mong nhận đƣợc đóng góp ý kiến từ thầy cô bạn bè để khóa luận đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2017 Sinh viên PHAN ANH DŨNG MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng xạ khuẩn 1.1.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn chi Streptomyces 1.1.2 Đặc điểm sinh lý 1.1.3 Khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 1.2 Đại cƣơng kháng sinh 1.2.1 Định nghĩa kháng sinh 1.2.2 Phân loại kháng sinh 1.2.3 Ứng dụng kháng sinh 1.3 Cải tạo giống xạ khuẩn tổng hợp kháng sinh 1.3.1 Sàng lọc ngẫu nhiên 1.3.2 Đột biến nhân tạo 1.3.3 Nghiên cứu điều kiện lên men 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Khái niệm 1.4.2 Các phƣơng pháp lên men 1.4.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình lên men 1.5 Chiết tách tinh chế kháng sinh 1.5.1 Chiết tách 1.5.2 Tinh chế kháng sinh 1.6 Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh đo phổ 1.6.1 Phổ hồng ngoại (IR) 1.6.2 Phổ tử ngoại (UV-VIS) 1.6.3 Phổ khối (MS) 10 1.6.4 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) 10 1.7 Một số nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 10 1.7.1 Phân lập xác định cấu trúc kháng sinh Strepturidin từ Streptomyces albus DSM 40763 10 1.7.2 Tối ƣu hóa môi trƣờng nuôi cấy Streptomyces sp.17944 cho việc sản xuất tirandamycin B, phân lập xác định cấu trúc tirandamycin H, I, J 11 1.7.3 Phân lập mô tả trình nuôi cấy Actinomycetes từ đất 11 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên liệu 13 2.1.1 Chủng vi sinh vật 13 2.1.2 Môi trƣờng 13 2.1.3 Hóa chất 15 2.1.4 Một số dụng cụ, máy móc 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phƣơng pháp thực nghiệm 17 2.3.1 Phƣơng pháp giữ giống ống nghiệm 17 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phƣơng pháp khuếch tán 17 2.3.3 Xác định môi trƣờng nuôi cấy thích hợp 19 2.3.4 Phƣơng pháp cải tạo giống 19 2.3.5 Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh 21 2.3.6 Chiết kháng sinh từ dịch lọc dung môi hữu 22 2.3.7 Thu bột kháng sinh thô phƣơng pháp cất quay 22 2.3.8 Phƣơng pháp tách thành phần kháng sinh phƣơng pháp sắc kí 22 2.3.9 Phƣơng pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 24 2.3.10 Phƣơng pháp xác định cấu trúc kháng sinh 24 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 25 3.1 Kết lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy VSV kiểm định 25 3.2 Kết chọn lọc ngẫu nhiên 25 3.3 Kết đột biến cải tạo giống 26 3.3.1 Kết đột biến UV lần 26 3.3.2 Kết đột biến UV lần 27 3.3.3 Kết đột biến hóa học 28 3.4 Kết lên men sinh tổng hợp kháng sinh 29 3.4.1 Chọn môi trƣờng lên men tốt 29 3.4.2 Lựa chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt 30 3.5 Dung môi pH chiết xuất 31 3.6 Kết sắc ký lớp mỏng 31 3.7 Kết sắc ký cột 32 3.7.1 Chạy cột lần 32 3.7.2 Chạy cột lần 34 3.7.3 Chạy cột lần 35 3.8 Sơ xác định cấu trúc, tính chất kháng sinh thu đƣợc 36 3.8.1 Kết đo phổ tử ngoại đo nhiệt độ nóng chảy 36 3.8.2 Kết đo phổ hồng ngoại 37 3.8.3 Kết đo phổ khối (MS) 38 3.8.4 Kết đo cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt/ký hiệu Cụm từ đầy đủ ARN Acid ribonucleic DMHC Dung môi hữu ĐB Đột biến ĐBHH Đột biến hóa học Gr(+) Gram dƣơng Gr(-) Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Infra Red (phổ hồng ngoại) KS Kháng sinh MS Mass Spectrometry (phổ khối) MT Môi trƣờng MTdt Môi trƣờng dịch thể NMR Nuclear magnetic resonance (cộng hƣởng từ hạt nhân) SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên s Sai số thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh UV Ultra Violet (tử ngoại) VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh……………………………………………………… Bảng 2.1 Các vi sinh vật kiểm định………………………………………………….13 Bảng 2.2 Môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn…………………………………………… 14 Bảng 2.3 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm định………………… 15 Bảng 2.4 Các dung môi hữu sử dụng nghiên cứu………………………… 15 Bảng 2.5 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu……………………………………16 Bảng 3.1 Kết chọn lọc ngẫu nhiên……………………………………………….25 Bảng 3.2 Kết đột biến UV lần 1………………………………………………….27 Bảng 3.3 Kết đột biến UV lần 2………………………………………………….28 Bảng 3.4 Kết đột biến hóa học………………………………………………… 29 Bảng 3.5 Kết chọn môi trƣờng lên men………………………………………….30 Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính dịch lên men dạng chủng, biến chủng…… 30 Bảng 3.7 Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi…………………………… 31 Bảng 3.8 Kết thử HTKS sau chạy cột lần 1…………………………………… 32 Bảng 3.9 Kết SKLM sau chạy cột lần 1………………………………………….33 Bảng 3.10 Kết SKLM sau chạy cột lần 2……………………………………… 34 Bảng 3.11 Kết SKLM phân đoạn sau chạy cột lần 3……………………… 35 Bảng 3.12 Kết đo phổ UV……………………………………………………… 36 Bảng 3.13 So sánh phổ NMR actinomyces X2 với chất KS1……………………40 ĐẶT VẤN ĐỀ “Vi khuẩn kháng thuốc phải nhanh chóng tìm biện pháp chữa trị phù hợp Nếu tình trạng tiếp diễn, chế tạo loại thuốc chữa bệnh kịp thời” Marie-Paule Kieny, trợ lý Tổng giám đốc lĩnh vực hệ thống y tế đổi WHO phát biểu ngày 27/2/2017 Thật vậy, kháng sinh đƣợc coi thần dƣợc chữa trị đƣợc bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm, nhƣng việc lạm dụng kháng sinh dẫn đến hậu nghiêm trọng mà phải đối mặt Kháng kháng sinh vấn đề cấp bách nhân loại Bởi vậy, việc liên tục nghiên cứu phát triển thuốc kháng sinh vô cấp thiết Trên 60% kháng sinh xạ khuẩn tạo chi Streptomyces chiếm khoảng 60% Chi xạ khuẩn chi lớn, đƣợc nhà khoa học đánh giá cao có khả sinh kháng sinh có tác dụng tốt Bộ môn Vi sinh – Sinh học trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội nhiều năm qua đầu tƣ nghiên cứu phát nhiều chủng xạ khuẩn có khả tổng hợp kháng sinh Để tiếp tục góp phần vào công tìm kiếm cải tạo giống kháng sinh lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 184.29” làm đề tài khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ Khóa luận mong muốn đạt đƣợc mục tiêu sau đây: Nghiên cứu cải tạo giống theo hƣớng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh Nghiên cứu lên men, chiết xuất tinh chế kháng sinh Streptomyces 184.29 tổng hợp Sơ xác định số đặc tính kháng sinh tinh chế PH10 Phổ hấp thụ tử ngoại KS2 PH11 Phổ hấp thụ tử ngoại KS3 PH12 Phổ hấp thụ hồng ngoại KS1 PH13 Phổ hấp thụ hồng ngoại KS2 PH14 Phổ hấp thụ hồng ngoại KS3 PH15 Kết đo phổ khối (MS) KS1 PH16 Kết đo phổ khối (MS) KS2 PH17 Kết đo cộng hưởng từ 1H NMR KS1 (1) PH18 Kết đo cộng hưởng từ 1H NMR KS1 (2) PH19 Kết đo cộng hưởng từ 1H NMR KS1 (3) PH20 Kết đo cộng hưởng từ 13C NMR – DEPT90, DEPT135 (1) PH21 Kết đo cộng hưởng từ 13C NMR– DEPT90, DEPT135 (2) PH22 Kết đo cộng hưởng từ 13C NMR (1) PH23 Kết đo cộng hưởng từ 13C NMR (2) PH24 Kết đo cộng hưởng từ 13C NMR (3) PH25 Kết đo cộng hưởng từ 13C NMR (4) ... 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu cải tạo giống làm tăng khả sản xuất kháng sinh xạ khuẩn - Nghiên cứu lên men, chiết xuất, tinh chế kháng sinh - Nghiên cứu số đặc tính kháng sinh tinh chế... theo hƣớng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh Nghiên cứu lên men, chiết xuất tinh chế kháng sinh Streptomyces 184. 29 tổng hợp Sơ xác định số đặc tính kháng sinh tinh chế CHƢƠNG I: TỔNG... sinh lựa chọn đề tài: Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 184. 29 làm đề tài khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ Khóa luận mong muốn đạt đƣợc mục tiêu sau đây: Nghiên cứu cải tạo giống theo