Góp phần nghiên cứu chất kháng sinh được sinh tổng hợp từ streptomyces 183.221

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  VŨ THỊ NGÀ MSV: 1101359 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU CHẤT KHÁNG SINH ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP TỪ STREPTOMYCES 183.221 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Hà Nội - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ NGÀ MSV: 1101359 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU CHẤT KHÁNG SINH ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP TỪ STREPTOMYCES 183.221 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh - Sinh học HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi tới thầy giáo, PGS.TS Cao Văn Thu- người thầy tận tình hướng dẫn em từ ngày nghiên cứu khoa học tới hoàn thành khóa luận tốt nghiệp- lời cảm ơn chân thành sâu sắc Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy công tác Bộ môn Vi sinh- Sinh học, Bộ môn công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội; Bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa học trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội; Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ em trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu toàn thể Thầy Cô giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập trường Cuối em xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm, động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực khóa luận Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận có nhiều thiếu sót Em mong nhận đóng góp ý kiến từ thầy cô bạn bè để khóa luận hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2016 Sinh viên VŨ THỊ NGÀ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .2 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh .2 1.1.2 Phân loại kháng sinh 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh .3 1.1.4 Ứng dụng kháng sinh 1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN 1.2.1 Đặc điểm hình thái kích thước .4 1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn .4 1.2.3 Đặc điểm xạ khuẩn chi streptomyces………………………… ……… 1.2.4 Phân loại streptomyces……………………………………………………… 1.2.5 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn…………………………… ……6 1.3 CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT .7 1.3.1 Mục đích 1.3.2 Phương pháp cải tạo bảo quản giống vi sinh vật 1.4 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH 1.4.1 Khái niệm lên men 1.4.2 Phương pháp lên men 1.5 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ 1.5.1 Chiết xuất kháng sinh (Chiết lỏng- lỏng) 1.5.2 Tách tinh chế kháng sinh 10 1.6 SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC KHÁNG SINH .11 1.6.1 Phổ hồng ngoại 11 1.6.2 Phổ UV-VIS 11 1.6.3 Phổ khối 11 1.6.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 11 1.7 Một số nghiên cứu gần liên quan đến kháng sinh, Streptomyces sp 12 1.7.1 Hoạt tính kháng khuẩn sản phẩm chuyển hóa Streptomyces AP-123 hiệu ứng độc tế bào 12 1.7.2 Phương pháp làm tăng sản lượng kháng sinh……………………………….12 1.7.3 Phương pháp làm tăng khả chống nấm nystatin tổng hợp từ Streptomyces noursei .12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………… 14 2.1 ĐỐI TƯỢNG 14 2.1.1 Giống vi sinh vật 14 2.1.2 Các môi trường nuôi cấy 14 2.1.3 Dụng cụ hóa chất 16 2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 17 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giống 17 2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán…………… 17 2.2.3 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 18 2.2.4 Chọn chủng có hoạt tính cao phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên 19 2.2.5 Phương pháp đột biến ánh sáng UV .19 2.2.6 Lên men chìm đánh giá hoạt tính kháng sinh dịch lên men 20 2.2.7 Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc dung môi hữu 21 2.2.8 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH kháng sinh……… .21 2.2.9 Phương pháp tách kháng sinh sắc ký 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 24 3.1 KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA STREPTOMYCES 183.221 TRÊN MT PHÂN LẬP - MT 24 3.2 KẾT QUẢ CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 24 3.3 KẾT QUẢ CẢI TẠO GIỐNG 26 3.3.1 Kết chọn lọc ngẫu nhiên 26 3.3.2 Kết đột biến 26 3.3.2.1 Kết đôt biến lần 26 3.3.2.2 Kết đột biến lần 27 3.4 KẾT QUẢ LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH 28 3.4.1 Chọn môi trường lên men tốt 28 3.4.2 Lựa chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt .29 3.5 ẢNH HƯỞNG CỦA pH, NHIỆT ĐỘ ĐẾN ĐỘ BỀN VỮNG KHÁNG SINH 29 3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 29 3.5.2 Ảnh hưởng pH 30 3.6 KẾT QUẢ CHỌN LỌC DUNG MÔI VÀ pH CHIẾT .30 3.7 KẾT QUẢ TÁCH KHÁNG SINH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 32 3.8 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ CỘT 33 3.9 SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA KHÁNG SINH 37 BÀN LUẬN 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic CM Màng tế bào chất - Cytoplasmic membrane CW Thành tế bào - Cell wall D Đường kính trung bình vòng vô khuẩn DD Dung dịch DMHC Dung môi hữu G(+) Gram dương G(-) Gram âm IR Infrared ( hồng ngoại ) KS Kháng sinh L-DAP L – diaminopimelat MS Mass Spectrometry (phổ khối ) MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể NMR Nuclear Magnetic Resonance NST Nhiễm sắc thể RF Rectiflexibile ( thẳng cong) s Sai số thực nghiệm chuẩn hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng UV Utra Violet ( tử ngoại ) VSV Vi sinh vật V Thể tích VL Vi lượng B subtilis Bacillus subtilis P mirabilis Proteus mirabilis DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Bảng Các chủng vi khuẩn kiểm định 14 Bảng 2 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 15 Bảng Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 16 Bảng 2.4 Các dung môi sử dụng 16 Bảng 3.1 Kết hoạt tính kháng sinh Streptomyces 183.221 MT2 24 Bảng 3.2 Kết lựa chọn MT nuôi cấy 25 Bảng 3.3 Kết chọn lọc ngẫu nhiên 26 Bảng 3.4 Kết đột biến lần 27 Bảng 3.5 Kết đột biến lần 28 Bảng 3.6 Kết chọn môi trường lên men 28 Bảng Kết chọn dạng chủng, biến chủng lên men Bảng Độ bền vững kháng sinh với nhiệt độ 29 30 Bảng Ảnh hưởng pH tới độ bền vững kháng sinh 30 Bảng 3.10 Kết lựa chọn hệ dung môi pH chiết kháng sinh 31 Bảng 3.11 Kết SKLM lựa chọn hệ dung môi 33 Bảng 3.12 Kết thử hoạt tính phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 34 Bảng 3.13 Kết SKLM phân đoạn 1- 13 34 Bảng 3.14 Kết thử hoạt tính phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.15 SKLM phân đoạn sau chạy cột lần 35 35 Bảng 3.16 Kết chạy cột lần 36 Bảng 3.17 Kết chạy cột lần 36 Bảng 3.18 Khối lượng hiệu suất kết tinh 37 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình P1: Một số dạng khuẩn ty cuống bào tử xạ khuẩn Hình P2: Sự hình thành chuỗi bào tử dài xạ khuẩn chi Streptomyces Hình P3: Chủng Streptomyces 183.221 sau cấy zigzag đĩa petri sau ngày tủ ấm 28o C Hình P4: Kết thử hoạt tính kháng sinh với chủng vi khuẩn B subitilis Hình P5: Hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn sau đột biến Hình P6: Hình ảnh bình nhân giống cấp lên men chọn chủng Hình P7: Chạy sắc kí cột Hình P8: Đồ thị thể ảnh hưởng pH đến độ bền vững kháng sinh Hình P9: Phổ UV – VIS Hình P10: Phổ MS Hình P11: Phổ IR Hình P12: Phổ NMR ĐẶT VẤN ĐỀ Vấn đề kháng kháng sinh mang tính toàn cầu đặc biệt trội nước phát tiển với gánh nặng bệnh nhiễm khuẩn chi phí bắt buộc cho việc thay kháng sinh cũ kháng sinh đắt tiền Tổ chức y tế giới WHO cho kháng kháng sinh "là mối nguy lớn y tế công cộng toàn cầu mà cần hành động để giải chúng" Có thể nói rằng, vi khuẩn phơi nhiễm nhiều với kháng sinh “sức ép thuốc” lớn, chủng kháng thuốc có nhiều hội để phát triển lây lan Mặc dù kháng kháng sinh vấn đề thuộc y tế, sức ép thuốc yếu tố nội quan trọng thúc đẩy phát triển gia tăng tình trạng kháng kháng sinh Tuy nhiên, vấn đề chịu chi phối nhiều lĩnh vực khác bao gồm yếu tố sinh thái học, dịch tễ học, văn hoá-xã hội kinh tế Nhiệm vụ thiết đặt không với lĩnh vực nghiên cứu y học, công nghiệp kháng sinh nói riêng mà nhiệm vụ toàn nhân loại nói chung tìm kháng sinh để giải tạm thời triệt để nạn kháng thuốc Để góp phần vào công tìm chất kháng sinh mới, chọn đề tài:“Góp phần nghiên cứu chất kháng sinh sinh tổng hợp từ Streptomyces 183.221” với mục tiêu: - Cải tạo giống nhằm nâng cao khả tổng hợp KS Streptomyces 183.221 - Nghiên cứu lên men, chiết xuất tinh chế KS Streptomyces 183.221 tổng hợp - Xác định sơ cấu trúc kháng sinh 38 aldehyd 3053,32 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H alken nhân thơm 3253,91 cm-1; 3354,21 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H amid, amin bậc1 3.9.4 Phổ MS Phổ MS chất KS1 giới thiệu hình P11 phần phụ lục Phổ MS đo phương pháp EI+ ( bắn phá electron) cho phép xác định khối lượng phân tử chất kháng sinh 1254,60 dalton 3.9.5 Phổ NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) giới thiệu hình P13, kết đo HNMR cho thấy công thức phân tử kháng sinh có 86 nguyên tử H Kết đo NMR ( 13 C + DEPT) cho ta kết luận sơ cấu trúc phân tử chất kháng sinh K1 có : 45 nhóm - CH2 ; 27 nhóm -CH - CH3 39 BÀN LUẬN Chọn lọc cải tạo giống Môi trường thích hợp cho Streptomyces 183.221 phát triển MT2 vi khuẩn sử dụng cho thử nghiệm B subtilis P mirabilis Sau sàng lọc ngẫu nhiên đột biến tác nhân UV, hoạt tính kháng sinh ổn định tăng lên đáng kể so với chủng mà tiến hành nghiên cứu tiếp Tuy nhiên để nâng cao hiệu đột biến sử dụng thêm tác nhân đột biến khác như: đột biến hóa học, đột biến tác nhân vật lý khác…hoặc tiến hành sàng lọc gen hoạt hóa Streptomyces để nâng cao hiệu suất tổng hợp KS Do hạn hẹp thời gian vật chất nên khóa luận chưa thể thực nghiên cứu theo hướng nên xin đề xuất nên có nghiên cứu sâu Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tối thích Kết lên men cho thấy biến chủng ĐB2 (2.3.19) chủng có khả sinh tổng hợp kháng sinh tốt môi trường MT2dt, chiết xuất KS phương pháp chiết dung môi hữu cơ, dung môi chiết thích hợp Ethylacetat pH= 7, nhiên phải chiết lặp lại lần chiết kiệt kháng sinh KS thu không bền với nhiệt để lâu hoạt tính KS giảm nên trình tách chiết tránh thực nhiệt độ cao chiết sau thu dịch lên men.Tiến hành tinh chế kháng sinh phương pháp chạy sắc kí cột với mục đích loại tạp Tuy nhiên hiệu suất loại tạp chưa cao, cần nâng cao hiệu suất tinh chế KS việc tối ưu hóa điều kiện chạy sắc kí cột Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh Khóa luận xác định chất KS1 có nhiệt độ nóng chảy 210,6oC, khối lượng phân tử 1254,60 dalton, có liên kết C – H; C= C; C=O; N-H;… công thức phân tử có 86 nguyên tử H, 45 nhóm - CH2 ; 27 nhóm -CH - CH3 Có thể thấy cấu trúc phân tử KS1 phức tạp, giới hạn trình độ thời gian nên khóa luận chưa đủ liệu để xếp KS vào nhóm Vì cần tiến hành tiếp nghiên cứu để định danh KS 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Qua trình nghiên cứu bản, hoàn thành mục tiêu đề rút số kết luận sau: - Cải tạo giống nhằm nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh treptomyces 183.22 Streptomyces 183.221 phân lập từ chất Việt Nam, qua trình cải tạo chọn giống thu biến chủng có khả sinh tổng hợp kháng sinh tăng mạnh chủng gốc chủng mà tiến hành nghiên cứu tiếp - Nghiên cứu lên men, chiết xuất tinh chế KS Tiến hành lên men biến chủng ĐB2(2.3.19) môi trường MT2dt, chiết phương pháp sử dụng DMHC, dung môi chiết thích hợp Ethylacetat pH=7 chiết lặp lần Kháng sinh thu không bền với nhiệt, bền pH trung tính, tinh chế sắc kí cột sử dụng silicagel với hệ dung môi thích hợp, kết tinh thu 0,2060g bột KS thô màu đỏ - Xác định sơ cấu trúc KS Chất KS1 thu có tính chất sau: tonc= 210,6oC, khối lượng phân tử 1254,60 dalton, công thức phân tử có liên kết C – H; C= C; C=O; NH;…Phổ NMR cho ta sơ kết luận chất KS1 có 86 nguyên tử H, 45 nhóm - CH2 ; 27 nhóm -CH - CH3 ĐỀ XUẤT - Để nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục tiến hành đột biến bậc thang kết hợp phương pháp di truyền phân tử - Tối ưu hóa điều kiện lên men, lên men quy mô lớn sau chiết xuất tinh chế nhằm thu kháng sinh để tiến hành xác định cấu trúc, tính chất lý hóa - Tiến hành nghiên cứu sâu công thức cấu tạo chất KS1, làm thêm test phổ NMR, nhiễu xạ tia X… - Nghiên cứu khả ứng dụng thực tế kháng sinh Streptomyces 183.221 tổng hợp, thử tác dụng sinh học in vivo, in vitro, xác định MIC… TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ môn hóa Dược (1998), Hóa Dược II, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 37-54 Bộ môn hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 23-69, 125-147, 215-219, 318 Bộ Y tế (2007), Dược lý học, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tập 2, tr 130142 Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Kiều Hữu Ảnh (1999), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 167-172 Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ len men chất kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật Y học, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 15-16, 50-56 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục, Hà Nội, tr 38-40 Đỗ Thu Hà cộng (1999), Vấn đề kháng kháng sinh vi khuẩn, NXB Y học 10 Phạm Thị Hạnh (2010), Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 119.112, Luận văn thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội 11 Lương Thị Hương Giang (2011), Tuyển chọn nghiên cứu hoạt tính sinh học số chủng xạ khuẩn phân lập núi Pháo- Đai Từ- Thái nguyên, Khóa luận tốt nghiêp, Trường Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên, Thái Nguyên 12 Lê Đình Lương, Phan cự Nhân (2000), Cơ sở di truyền học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 40-49 13 Nguyễn Khang (2005), Kháng sinh học ứng dụng, NXB Y học Hà Nội, Hà Nội 14 Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở Công nghệ sinh học sản xuất Dược phẩm, NXB Y học Hà Nội 15 Từ Minh Koóng, Đàm Thanh Xuân(2006), Kỹ thuật sản xuất Dược phẩm, tập II, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 26-40, 81-93 16 Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 185-191 17 Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách, phân chia, xác định chất dung môi hữu cơ, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập 1, tr 9-27 18 Cao Văn Thu, Bùi Việt Hà, Quách Thị Lê Hà, Nguyễn Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Thúy Hiền, Phan Văn Kiệm, Võ Thị Linh, Vũ Nguyên Thành, Võ Thị Thu Thủy, “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces15.29Streptomyces microflavus”, Tạp chí khoa học công nghệ,Tập 48, số 5, 2010 Tr 105-111 19 Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR phân tích hữu cơ, NXB Đại học Quốc Gia TP HCM TIẾNG ANH 20 M.V Arasu, V Duraipandiyan, S Ignacimuthu (2012), Antibacterial and antifungal activities of polyketide metabolite from marine Streptomyces sp AP123 and its cytotoxic effect, Department of Biological Environment and Chemistry, College of Agriculture and Life Sciences, Chungnam National University [pubmed] 21 T.Brautaset T, H Sletta (2011) , New nystatin-related antifungal polyene macrolides with altered polyol region generated via biosynthetic engineering of Streptomyces noursei, Department of Biotechnology, SINTEF Materials and Chemistry, Trondheim, Norway 22 Masoud Ataiekhorasgani, Nasim Jafaripozve, Omid Zaerin (2014) “Streptomyces infection in Cushing syndrome: A case report and literature review”, Department of Internal Medicine, School of Medicine, Isfahan University of Medical Science, Isfahan, Iran [pubmed] 23 L Pavia, M Lampman, S Kriz (2008), Introduction to Spectrocopy, pp 13- 100 24 T Murakami, J Burian, Koji Yanai, Mervyn J Bibb, (2011), “ novel system for the amplification of bacterial geneclusters multiplies, antibiotic yeild in Streptomyces coeliolor” , Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada [pubmed] 25 E.B.Shirling and D.Gottlied (1996), “ Methods for characterization of Streptomyces speacis”, International Journal of systematic Bacteriology, Vol.16 No pp 313-340 PHỤ LỤC Hình P1: Một số dạng khuẩn ty cuống bào tử xạ khuẩn Hình P2: Sự hình thành chuỗi bào tử dài xạ khuẩn chi Streptomyces Hình P3: Chủng Streptomyces 183.221 sau cấy zigzag đĩa petri sau ngày tủ ấm 28o C Hình P4: Kết thử hoạt tính Hình P5: Hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn kháng sinh với chủng vi khuẩn B sau đột biến subitilis Hình P6: Hình ảnh bình nhân giống cấp lên men chọn chủng Hình P7: Chạy sắc kí cột Hình P8: Đồ thị thể ảnh hưởng pH đến độ bền vững kháng sinh Hình P9: Phổ UV- VIS Hình P10: Phổ MS Hình P11: Phổ IR Hình P12: Phổ NMR