Nghiên cứu kháng sinh được sinh tổng hợp từ streptomyces 183 221

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TẠ THỊ KHUYÊN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP TỪ STREPTOMYCES 183.221 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI- 201 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TẠ THỊ KHUYÊN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP TỪ STREPTOMYCES 183.221 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh - Sinh học HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy giáo, PGS.TS Cao Văn Thu- người đã tận tình hướng dẫn em từ những ngày đầu tiên nghiên cứu khoa học tới khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên giảng dạy công tác tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học, Bộ môn công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội; Bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa học trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội; Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các Thầy Cô giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập tại trường. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện khóa luận này. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ thầy cô và bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2014. Sinh viên TẠ THỊ KHUYÊN MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Phân loại kháng sinh 2 1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3 1.1.4 . Ứng dụng của kháng sinh 3 1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN ( Actinomycetes) 4 1.2.1. Đặc điểm hình thái và kích thước 4 1.2.2. Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn 4 1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 5 1.2.4. Phân loại Streptomyces 6 1.2.5. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 6 1.3. CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT 7 1.3.1. Mục đích 7 1.3.2. Phương pháp cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật 7 1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH 9 1.4.1. Khái niệm lên men 9 1.4.2. Phương pháp lên men 9 1.5. CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ 10 1.5.1. Chiết xuất kháng sinh ( Chiết lỏng- lỏng) 10 1.5.2. Tách và tinh chế kháng sinh 11 1.6. SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC KHÁNG SINH 12 1.6.1. Phổ hồng ngoại 12 1.6.2. Phổ UV-VIS 12 1.6.3. Phổ khối 12 1.7. Một số nghiên cứu gần đây liên quan đến kháng sinh, Streptomyces sp. 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. ĐỐI TƯỢNG 15 2.1.1. Giống vi sinh vật 15 2.1.2. Các môi trường nuôi cấy 15 2.1.3. Dụng cụ và hóa chất 18 2.2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 19 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống 19 2.2.2. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP 20 2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 21 2.2.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 22 2.2.5 . Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên 22 2.2.6. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV 22 2.2.7. Lên men chìm và đánh giá hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men 23 2.2.8. Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ 24 2.2.9. Phương pháp xác định kháng sinh nội bào, ngoại bào 24 2.2.10. Phương pháp xác đinh độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh 24 2.2.11. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 27 3.1 NGHIÊN CỨU TÊN KHOA HỌC CỦA STREPTOMYCES 183.221 27 3.2. KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA STREPTOMYCES 183.221 TRÊN MT PHÂN LẬP- MT 2 28 3.3. KẾT QUẢ CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 28 3.4. KẾT QUẢ CẢI TẠO GIỐNG 29 3.4.1. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 29 3.4.2. Kết quả đột biến 30 3.5. KẾT QUẢ LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH 31 3.5.1. Chọn môi trường lên men tốt nhất 31 3.5.2. Lựa chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất 32 3.6. ẢNH HƯỞNG CỦA pH, NHIỆT ĐỘ ĐẾN ĐỘ BỀN VỮNG KHÁNG SINH 33 3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 33 3.6.2. Ảnh hưởng của pH 33 3.7. KẾT QUẢ CHỌN DUNG MÔI VÀ pH CHIẾT 34 3.8. KẾT QUẢ TÁCH KHÁNG SINH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 35 3.9. KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ CỘT 36 3.10. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM 39 3.11. SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA KHÁNG SINH 40 3.11.1. Nhiệt độ nóng chảy của K1 40 3.11.2. Phổ UV của chất K1 40 3.11.3. Phổ IR 40 3.11.4. Phổ MS 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Acid 2’-deoxyribonucleic CW Thành tế bào - Cell wall D  Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn, vô nấm DD Dung dịch DMHC Dung môi hữu cơ G(+) Gram dương G(-) Gram âm IR Infrared ( hồng ngoại ) ISP International Streptomyces Project ( Chương trình Streptomyces Quốc tế ) KS Kháng sinh L-DAP L – diaminopimelat MS Mass Spectrometry (phổ khối ) MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể NST Nhiễm sắc thể RF Rectiflexibile ( thẳng hơi cong) s Sai số thực nghiệm chuẩn đã hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng UV Utra Violet ( tử ngoại ) VSV Vi sinh vật V Thể tích VL Vi lượng B. subtilis Bacillus subtilis P. mirabilis Proteus mirabilis DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn 7 Bảng 2. 1. Các chủng vi khuẩn kiểm định 15 Bảng 2. 2. Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 15 Bảng 2. 3. Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 17 Bảng 2. 4. Môi trường phân loại xạ khuẩn theo ISP 17 Bảng 2. 5. Các dung môi sử dụng 18 Bảng 3. 1. Đặc điểm theo ISP của Streptomyces 183.221 và Streptomyces flavescens 27 Bảng 3. 2. Kết quả hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 183.221 trên MT2. 28 Bảng 3. 3. Kết quả lựa chọn MT nuôi cấy 28 Bảng 3. 4. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên. 29 Bảng 3. 5. Kết quả đột biến lần 1 30 Bảng 3. 6. Kết quả đột biến lần2 31 Bảng 3. 7. Kết quả chọn dạng chủng, biến chủng lên men 32 Bảng 3. 8. Độ bền vững của kháng sinh với nhiệt độ 33 Bảng 3. 9. Ảnh hưởng của pH tới độ bền vững kháng sinh 33 Bảng 3. 10. Kết quả lựa chọn dung môi và pH chiết kháng sinh. 34 Bảng 3. 11. Chiết kháng sinh bằng Ethylacetat ở pH= 7, chiết lặp 2 lần 35 Bảng 3. 12. Kết quả SKLM lựa chọn hệ dung môi 36 Bảng 3. 13. Kết quả thử hoạt tính của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 1 37 Bảng 3.14. Kết quả SKLM các phân đoạn 1- 12 37 Bảng 3. 15. Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn sau chạy cột lần 2 38 Bảng 3. 16. SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 2 38 Bảng 3.17. Kết quả chạy cột lần 3 39 Bảng 3. 18. Kết quả R f của các chất thu được 39 Bảng 3. 19. Khối lượng và hiệu suất kết tinh 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1: Kết quả chọn MT lên men. Hình P1: Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn. Hình P2: Sự phát triển của khuẩn ty ở xạ khuẩn. Hình P3: Đường cong sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Hình P4: Hình ảnh chuỗi bào tử Streptomyces 183.221. Hình P5: Hình ảnh bề mặt chuỗi bào tử Streptomyces 183.221. Hình P6: Kết quả đột biến lần 1. Hình P7: Hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn sau đột biến 2. Hình P8: Kết quả lựa chọn MTdt lên men. Hình P9: Hình ảnh bình nhân giống cấp 1 trong lên men chọn chủng. Hình P10: Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn chạy cột sắc ký lần 1. Hình P11: Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn chạy cột sắc ký lần 2. Hình P12: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh. Hình P13: Phổ UV. Hình P14: Phổ khối. HìnhP15: Phổ I [...]... đã thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới Để góp phần vào công cuộc tìm ra các chất kháng sinh mới, tôi chọn đề tài : Nghiên cứu kháng sinh được sinh tổng hợp từ Streptomyces 183. 221 với mục tiêu:  Phân loại định tên khoa học Streptomyces 183. 221 theo ISP  Cải tạo giống nâng cao khả năng tổng hợp KS của Streptomyces 183. 221  Nghiên cứu lên men,... nhóm kháng sinh mới, làm cho chúng ta đang phải đối mặt với “kỷ nguyên hậu kháng sinh (post antibiotic era) Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra của ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: một mặt cải biến các kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển (R&D) để tìm ra các chất kháng sinh mới với các cơ chế tác động mới hoàn toàn Vì vậy Công nghiệp kháng sinh. .. Co-trimoxazol Ngoài ra KS có thể được phân loại theo dược động học – dược lực học và theo nguồn gốc 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh [1], [4], [5]  Ức chế tổng hợp vách tế bào VK  Tác động lên quá trình tổng hợp protein của VK  Ức chế tổng hợp acid nucleic  Thay đổi tính thấm của màng sinh chất  Kháng chuyển hóa ( ức chế tổng hợp acid folic) 1.1.4 Ứng dụng của kháng sinh [10], [12], [14] 1.1.4.1... tăng hoạt tính kháng nấm trong khi giảm các hoạt động tan huyết 15 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG 2.1.1 Giống vi sinh vật * Chủng xạ khuẩn Giống xạ khuẩn Streptomyces 183. 221 được phân lập từ mẫu đất Quận 9 Tp HCM tại bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, có khả năng sinh tổng hợp KS, phổ tác dụng rộng, đặc tính di truyền ổn định *Chủng vi sinh vật kểm định... khuẩn (bactericidal) ở nồng độ thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các KS tự nhiên 1.1.2 Phân loại kháng sinh [1], [4], [7], [12] a Dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh Có thể phân các KS thành: KS diệt khuẩn, KS kìm khuẩn… b Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh Dựa vào cơ chế tác dụng, chia thành các nhóm:  Thuốc ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: β – lactam,... về sự hình thành chất KS từ xạ khuẩn Có 3 con đường sinh tổng hợp KS ở xạ khuẩn:  KS được tổng hợp từ 1 chất trao đổi bậc I, qua 1 chuỗi phản ứng enzym  KS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc I khác nhau 7  KS được hình thành bằng cách polime hóa các chất trao đổi bậc I, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều... 183. 221  Nghiên cứu lên men, chiết xuất tinh chế KS do Streptomyces 183. 221 tổng hợp  Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh tinh chế 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh [1], [4] [7] Có nhiều định nghĩa khác nhau về KS Hiện nay, giới y học quan niệm rằng: KS là những chất tạo thành do chuyển hóa sinh học, có tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn... (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Tín hiệu tương ứng với các ion được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành phổ khối (MS) 1.7 Một số nghiên cứu gần đây liên quan đến kháng sinh, Streptomyces sp 1.7.1 Hoạt tính kháng. .. thuốc KS là tăng hiệu suất sinh tổng hợp KS GS Bibb và các cộng sự đã nghiên cứu áp dụng phương pháp tái tổ hợp ADN, đồng thời khuếch đại các cụm gen cụ thể chịu trách nhiệm trong sản xuất KS, góp phần nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp KS Nghiên cứu chứng minh rằng các yếu tố di truyền được xác định trong S.kanamyceticus có thể khuếch đại từ 4 đến 12 lần một phân đoạn cụ thể của ADN trong S coelicolor có... ra khả năng kháng khuẩn của nấm Penicilium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh Năm 1938, Florey và Chain đã thực nghiệm penicillin trong điều trị Thị trường chất kháng sinh trên thế giới phát triển và tăng mạnh trong những năm gần đây cho thấy tiềm năng to lớn của ngành công nghệ kháng sinh trong nền kinh tế quốc dân Đồng thời sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc . tìm ra các chất kháng sinh mới, tôi chọn đề tài : Nghiên cứu kháng sinh được sinh tổng hợp từ Streptomyces 183. 221 với mục tiêu:  Phân loại định tên khoa học Streptomyces 183. 221 theo ISP KHUYÊN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP TỪ STREPTOMYCES 183. 221 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh - Sinh học . cao khả năng tổng hợp KS của Streptomyces 183. 221.  Nghiên cứu lên men, chiết xuất tinh chế KS do Streptomyces 183. 221 tổng hợp.  Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh tinh chế.