A. Sắc ký lớp mỏng
+ Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 110oC/ 30 phút. Dung môi pha đúng theo tỷ lệ, đổ vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để bão hòa trong 30 phút. Chấm dịch chiết DMHC lên bản mỏng, cách mép dưới 1,5cm; cách mép bên 1cm, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 40- 50oC.
+ Khai triển sắc ký: Đặt bản mỏng vào bình sắc ký, khi dung môi chạy đến 3/4 bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu vết dung môi chạy (dm).
+ Hiện sắc ký đồ:
- Soi đèn UV: Bản mỏng sắc ký tráng sẵn đã trộn với một chất phát huỳnh quang dưới ánh sáng UV. Nếu có chất thử sẽ cho màu thẫm dưới đèn tử ngoại.
- Hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng, đổ MT có cấy VSV kiểm định, để tủ 37oC/18-24h. Vết kháng sinh được xác định dựa vào vòng vô khuẩn.
- Phương pháp hiện hình bằng thuốc thử hóa học: Bản mỏng đã chạy sắc ký đem sấy khô rồi nhỏ Ninhydrin 1% lên bản mỏng, sau 3 phút đưa sấy ở 700C rồi quan sát bằng mắt thường, đo Rf. Nếu trùng với Rf của VSV thì kết luận kháng sinh phát hiện được bằng thuốc thử hóa học.
+ Tính Rf :
Rf =
dv: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết.
ddm: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến đường dung môi chạy. B. Sắc ký cột:
+ Chuẩn bị:
Mẫu thử: Bột KS thô thu được sau khi cất quay dịch chiết DMHC.
Dung môi: Pha đúng theo tỷ lệ.
Chất nhồi cột: Silicagel 60 F 254 Merck cỡ hạt 0,040-0,063mm. Cân khoảng 8g hạt, hoạt hóa ở 110oC/ 30 phút. Hòa thành hỗn dịch với dung môi chạy rồi đưa dần lên cột.
Đưa mẫu thử lên cột: Bột KS thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol, rồi trộn với khoảng 2g Silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50oC cho bay hết methanol thì cho lên cột để ổn định cột trong 30 phút.
+ Chạy cột: Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5 ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch (đã tráng cồn để khô), mỗi phân đoạn 5-10 ml.
+ Xác định phân đoạn chính chứa KS cần tách:
Thử hoạt tính KS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Tiến hành SKLM các phân đoạn có hoạt tính với hệ dung môi tách tốt nhất. Phân đoạn chính là các phân đoạn có những vết có Rf tương đương và có hoạt tính KS mạnh.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
3.1. NGHIÊN CỨU TÊN KHOA HỌC CỦA STREPTOMYCES 183.221 Xạ khuẩn Streptomyces 183.221 được nuôi cấy trên MT ISP, sau 21 ngày