Các MT phân lập, nuôi cấy, khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh Thành phần các môi trường được trình bày ở bảng 2.2
Bảng 2. 2. Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7
Tinh bột 2 2 2,4
Glucose 2 1 Cao ngô 0,5 0,5 Saccarose 2 Bột đậu tương 1 Bột ngô 2 0,1 Cao thịt 0,3 0,3 Pepton 0,3 0,5 KNO3 0,1 KCl 0,05 NaNO3 0,2 NH4NO3 0,2 0,2 CaCO3 0,3 0,4 0,2 0,4 K2HPO4 0,05 0,1 0,1 0,05 MgSO4.7H2O 0,05 0,05 0,25 0,15 FeSO4.7H2O 0,001 0,05 0,1 NaCl 0,05 0,1 0,5 Cao nấm men 0,5 Thạch 1,8 2 2 2 2 2 1,8 Nước vđ (ml) 100 100 100 100 100 100 100 pH 7,0-7,2 6,8- 7,2 7,0- 7,2 7,0- 7,2 7,0- 7,2 7,0- 7,2 7,4- 7,6
MT lên men dịch thể (MTdt) tương tự MT nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.
Chủng Streptomyces 183.221 được phân lập, nuôi cấy trên môi trường 2 ( MT2).
Bảng 2. 3. Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Thành phần NaCl (%) Cao thịt (%) Glucose (%) Pepton (%) Thạch (%) pH Canh thang 0,5 0,3 - 0,5 - 6,8- 7,2 Thạch thường 0,5 0,3 - 0,5 1,6- 1,8 6,8- 7,2 Sabouraud đặc - - 2,0 1,0 1,6 6,0- 6,5
MT phân loại xạ khuẩn theo ISP: Thành phần MT trình bày trong bảng 2.4
Dung dịch muối vi lượng: MnCl2.4H2O 0,1g; FeSO4.7H2O 0,1g; ZnSO4.7H2O 0,1g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH =7,0-7,2
Dung dịch A: Pepton 20,0g; acid citric 0,384g; FeSO4.7H2O 0,556g; NH4OH 25% 0,264g; Na2S2O3 10ml; K2HPO4 1g; nước cất vừa đủ 1000ml.
Dung dịch Pridham và Gottlieb (dung dịch B): CuSO4.5H2O 0,64g; FeSO4.7H2O 0,11g; MnCl2.4H2O 0,79g; ZnSO4.7H2O 0,15g; nước cất vừa đủ 1000ml.
Bảng 2. 4. Môi trường phân loại xạ khuẩn theo ISP MT
Thành phần(g)
ISP1 ISP2 ISP3 ISP4 ISP5 ISP6 ISP7 ISP9
Trypton 5,0 Cao nấm men 3,0 4,0 1,0 Dịch chiết Malt 10,0 Glucose 4,0 Bột yến mạch 20,0 Tinh bột 10,0 K2HPO4 1,0 1,0 0,5 5,65 KH2 PO4 2,38 FeSO4.7H2O 0,556 0,01 MgSO4.7H2O 1,0 0,5 1,0 MT
CaCO3 2,0 0,01 NaCl 1,0 0,5 (NH4)2SO4 2,0 2,64 L-Asparagin 1,0 1,0 Glycerin 10,0 15,0 L- tyrosin 0.5 DD muối VL (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 Dung dịch A 36,0 Dung dịch B 1,0 Thạch 20,0 18,0 20,0 20,0 15 20,0 H2O vđ (ml) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 pH 7,0 - 7,2 7,3 7,0 - 7, 4 7,0 - 7,2 7,2 - 7,4 6,8 - 7,0
Các MT trên được tiệt khuẩn ở 118-1200C/ 30 phút. Các nguồn đường: D- glucose; D- Mannitol; Raffinose; Inositol; D-Fructose; Rhamnose, D- Xylose; L- Arabinose; Saccarose được tiệt khuẩn theo phương pháp Tyndall.
Từng bình môi trường ISP9 sau khi đã tiệt khuẩn, để nguội tới 600C, cho một trong các nguồn đường trên vào sao cho nồng độ đường trong môi trường là 1%. 2.1.3. Dụng cụ và hóa chất
Bảng 2.5. giới thiệu các dung môi đã sử dụng. Bảng 2. 5. Các dung môi sử dụng
Dung môi Khối lượng riêng
(g/cm3) Nhiệt độ sôi ( 0 C) Aceton 0,79 56 Acetonitril 0,78 81,3- 82,1 Ammoniac 25% 0,88 n- Butanol 0,81 116-118 Butylacetat 0,880- 0,885 117-118 Cloroform 1,470- 1,480 60- 62 Dicloromethan 1,32 39,6
Dimethylformamid 0,946- 0,950 153 Ethanol 0,789-0,791 78,3 Ethylacetat 0,902 70-72 n- Hexan 0,6548 69 Methanol 0,791- 0,793 64,5 Triethylamin 0,726- 0,728 89
* Bản mỏng sắc ký: Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Aluofolien 60 F254 (Merck). Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel (Merck), cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm.
* Máy móc và thiết bị:
Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn Toshiba 60W, 220V.
Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf, máy cất quay Buchi R220.
Tủ ấm Memmert, Binder; tủ sấy SL shellab; tủ cấy vô trùng Aura VF 48.
Tủ lạnh Sanyo.
Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL303.
Cân kỹ thuật Sartorius TE 210; cân phân tích Sartorius BP 121 S.
Bơm chân không Waterbath B480.
Kính hiển vi điện tử (Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương).
Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt.
Máy UV- VIS Hitachi U-1900.
Các dụng cụ khác như: Thước kẹp Palmer ( độ chính xác 0,02mm), hộp Petri, Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong, cốc có mỏ, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác,… 2.2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống
Chủng Streptomyces 183.221 được cấy zigzag trên ống thạch nghiêng, cho
vào tủ ấm 28-300C, sau 6-10 ngày chủng phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản 2-40C, định kỳ 3-6 tháng cấy truyền một lần.
2.2.2. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP
Chuẩn bị giống gốc Streptomyces 183.221 được phân lập, nguyên gốc.
Xác định đặc điểm hình thái, màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh và đánh giá khả năng tạo thành sắc tố hòa tan: Các MT ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5 được hấp tiệt trùng đổ vào đĩa petri, mỗi môi trường làm 4 đĩa. Cấy
zigzag bào tử Streptomyces 183.221 lên bề mặt thạch. Để ở 300C, tiến hành quan sát sau khi nuôi cấy được 7, 14, 21 ngày.
Hình dạng chuỗi và bề mặt bào tử quan sát dưới kính hiển vi điện tử: - Dạng chuỗi bào tử: Thẳng (R), thẳng hơi cong (RF), móc câu (RA), xoắn ốc (S).
- Bề mặt bào tử có thể có các dạng sau: Phẳng, nhẵn (sm); sần sùi (wa), có gai (sp), có tóc (ha).
Màu của khuẩn ty khí sinh (màu của bề mặt khuẩn lạc) : Có thể có màu đỏ (R), vàng (Y), xanh lá cây (G), xanh da trời (B), tím (V), xám (Gy), trắng (W). Trường hợp có các màu xen kẽ thì ghi các màu liền nhau.
Màu của khuẩn ty cơ chất: Quan sát mặt sau của khuẩn lạc (mặt dưới đĩa Petri), thường có các màu vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây. Nếu thấy các màu trên ký hiệu là (1), không thấy ký hiệu là (0).
Sắc tố hòa tan nằm ngay trong môi trường có các màu: Vàng, xanh, đỏ, tím…Nếu có ký hiệu là (1), không có ký hiệu là (0).
Xác định sắc tố melanoid (màu đen hoặc màu nâu đen): Nuôi cấy xạ khuẩn trên các MT ISP6, ISP7, quan sát ở ngày thứ 2, ngày thứ 4, nếu có ký hiệu là (1), không có ký hiệu là (0).
Khả năng tiêu thụ nguồn carbon: Nuôi cấy bào tử trên các môi trường MT ISP9 có chứa các nguồn đường khác nhau, đánh giá ở ngày thứ 12, 16. Nếu bào tử phát triển mạnh hơn hoặc bằng khi nuôi cấy trên MT ISP9 chứa glucose (chứng dương) thì ký hiệu là (+), nếu phát triển yếu hơn hoặc bằng khi nuôi cấy trên
MT ISP9 không cho nguồn đường (chứng âm) thì ký hiệu là (-), nếu phát triển mạnh hơn chứng âm và kém hơn chứng dương thì ký hiệu là (±).
2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng có chứa VSV kiểm
định. KS từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn, vô nấm.
Tiến hành:
Kết quả được tính theo công thức:
2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n
: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn. Di: Đường kính vòng vô khuẩn thứ i.
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh.
n: Số thí nghiệm làm song song (không có hướng dẫn khác thì n=3). Chuẩn bị MT nuôi cấy VSV kiểm định
(MT canh thang ( VK), dd tạo nhũ dịch (vi nấm ), hỗn dịch VSV kiểm định )
Đưa mẫu thử vào đĩa Petri có chứa VSV kiểm định (Khoanh giấy, giếng thạch, khối thạch)
Nuôi cấy
VK (370C; 18- 24h ); vi nấm ( 28-300C/24- 72h)
Đánh giá kết quả
2.2.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp
Trong tủ cấy vô trùng , Streptomyces183.221 được cấy zigzag lên MT1 đến
MT7 trong đĩa Petri, để vào tủ ấm 6 ngày. Sau đó thử hoạt tính KS bằng phương pháp khối thạch. Dựa vào kết quả chọn ra MT cho hoạt tính KS cao nhất là MT nuôi cấy thích hợp .
2.2.5 . Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên
Chuẩn bị MT: Cân MT2, tiệt khuẩn 1200C/ 30 phút, đổ ra đĩa Petri vô trùng.
Pha hỗn dịch bào tử: lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 183.221
cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 ( định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6 bằng nước vô trùng.
Phân tán hỗn dịch bào tử: hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-4 đến 10-6 nhỏ vào đĩa Petri chứa MT. Dùng que chang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch. Mỗi nồng độ tiến hành trên 3 đĩa. Cho các đĩa đã phân tán bào tử vào tủ ấm 280C.
Sau 6 ngày, các khuẩn lạc xạ khuẩn đã phát triển, chọn các khuẩn lạc phát triển đa dạng, mọc riêng rẽ cấy zigzag lên đĩa Petri có MT, để vào tủ ấm 6 ngày rồi thử hoạt tính KS bằng phương pháp khối thạch. Dựa vào kết quả đường kính vòng vô khuẩn lựa chọn và giữ lại 3 dạng chủng có hoạt tính KS tốt nhất cho nghiên cứu tiếp theo.
2.2.6. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV
Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 183.221
cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc đều, được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 ( định ước ). Sau đó dùng 1ml pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6 rồi nhỏ vào đĩa Petri làm mẫu chứng.
Đột biến bằng ánh sáng UV: 9 ml còn lại của nồng độ 10-1 đổ ra đĩa Petri vô trùng. Chiếu ánh sáng UV (λ=254 nm) với khoảng cách, thời gian thích hợp (
60cm - 5 phút). Lấy ra, để vào chỗ tối 2 giờ, dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5.
Phân tán hỗn dịch bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-4 và 10-5 nhỏ vào đĩa Petri chứa MT. Dùng que chang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa; cho các đĩa đã phân tán bào tử vào tủ ấm 280C trong 6 ngày sẽ xuất hiện các khuẩn lạc, đếm số khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:
% độ sống sót= x 10-6+k x 100%
Nm: số khuẩn lạc sau đột biến ở nồng độ bào tử 10-k. No: số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
Chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc sau đột biến, làm song song mẫu chứng. Phần trăm biến đổi hoạt tính của biến chủng thứ I được tính theo công thức:
% biến đổi hoạt tính = x 100%
Di: đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến. Do: đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
Sau đột biến, dựa vào kết quả thu được lựa chọn và giữ 3 biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.7. Lên men chìm và đánh giá hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men
Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 183.221 nuôi cấy trên thạch
nghiêng (MT2) được 6 ngày, cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2dt bằng 10ml nước vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28 ± 0,1oC, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
Sau 48h trên máy lắc, giống cấp 1 được cấy vô trùng sang các bình nón 500ml chứa 100ml MTdt với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10. Các bình lên men lắc ở nhiệt độ 28 ± 0,1oC, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h.
Sau 120h lọc hoặc li tâm dịch lên men rồi thử hoạt tính KS bằng phương pháp giếng thạch.
2.2.8. Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ
Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối được chỉnh về pH thích hợp bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N rồi chiết với từng dung môi chiết.
Dịch lọc và dung môi hữu cơ cho vào bình gạn với tỷ lệ Vdung môi : Vdịch lọc = 1:5, lắc trong 1-3 phút, để phân lớp 1 giờ sau đó gạn riêng lớp dung môi và lớp nước. Thử hoạt tính của lớp dung môi và lớp nước sau mỗi lần chiết bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Có thể chiết một lần hoặc chiết lặp lại để chiết kiệt được KS trong dịch lọc.
2.2.9. Phương pháp xác định kháng sinh nội bào, ngoại bào
Sau lên men, dịch lên men đem lọc tách riêng dịch lọc và sinh khối.
Xác định KS ngoại bào: Dịch lọc được thử hoạt tính KS bằng phương pháp giếng thạch. Nếu dịch lọc có hoạt tính thì là KS ngoại bào.
Xác định KS nội bào: Sinh khối được rửa 3 lần với nước cất, sấy khô ở 40 - 50 0C. Nghiền vỡ sinh khối trong cối sứ với dung môi thích hợp (đã xác định được). Xác định hoạt tính KS bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
2.2.10. Phương pháp xác đinh độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh
Xác định độ bền nhiệt:
Mục đích: Xác định độ bền vững của KS với nhiệt độ, để đảm bảo các quá trình: bảo quản, sấy,…không ảnh hưởng đến hoạt tính của KS.
Tiến hành: Lấy 3 ống dịch lọc lên men, mỗi ống 5-7 ml. Ống 1 đun sôi trực tiếp 10 phút, ống 2 đun sôi cách thủy 30 phút, ống 3 để ở nhiệt độ thường; đem thử hoạt tính KS bằng phương pháp giếng thạch.
Xác định độ bền pH:
Mục đích: Xác định ảnh hưởng của pH khác nhau lên độ bền vững của KS, từ đó biết được pH tối thích để bảo quản, chiết tách KS.
Tiến hành: Lấy 5 ống dịch lọc dịch lên men, mỗi ống 5ml, chỉnh pH dịch lên men trong ống về pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N. Thử hoạt tính dịch trong ống sau 1 ngày và 6 ngày (sau khi điều chỉnh pH về trung tính) bằng phương pháp giếng thạch.
2.2.11. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký
A. Sắc ký lớp mỏng
+ Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 110oC/ 30 phút. Dung môi pha đúng theo tỷ lệ, đổ vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để bão hòa trong 30 phút. Chấm dịch chiết DMHC lên bản mỏng, cách mép dưới 1,5cm; cách mép bên 1cm, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 40- 50oC.
+ Khai triển sắc ký: Đặt bản mỏng vào bình sắc ký, khi dung môi chạy đến 3/4 bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu vết dung môi chạy (dm).
+ Hiện sắc ký đồ:
- Soi đèn UV: Bản mỏng sắc ký tráng sẵn đã trộn với một chất phát huỳnh quang dưới ánh sáng UV. Nếu có chất thử sẽ cho màu thẫm dưới đèn tử ngoại.
- Hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng, đổ MT có cấy VSV kiểm định, để tủ 37oC/18-24h. Vết kháng sinh được xác định dựa vào vòng vô khuẩn.
- Phương pháp hiện hình bằng thuốc thử hóa học: Bản mỏng đã chạy sắc ký đem sấy khô rồi nhỏ Ninhydrin 1% lên bản mỏng, sau 3 phút đưa sấy ở 700C rồi quan sát bằng mắt thường, đo Rf. Nếu trùng với Rf của VSV thì kết luận kháng sinh phát hiện được bằng thuốc thử hóa học.
+ Tính Rf :
Rf =
dv: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết.
ddm: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến đường dung môi chạy. B. Sắc ký cột:
+ Chuẩn bị:
Mẫu thử: Bột KS thô thu được sau khi cất quay dịch chiết DMHC.
Dung môi: Pha đúng theo tỷ lệ.
Chất nhồi cột: Silicagel 60 F 254 Merck cỡ hạt 0,040-0,063mm. Cân khoảng 8g hạt, hoạt hóa ở 110oC/ 30 phút. Hòa thành hỗn dịch với dung môi chạy rồi đưa dần lên cột.
Đưa mẫu thử lên cột: Bột KS thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol, rồi trộn với khoảng 2g Silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50oC cho bay hết methanol thì cho lên cột để ổn định cột trong 30 phút.
+ Chạy cột: Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5 ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch (đã tráng cồn để khô), mỗi phân đoạn 5-10 ml.
+ Xác định phân đoạn chính chứa KS cần tách:
Thử hoạt tính KS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc.