Kết quả được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3. 8. Độ bền vững của kháng sinh với nhiệt độ
Thí nghiệm P. mirabilis B. subtilis
(mm) s (mm) s Dịch lọc ở nhiệt độ thường 21,53 0,41 20,69 0,37 Dịch lọc đun cách thủy 30phút 19,31 0,35 18,38 0,81
Dịch lọc đun sôi 10p 12,75 0,43 15,35 0,4
Nhận xét: KS do Streptomyces 183.221 có hoạt tính giảm mạnh khi chịu sự
tác động của nhiệt độ cao. Vì vậy nhiệt độ trong quá trình bảo quản, sấy, cô chân không, chiết tách … phải thích hợp để đảm bảo hoạt tính KS không bị ảnh hưởng. 3.6.2. Ảnh hưởng của pH
Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 và hình P12- phụ lục. Bảng 3. 9. Ảnh hưởng của pH tới độ bền vững kháng sinh
pH
Sau 1 ngày Sau 6 ngày
P.mirabilis B.subtilis P.mirabilis B.subtilis
(mm) s (mm) s (mm) s (mm) s 1 16,80 0,24 15,29 0,83 16,17 0,52 13,10 0,21 3 18,70 0,58 19,87 1,40 16,51 0,37 13,82 0,25 5 21,78 0,16 20,65 0,37 20,99 0,08 19,79 0,43 7 22,45 0,41 20,67 0,20 22,33 0,42 19,99 0,50 9 17,24 1,21 17,43 0,33 16,93 0,08 15,95 0,41 11 10,43 0,80 10,31 0,73 9,56 0,36 9,71 0,22
Nhận xét: Hoạt tính KS do Streptomyces 183.221 tổng hợp bền tại pH trung
tính, không bền ở pH acid và pH kiềm. Như vậy chọn pH = 7 để bảo quản dịch KS, dịch lên men và sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.7. KẾT QUẢ CHỌN DUNG MÔI VÀ pH CHIẾT
Tiến hành chiết KS trong dịch lọc bằng các dung môi: Ethylacetat, butylacetat, n-butanol, cloroform, dicloromethan ở các pH 3, 5, 7, 9, 11 với tỷ lệ Vdl:Vdm = 5:1. Đánh giá hoạt tính KS trong pha DMHC và pha nước bằng phương pháp khoanh giấy, kết quả được trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3. 10. Kết quả lựa chọn dung môi và pH chiết kháng sinh.
Dung môi pH
P. mirabilis B. subtilis
Pha DMHC Pha nước Pha DMHC Pha nước (mm) s (mm) s (mm) s (mm) S n- Butanol 3 17,67 0,95 9,25 0,28 18,71 0,24 10,15 0,78 5 19,80 0,81 8,61 0,19 20,95 0,10 9,91 0,26 7 20,89 0,51 9,24 0,23 20,95 0,82 9,30 0,23 9 20,76 0,30 9,96 0,59 19,36 0,93 11,01 0,82 11 16,57 0,15 9,89 0,42 15,65 0,83 10,79 0,25 Butylacetat 3 16,45 0,69 10,88 0,31 14,73 0,64 10,17 0,65 5 16,83 0,12 10,50 0,71 15,87 0,61 11,90 2,02 7 17,10 0,25 10,36 0,57 16,45 0,55 10,43 0,42 9 15,16 0,68 10,46 0,75 15,00 0,82 10,34 0,43 11 14,52 0,37 9,63 0,47 12,17 0,11 9,70 0,22 Cloroform 3 15,16 2,00 12,27 0,21 19,07 0,74 13,51 0,38 5 17,97 0,78 14,14 0,74 19,13 1,09 14,89 0,15 7 16,80 0,66 11,35 0,88 19,00 0,49 11,51 0,42 9 14,08 0,72 14,13 0,80 15,66 2,01 15,90 0,33 11 14,06 0,26 11,89 0,33 14,38 0,63 11,92 0,10
Dicloromethan 3 19,22 0,70 13,67 0,38 16,89 0,53 14,36 0,14 5 19,43 0,25 13,66 0,47 17,48 1,11 15,04 0,89 7 20,10 0,31 12,99 0,65 17,97 0,56 12,74 0,18 9 19,88 1,09 14,38 0,88 16,20 0,77 12,73 0,90 11 17,63 0,44 13,65 0,72 15,25 0,76 10,68 0,65 Ethylacetat 3 19,03 0,25 7,68 0,47 19,66 0,14 8,80 0,75 5 20,69 0,25 7,00 0,10 20,36 0,15 8,00 0,37 7 21,05 0,22 6,41 0,18 21,00 0,24 9,42 0,30 9 18,26 0,37 8,19 0,14 20,00 0,40 9,00 0,47 11 17,03 0,22 8,08 0,77 18,26 0,47 9,14 0,18
Nhận xét: Dịch chiết Ethylacetat ở pH = 7 cho hoạt tính KS cao nhất nhưng chưa chiết được kiệt KS, tiến hành chiết lặp để thu kiệt KS. Kết quả của phương pháp chiết lặp được trình bày trong bảng 3.11.
Bảng 3. 11. Chiết kháng sinh bằng Ethylacetat ở pH = 7, chiết lặp 2 lần Các
lần chiết
P.mirabilis B. subtilis
Pha DMHC Pha nước Pha DMHC Pha nước
(mm) s (mm) s (mm) s (mm) s Lần 1 20,85 0,15 7,40 0,43 20,85 0,47 7,39 0,63 Lần 2 10,41 0,43 0,00 0,00 10,67 0,94 0,00 0,00
Nhận xét: Sử dung phương pháp chiết lặp (2 lần), tại pH = 7 thì chiết kiệt được kháng sinh trong dịch lọc. Áp dụng phương pháp này để chiết KS trong dịch lọc ở các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.8. KẾT QUẢ TÁCH KHÁNG SINH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
Mục đích: Lựa chọn hệ dung môi có khả năng tách các thành phần trong dịch chiết làm cơ sở cho việc chạy cột sắc ký, tinh chế KS. Đồng thời sơ bộ xác định thành phần trong dịch chiết DMHC.
Triển khai sắc ký trên 4 hệ dung môi:
Hệ 1: Cloroform: Methanol: Amoniac 25% (2: 2: 1).
Hệ 2: n- Butanol: Ethanol: Dimethylformamid (3: 1:1).
Hệ 3: Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1: 2:1).
Hệ 4: Ethylacetat: Propanol: Acetonitril (2:3:1). Kết quả trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3. 12. Kết quả SKLM lựa chọn hệ dung môi
Hệ dung môi Mắt thường B. subtilis
Số vết Màu Rf Số vết Rf 1 1 Vàng đậm 0,94 1 0,94 2 Vàng nhạt 0,85 2 0,82 2 1 Vàng đậm 0,89 1 0,89 2 Đỏ nâu 0,84 2 0,84 3 1 Vàng đậm 0,79 1 0,78 2 Đỏ nâu 0,74 2 0,74 4 1 Vàng nhạt 0,78 1 0,78 2 Vàng đậm 0,69 2 0,69 3 Đỏ nâu 0,25 3 0,24 4 Vàng xanh 0,17 4 0,16
Nhận xét: Kết quả cho thấy có ít nhất 4 thành phần KS trong dịch chiết. Hệ 4 có thể tách được các thành phần, được lựa chọn để tiến hành tinh chế.
3.9. KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ CỘT
Mục đích: Loại tạp, tách các thành phần, tinh chế thu KS tinh khiết.
Dựa trên kết quả SKLM, tiến hành chạy sắc cột. Dịch lọc KS thu được 5.5 lít đem chiết bằng ethylacetat ở pH = 7, thu được 500ml dịch chiết, cất quay chân không thu được 0,1428g bột KS thô màu đỏ.
Cân 0,1015g bột KS thô chạy cột với hệ 4, được 25 phân đoạn, mỗi phân đoạn 4-5ml/ống nghiệm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.13 và hình P10- phụ lục.
Bảng 3. 13. Kết quả thử hoạt tính của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 1
Phân đoạn P. mirabilis B. subtilis
(mm) s (mm) s 1 0,00 0,00 0,00 0,00 2 11,47 0,39 11,35 0,63 3 23,97 0,05 20,94 0,32 4 24,08 0,18 24,61 0,44 5 23,80 0,45 23,04 0,27 6 19,45 0,41 20,25 0,43 7 16,63 0,45 17,19 0,60 8 15,77 0,83 14,59 0,22 9 13,06 0,58 12,48 0,19 10 11,90 0,43 11,33 0,52 11 10,03 0,44 9,28 0,62 12 9,47 0,37 9,79 0,43
Các phân đoạn 13 đến 25 không có hoạt tính kháng sinh.
Nhận xét: Các phân đoạn từ 3 đến 6 có hoạt tính KS mạnh nhất, thành phần KS chính có thể nằm trong các phân đoạn này.
Các phân đoạn có hoạt tính KS được chấm SKLM với hệ dung môi
Ethylacetat: Methanol (25:1), hiện hình bằng B. subtilis. Kết quả được trình bày
trong bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả SKLM các phân đoạn 1-12
Phân đoạn Rf Vết 1 Vết 2 Vết 3 2 0,77 0,60 - 3; 4; 5; 6 0,61 0,47 0,21 7, 8 0,47 0,24
Nhận xét: Sau khi chạy sắc ký cột lần 1 chưa tách được các thành phần trong dịch chiết để thu kháng sinh tinh khiết. Dựa vào kết quả bảng 3.13 và bảng 3.14, dự đoán phân đoạn chính là phân đoạn từ 3 đến 6, có hoạt tính KS mạnh và có Rf tương đương.
Đem cô các phân đoạn 3 đến 6 tiến hành chạy cột lần 2 với hệ dung môi Ethylacetat: Methanol ( 25:1), lấy được 20 phân đoạn, thử hoạt tính KS các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy, đồng thời tiến hành SKLM cácphân đoạn kết quả được trình bày trong bảng 3.15, bảng 3.16 và hình P11-phụ lục.
Bảng 3. 15. Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn sau chạy cột lần 2 Phân
đoạn
P. mirabilis B. subtilis Phân đoạn P. mirabilis B. subtilis (mm) s (mm) s (mm) s (mm) s 1 0,00 0,00 0,00 0,00 11 23,03 0,33 21,53 0,05 2 0,00 0,00 0,00 0,00 12 19,07 0,05 18,33 0,34 3 13,10 0,08 11,67 0,40 13 15,73 0,21 16,23 0,95 4 19,33 0,19 20,00 0,64 14 17,34 0,58 16,57 0,61 5 22,49 0,21 21,67 0,94 15 17,68 0,46 17,99 0,42 6 24,39 0,08 23,64 0,74 16 17,93 1,17 14,70 0,92 7 25,47 0,41 24,64 0,40 17 15,53 0,45 15,63 0,69 8 26,07 0,09 24,11 0,01 18 15,83 0,62 17,15 0,05 9 24,87 0,26 23,83 0,12 19 15,97 0,56 16,74 0,58 10 24,27 0,31 22,73 0,21 20 14,63 0,39 15,37 0,97
Bảng 3. 16. SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 2 (hiện hình bằng B. subtilis)
Nhận xét: Theo kết quả, các nhóm phân đoạn có 1 chất là 4; 5 (K1) và 13; 14; 15 (K2), Rf cho thấy 2 chất trong 2 nhóm phân đoạn là khác nhau, tách riêng từng
chất. Các phân đoạn 6 đến 12 có hoạt tính KS mạnh và Rf tương đương, đem cô, tiến
hành chạy cột lần 3 với hệ dung môi Ethylacetat: Methanol: Dicloromethan (25:1:1) lấy được 14 phân đoạn. Tiến hành SKLM các phân đoạn theo hệ Ethylacetat:
Các phân đoạn Rf Vết 1 Vết 2 4; 5 0,75 6; 7; 8; 9;10; 11; 12 0,75 0,65 13; 14; 15 0,65 16; 17; 18; 19 0,55 0,38
Methanol: Dicloromethan (25:1:1), hiện hình bằng B.subtilis, kết quả được trình bày ở bảng 3.17. Bảng 3. 17. Kết quả chạy cột lần 3 Các phân đoạn Rf Vết 1 Vết 2 2; 3; 4; 5 0,78 6;7 0,78 0,62 8; 9; 10; 11; 12 0,63 13; 14 0,51 0,4
Nhận xét: Tách riêng các phân đoạn 1 chất : 2; 3; 4; 5 (K1’) và 8; 9; 10; 11; 12 (K2’). Chấm SKLM 4 chất K1, K2, K1’, K2’ trên cùng bản mỏng với hệ dung môi Ethylacetat: Methanol: Dicloromethan (25:1:1); kết quả được trình bày ở bảng 3.18.
Bảng 3. 18. Kết quả Rf của các chất thu được
Chất K1 K2 K1’ K2’
Rf 0,78 0,63 0,78 0,63
Nhận xét: Dựa vào Rf có thể thấy K1- K1’; K2-K2’ là một chất. Gộp riêng dịch KS các chất K1- K2, đem cô chân không và tiến hành kết tinh bằng hỗn hợp dung môi thu được KS tinh khiết có màu đỏ. Kết quả thu được như bảng 3.19.
Bảng 3. 19. Khối lượng và hiệu suất kết tinh
3.10. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM
Tiến hành khảo sát khả năng chống nấm của KS do Streptomyces 183.221sinh
ra bằng phương pháp khuyếch tán sử dụng khối thạch đối với Aspergillus sp. 514,
Microsporum sp. 014. Kết quả được trình bày trong bảng 3.20
Bảng 3.20. Kết quả chống nấm của Streptomyces 183.221.
Chất Khối lượng (g) Hiệu suất (%)
K1 0,0255 25,12
Nhận xét: Dựa vào kết quả của vòng vô nấm có thể kết luận KS do Streptomyces 183.221 sinh ra không có khả năng kháng Aspergillus sp. 514, Microsporum sp. 014.
3.11. SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA KHÁNG SINH
Đem chất K1 tinh khiết đo nhiệt độ nóng chảy, phổ UV, phổ IR, phổ MS. 3.11.1. Nhiệt độ nóng chảy của K1: 205,40C.
3.11.2. Phổ UV của chất K1: được giới thiệu ở phần phụ lục hình P13.
Phổ UV cho thấy chất K1 có 2 đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 443nm và 289nm
3.11.3. Phổ IR
Phổ IR của chất K1 được giới thiệu ở phần phụ lục hình P14. Dựa vào các đỉnh hấp thụ trên phổ IR (hình P12) có thể dự đoán trong cấu trúc phân tử kháng sinh có các liên kết đặc trưng sau:
494,08cm-1; 611,95 cm-1; 649,45 cm-1 đặc trưng cho liên kết C- X (X= Br, I).
791,43 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H ở trong nhân thơm, hoặc alken.
992,34 cm-1 đặc trưng cho liên kết C – H trong alken.
1096,82 cm-1,1193,25 cm-1; 1278,98 cm-1 đặc trưng cho liên kết C- F; C-N; C-O.
1474,53 cm-1 đặc trưng cho liên kết C= C trong vòng benzen.
1579,01 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C trong vòng benzen, hoặc liên kết N- H.
1632,58 cm-1; 1656,69 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C trong alken; hoặc C=O trong nhóm chức amid.
1745,09 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=O trong nhóm chức ester.
Chủng nấm Chủng gốc ĐB 3.10 ĐB 3.10.1
(mm) s (mm) s (mm) s
Aspergillus sp. 514 0 0 0 0 0 0
2888,95 cm-1 đặc trưng cho liên kết C- H trong alkan; hoặc aldehyd.
2966,31 cm-1 đặc trưng cho liên kết C – H trong alkan.
3099,91 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H trong alken hoặc trong nhân thơm.
3437,45 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H trong amid, amin bậc 1, bậc 2. 3.11.4. Phổ MS
Phổ MS của chất K1 được giới thiệu trong hình P13 phần phụ lục. Phổ MS được đo bằng phương pháp EI+ ( bắn phá bằng electron) cho phép xác định khối lượng phân tử của chất kháng sinh là 656,22 dalton.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu cơ bản, tôi đã hoàn thành được mục tiêu đề ra và rút ra một số kết luận sau:
1. Kết quả ISP có thể sơ bộ kết luận, chủng Streptomyces 183.221 gần giống với chủng Streptomyces flavescens.
2. Streptomyces 183.221 được phân lập từ cơ chất Việt Nam, qua quá trình
cải tạo chọn giống đã thu được các biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng
sinh tốt hơn chủng gốc. Kháng sinh do Streptomyces 183.221 có những đặc điểm
sau:
Có ít nhất 2 thành phần có hoạt tính kháng sinh.
Phổ rộng, tác dụng tốt trên vi khuẩn Gr (+), Gr (-), không có khả năng
kháng Aspergillus sp. 514, Microsporum sp. 014.
Tan trong DMHC thông thường: Methanol, Ethylacetat,… Chiết được bằng phương pháp sử dụng DMHC, dung môi chiết thích hợp là Ethylacetat ở pH= 7.
Tương đối bền với nhiệt, pH tối ưu là pH 5-7.
3. Streptomyces 183.221 có khả năng sinh tổng hợp tốt trên MT nuôi cấy là
MT1, MT2, MT7. Lên men chìm, MT2dt và biến chủng ĐB 3.10.21 tạo điều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp kháng sinh.
4. Chất K1 thu được có tính chất sau: t0nc= 205,40C, khối lượng phân tử 656,22 dalton, có các liên kết C – H; C= C; C=O; N-H;…
ĐỀ XUẤT
1. Tiếp tục nghiên cứu tên khoa học của xạ khuẩn Streptomyces 183.221.
2. Để nâng cao hơn nữa khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục tiến hành đột biến bậc thang kết hợp phương pháp di truyền phân tử.
3. Lên men trên quy mô lớn sau đó chiết xuất và tinh chế nhằm thu kháng sinh để tiến hành xác định cấu trúc, tính chất lý hóa, đồng thời nghiên cứu khả năng
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bộ môn hóa Dược (1998), Hóa Dược II, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà
Nội, tr. 37-54.
2. Bộ môn hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, Trường Đại học Dược Hà
Nội, Hà Nội, tr. 23-69, 125-147, 215-219, 318.
3. Bộ môn Vi sinh- sinh học (2005), Thực tập vi sinh- ký sinh, Trường Đại học
Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 37-54.
4. Bộ Y tế (2007), Dược lý học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tập 2, tr. 130-142.
5. Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục.
6. Kiều Hữu Ảnh (1999), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật,
Hà Nội, tr. 167-172.
7. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ len men các chất kháng sinh, NXB
Khoa học kỹ thuật, Hà Nội.
8. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo (2006), Các nhóm vi khuẩn chủ yếu- Phân loại xạ khuẩn.
http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/cacnhomvikhuanchuyeu.htm.
9. Đỗ Thu Hà và cộng sự (1999), Vấn đề kháng kháng sinh của vi khuẩn, NXB Y
học.
10. Phạm Thị Hạnh (2010), Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 119.112, Luận văn thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội,
Hà Nội.
11. Lương Thị Hương Giang (2011), Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập ở núi Pháo- Đai Từ- Thái nguyên, Khóa
luận tốt nghiêp, Trường Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên, Thái Nguyên. 12. Nguyễn Khang (2005), Kháng sinh học ứng dụng, NXB Y học Hà Nội, Hà
Nội.
13. Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở Công nghệ sinh học và sản xuất Dược phẩm,
14. Từ Minh Koóng, Đàm Thanh Xuân(2006), Kỹ thuật sản xuất Dược phẩm,
tập II, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 26-40, 81-93.
15. Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Nhà xuất
bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr. 185-191.
16. Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách, phân chia, xác định các chất bằng dung môi hữu cơ, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập 1, tr. 9-27.
TIẾNG ANH
17. M.V. Arasu, V. Duraipandiyan, S. Ignacimuthu (2012), Antibacterial and antifungal activities of polyketide metabolite from marine Streptomyces sp. AP-123 and its cytotoxic effect, Department of Biological Environment and Chemistry,
College of Agriculture and Life Sciences, Chungnam National University [pubmed].
18. T.Brautaset T, H. Sletta (2011) , New nystatin-related antifungal polyene macrolides with altered polyol region generated via biosynthetic engineering of Streptomyces noursei, Department of Biotechnology, SINTEF Materials and Chemistry, Trondheim, Norway.
19. Masoud Ataiekhorasgani, Nasim Jafaripozve, Omid Zaerin (2014)