Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Micromonospora N°9

Những năm qua tại Bộ môn Công nghiệp Đại học dược Hà Nội công trình nghiên cưú khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ một số chủng Mỉcromonospora đã đạt kết quả nhất định, cho thấy khả nân

(hhoá ỉuận tốt nghiệp dược s ĩ hhoá 1997 - 2002)

Người hướng dẫn : TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện : Bộ môn Công Nghiệp dược

trường Đại học dược Hà Nội

Thời gian thực hiện: 26/ 06/ 2001 - 20/ 05/ 2002

J2Sf¿ ûit

ÇJùl ítáij Lồnụ, mình, tê ỉ tn tíô tt gửi tới th ầy

bẵú ehớ tôi trtìtiạ ẳUửt thòi ạìatt ikựe hiên ktrơả iíiíịtt it ít ụ- iồtiụ hìêí ổtt và k í nít trú trạ ẳíĩíi ầííe.

^Đềtiạ thời tồi eũttg dein iTtiç'e gut Lởi eám ổtt ehãn thành tối eăe iltầiỊ ạiảú ýeê giăú ỉhtLÔe hộ

»nô tí eôtiạ stạhỉỀệt dưổe c/ittạ tú ăn thê các hộ tnôtt phàng, íưut eíiứe nàn ạ đã nhiet tinh ạiúệi đò’ tạo

linfa aiỀit

Q lạuụễểt Q ï/t Ç7r/Iff(/

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỂ 1

PHẦNI' -TỔNG QUAN 2

1.1.Đạicươngvề Micromonospora 2

1.1.1.Đặc điểm sinh thái của Micromonospora 2

1.1.2.Đặc điểm hình thái của Micromonospora 2

1.1.3.Đăc điểm sinh lý của Mỉcromonospora 2

1.1.4.Sựtạo thành sắc tố của Micromonospora 3

1.1.5.Kháng sinh được tạo thành từ Mỉcromonospora 3

1.2.Cải tạo ,chọn giống vi sinh vật 4

1.2.1.Đại cương về cải tạo chọn giống vi sinh vật sinh kháng sinh 4

1.2.2.Đột biến bằng ánh sáng uv 6

1.2.3.Phương pháp sàng lọc 7

1.2.4.Chọn giống bậc thang 7

1.3.1ên men sinh tổng hợp kháng sinh 7

1.3.1.Lên men bề mặt 8

1.3.2.Lên men chìm 8

1.4.Chiết tách và tinh chế 9

1.4.1.Chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 10

1.4.2.sắc ký lớp mỏng 10

1.4.3.sắc ký cột 10

ỉ.5.Các nghiên cứu về kháng sinh 11

1.5.1.Vi khuẩn kháng thuốc và ý tưởng mới về thuốc kháng sinh 11

1.5.2.Hướng nghiên cứu mới trong tinh chế kháng sinh nhóm vancomycin 12

1.5.3.Actinohivin kháng sinh chống HỈVbằng cách ngăn cản sự xâm nhập virus vào tế bào 13

1.5.4.Phát hiện mới về boromycin 15

1.5.5.Adriamycin một kháng sinh chống ung thư mới 15

1.5.6.Micromonospora echinospora(jữcc 15831)sản xuất kháng sinh 16

1.5.7.Kháng sinh nhóm polyen chống nấm từ cơ chất việt nam 16

PHẦN II THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 17

2.1.Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 17

2.1.1.Nguyên liệ u 17

2.1.2.Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.Kết quả và nhận xét 24

2.2.1.Lựa chọn biến chủng trong nghiên cứu 24

2.2.2.Kết quả sàng lọc chọn giống 25

2.2.3.Kết quả cải tạo giống 29

2.2.4.Kết quả chiết xuất và tinh chế 34

PHẦN m KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 38

3.1.Kết luận 38

3.2.Ý kiến đề xuất 38

ĐẶT VẤN ĐỂ

Ngày nay một số thuốc kháng sinh thông dụng hầu như đã trở nên vô hiệu, vi khuẩn kháng thuốc phát triển phổ biến trên toàn thế giới với tốc độ nhanh chóng Chính vì vậy, bên cạnh việc sử dụng kháng sinh hợp lý hơn cho người lẫn súc vật thì việc tìm tòi những thuốc kháng sinh mới là công việc nghiên cứu cần thiết

Những năm qua tại Bộ môn Công nghiệp Đại học dược Hà Nội công trình nghiên cưú khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ một số chủng

Mỉcromonospora đã đạt kết quả nhất định, cho thấy khả nâng tìm được một số

chất kháng sinh mới có giá trị trong y học là điều có thể và với hy vọng ngày càng hiện thực hơn

Để góp phần thực hiện công trình này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu đề

tài “Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Micromonospora N°9” với

- Tìm hiểu sơ bộ về thành phần chất kháng sinh của Micromonospora

N°9 và tiếp tục hoàn thiện qui trình chiết suất, tinh chế trên qui mô phòng thí

nghiệm

PHẦN THỨ I TỔNG QUAN

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỂ MICROMONOSPORA [ 3, 7,11]

1.1.1 Đặc điểm sinh thái của Micromonospora

Micromonospora là một chi thuộc lớp xạ khuẩn Actinomycetes phân bố

khá phổ biến trong tự nhiên như đất, nước, bùn, cát Một số nhà vi sinh vật học đã đưa ra những nhận định sau: Zususa cho rằng trong đất miền núi tỷ lệ

Micromonospora là 2,6%, trong đất trồng lúa là 14%, trong đất than bùn là

26% - 27% so với các Actinomycetes khác Theo Tibelar và Vruggih từ mẫu đất ruộng sâu khi phân lập chỉ có khuẩn lạc Micromonospora.

1.1.2 Đặc điểm hình thái của Micromonospora

Micromonospora hầu như chỉ có khuẩn ty cơ chất phân nhánh, không

hình thành khuẩn ty khí sinh Đường kính khuẩn ty từ 0,4-0,8 |im Khi chưa hình thành bào tử bề mặt khuẩn lạc có màu vàng sáng đến da cam ,nâu đỏ tuỳ thuộc môi trường và điều kiện nuôi cấy ở giai đoạn bào tử xuất hiện bề mặt khuẩn lạc trở nên sẫm mầu: nâu tối đến sẫm đen Bào tử xuất hiện cả trong nuôi cấy chìm và trên môi trường thạch đặc Bào tử hình tròn oval, hoặc các dạng khác, có thể nằm trên cuống sinh bào tử hoặc không có cuống Cuống bào tử có hai dạng chính: đơn độc (monopodial) và chùm (sympodial)

Bề mặt bào tử có thể nhẵn ,có gai hay xù xì

1.1.3 Đặc điểm sinh lý của Mỉcromonospora

Micromonospora có vai trò vô cơ hoá nguyên liệu hữu cơ trong quá

trình mùn hoá Ngoài ra, Micromonospora còn có thể phân huỷ cellulose,

peptid, kitin, xylan, lignin, casein, tinh bột

Khoảng 6 - 45°c là nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của

Micromonospora, và 20 - 40°c là nhiệt độ tối ưu Tất cả các loài Micromonospora đều không phát triển được ở nhiệt độ trên 50°c.

Bào tử Micromonospora khá bền với dung môi hữu cơ và nhiệt Bào tử

tồn tại trong pH = 6 - 8 nhưng khi quá acid thì thường bị mẫn cảm

Micromonospora không ưa acid, là vi khuẩn Gram (+) có thành tế bào kiểu II

với thành phần chính là acid meso - diaminopimelic và glycin Thành phần đường là xylose, arabinose còn glucose, galactose, maltose thì khác nhau đối với mỗi loài

1.1.4 Sự tạo thành sắc tố của Mỉcromonospora

Micromonospora tạo ra sắc tố cơ chất màu da cam Ngoài ra, còn tạo

sắc tố hoà tan với những màu sắc khác nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau ở những loài khác nhau Ví dụ như sắc tố hoà tan màu vàng là đặc

trưng của loài Micromonospora chalcea các sắc tố vàng này khuếch tán khắp

nơi trên thạch tạo ra sự phát dạ quang vàng mạnh khi chiếu tia tử ngoại

Micromonospora fusca được đặc trưng bằng các sắc tố khuếch tán màu nâu

sẫm, Micromonospora purpurea và Micromonospora echinospora tạo sắc tố

bám trên hệ sợi màu nâu sẫm

1.1.5 Kháng sinh được tạo thành từ Micromonospora

Một số kháng sinh quan trọng tạo ra từ Micromonospora được phát

hiện và nghiên cứu (nhiều chất được ứng dụng trong y học) gồm:

- Kháng sinh nhóm aminosid:

+ Gentamicin sản xuất từ Micromonospora echinospo ra và

purpurea (Weintein và cộng sự 1963, Lucdemen và Brodsky 1964).

*+ Sisomicin sản xuất M.inyoenis (Weinstein và cộng sự, 1973) + Neomycin - B sản xuất từ M sp 69 - 683 (Wagman và cộng sự,

1.2 CẢI TẠO CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT [ 1,2,3,7,11 ]

1.2.1 Đại cương về cải tạo chọn giống vi sinh vật sinh kháng sinh

Các chủng vi sinh vật được phân lập từ tự nhiên, khi mới được phân lập gọi là các chủng nguyên thủy hay các chủng hoang dại Các chủng này chưa

đáp ứng được đầy đủ các yêu cầu dùng cho sản xuất công nghiệp Thông thường, chúng được nghiên cứu tuyển chọn cải tạo giống để xác định các đặc tính sinh lý, sinh hoá và các điều kiện thích hợp để sao cho có hoạt tính cao và thực hiện được một quá trình lên men có tính kinh tế, hiệu quả.

Công việc chọn giống có thể được tiến hành dựa vào hai cơ chế làm thay đổi thông tin di truyền :

- Một cơ chế liên quan đến sự phát sinh đột biến, ứng dụng tiến hành chọn giống bằng đột biến gây tạo kết hợp với sàng lọc

- Cơ chế liên quan đến tái tổ hợp di truyền ứng dụng tiến hành chọn giống bằng phương pháp lai với mục đích tổ hợp những tính chất quí giá từ bố

mẹ vào con cái trên cơ sở tái tổ hợp lại hệ gen

Nếu sử dụng phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên đột biến tự phát hiệu quả thường rất thấp vì tần số đột biến này không cao ( 10'8 - 10'10) Chỉ khi áp dụng phương pháp đột biến gây tạo mới thực sự cho hiệu quả trong nghiên cứu

và sản xuất kháng sinh

- Đột biến tự phát: là những thể đột biến phát sinh không có sự can thiệp của các tác nhân đột biến Một trong những nguyên nhân gây nên đột biến là do sự ngẫu nhiên khi liên kết các nucleotil trong quá trình sao chép

- Đột biến gây tạo: là những thể đột biến được tạo ra bởi các tác nhân đột biến với mục đích làm nâng cao tần suất xuất hiện đột biến Tác nhân đột biến thuộc nhiều loại khác nhau:

+ Tác nhân vật lý : tia X, tia a, ánh sáng uv

+Tác nhân hoá học : N-musta, ethylenimin, nitrozoguanidin(NG),

HN0 2.

+ Tác nhân sinh học : đột biến do hiện tượng thiếu các basenitơ hay do tác động của các gen gày đột biến.

là quang sản phẩm 6-4 ở đây c 6 của pyrimidin 5’ (thymin hoặc cytozin) được liên kết với c 4 của pyrimidin 3’ (thường là cytozin) Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu của đột biến gây nên bởi tia u v

Một số yếu tố sau đây ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết và tần số phát sinh đột biến khi xử lý vi sinh vật với ánh sáng ƯV:

- Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi thời gian chiếu, khoảng cách chiếu và độ pha loãng của bào tử có ảnh hưởng tới chiều hướng của đột biến

âm hay dương, ở liều lượng chiếu có độ sống sót từ 0,1-1% thường xuất hiện đột biến dương

- Ánh sáng thường: Hiện tượng “quang phục hoạt” đó là hiện tượng làm mất tác dụng đột biến của ánh sáng u v do ánh sáng thường Khi dịch bào tử

đã chiếu ánh sáng ƯV được đem để ra nơi có ánh sáng thường thì độ sống sót của bào tử sẽ tăng lên so với khi để trong bóng tối

- Các yếu tố khác: pH, thành phần môi trường, trạng thái sinh lý của bào tử đem đột biến cũng ảnh hưởng đến hiệu quả chiếu ánh sáng u v

1.2.3 Phương pháp sàng lọc

Sử dụng phương pháp “sàng lọc” đem lại hiệu quả trong việc phân lập các chủng thuần khiết, xác định được nhanh chóng tính kháng khuẩn, kháng nấm, virus hoặc kháng ung thư của một chủng được phân lập Phương pháp này thường dùng hai kiểu kỹ thuật:

- Lấy một mẫu thử để xác định khảo sát tác dụng với nhiều chủng vi sinh vật kiểm định

- Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với cùng một chủng vi sinh vật kiểm định

1.2.4 Chọn giống bậc thang

Phương pháp này chọn giống bằng sử dụng các tác nhân đột biến kết hợp với sàng lọc Trong thực tế để nâng cao hoạt tính của các chủng thường được thực hiện bằng cách tích luỹ các tăng trưởng nhỏ qua từng bậc chọn lọc

1.3 LÊN MEN SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH [ 3,7,10,11,13 ]

Với các chủng vi sinh vật mới phát hiện có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh thì việc nghiên cứu lên men trong phòng thí nghiện là rất quan trọng bởi ngoài mục đích khảo sát các điều kiện nuôi câý thích hợp: pH, nhiệt

độ, thành phần môi trường, ôxy hoà tan, tiền chất, thời gian nuôi cấy thì đây còn là bước bắt buộc để có thể tiến hành những nghiên cứu tiếp theo: chiết xuất - tinh chế, xác định tính chất lý, hoá, các đặc trưng tiền lâm sàng của chất kháng sinh đó

Đối với các biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh với hiệu suất cao thì việc nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp trở thành rất cần thiết Nếu đạt được các điều kiện tối ưu hiệu suất của chủng có thể tâng từ 2 - 31ần

áp dụng cho nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí nghiệm

1.3.2 Lên men chìm

Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng và phát triển trong toàn

bộ môi trường Giống vi sinh vật dùng trong lên men phải là các tế bào sinh dưỡng đang ở pha luỹ thừa có sức phát triển mạnh và khả nãng đồng hoá vật chất cao Vì vậy trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống lên men qua các cấp nhân giống khác nhau (giống cấp I, cấp II, cấp III) Tỷ lệ giống so với môi trường lên men thường dùng là 1-10%

Thời gian lên men tuỳ thuộc vào khoảng thời gian sản phẩm được tạo ra như vậy sẽ có sự khác nhau đối với từng chủng vi sinh vật dùng sản xuất

Micromonospora N°9 theo những nghiên cứu trước đây thì thời gian tối ưu ở

đó hoạt lực kháng sinh mạnh nhất là 120 giờ

Phương pháp này có một số ưu điểm : sử dụng triệt để môi trường dinh dưỡng, hiệu suất lên men cao, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, các thiết bị dề cơ giới và tự động hoá Song phương pháp cũng có một số nhược điểm : đòi hỏi trang bị kỹ thuật cao, có nguy cơ bị nhiễm trùng toàn bộ Vì vậy những thiết

bị lên men chìm cần chế tạo đặc biệt hợp quy cách, chịu áp lực cao, đảm bảo kín và làm việc với điều kiện vô trùng tuyệt đối Hệ thống lọc khí nén phức tạp

và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy

Lên men chìm được chia thành: lên men gián đoạn, lên men liên tục, lên men bán liên tục Lên men gián đoạn là lên men không có bất cứ một tác động bổ xung nào vào hệ thống ngoại trừ việc thông khí, dùng đệm điều chỉnh

pH, chất phá b ọ t Vi sinh vật sẽ phát triển qua 4 giai đoạn gọi là các pha: pha tiềm tàng, pha log, pha dừng và pha suy tàn Trong sản xuất, việc kết thúc lên men ở pha nào phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất bị dừng ở pha nào trong chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật

1.4 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ [ 6,8,11,13 ]

Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp Tuỳ theo đặc tính của loài mà sản phẩm thứ cấp đó được tiết vào môi trường nuôi cấy (penicillin, streptomycin.v.v ) hay giữ lại trong tế bào (gramixidin, nystatin ) để thu lấy các hoạt chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết thích hợp Có thể

sử dụng phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ (penicillin) hoặc sử dụng phương kết tủa để chiết xuất, tinh chế kháng sinh (các tetraxiclin w ), hoặc bằng nhựa trao đổi ion (kháng sinh nhóm aminoglycosid, polymyxin w ) Đối với phương pháp kết tủa đòi hỏi phải tìm được chất phụ gia thích hợp cho quá trình kết tủa (các amoni bậc 4), còn đối vói phương pháp trao đổi ion cần

các cationit có dung lượng trao đổi lớn, dễ phản hấp phụ để không phá huỷ hoạt chất Kỹ thuật chiết xuất và tinh chế kháng sinh thích hợp làm cho sản phẩm đạt chất lượng cao bảo quản được lâu hơn đồng thời còn làm tăng tỷ lệ thu hồi và hạ giá thành sản phẩm.

Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh thường áp dụng một số phương pháp chiết tách, tinh chế như : lọc, chiết, hấp phụ và sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột

1.4.1 Chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ

Nguyên tắc cơ bản của nguyên tắc này là dựa vào sự phân bố của chất kháng sinh giữa hai pha không đổng tan với nhau gồm dung môi chiết với dịch lọc dịch lên men hay sinh khối để tách lấy riêng chất kháng sinh (có thể

là một chất hay một nhóm chất)

Với kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dịch lên men ta ứng dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng với một số phương pháp chiết: chiết đơn, chiết lặp, chiết ngược dòng

1.4.2 Sắc ký lớp mỏng

Đây là phương pháp rất quan trọng trong quá trình tinh chế và chiết tách sản phẩm Mặc dù không trực tiếp là khâu tinh chế sản phẩm nhưng với kết quả của sắc ký lớp mỏng sẽ cho ta những bước khảo sát đầu tiên, làm cơ sở cho giai đoạn tinh chế sản phẩm sau này

Nhược điểm của phương pháp chính là đòi hỏi người thực hiện cần có

sự kiên trì khéo léo, lựa chọn được hệ dung môi thích hợp tách tốt sản phẩm

1.4.3 Sắc ký cột

về mặt lý thuyết, chủng loại các pha tĩnh, pha động cũng như ứng dụng sắc ký lớp mỏng và sấc ký cột khá giống nhau Với những kết quả khả quan của sắc ký lớp mỏng, chúng ta có thể tách riêng từng thành phần hỗn hợp bằng sắc ký cột.

Ngoài sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột ra, còn có một số phương pháp phổ biến như: trao đổi ion, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) w

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỂ KHÁNG SINH

1.5.1 Vi khuẩn kháng thuốc và ý tưởng mới về kháng sinh [4]

Những năm vừa qua, trên phạm vi thế giới, người ta thấy tái xuất hiện các bệnh nhiễm trùng, trong đó có bệnh tả, sốt rét, sốt rét vàng, bạch hầu Thêm vào đó lao và HIV như một “cặp bài trùng” đang hoành hành và việc khống chế bệnh lao ở những người bị nhiễm HIV rất khó khăn Việc sử dụng thường xuyên và không hợp lý thuốc kháng sinh, cả cho người lẫn súc vật, là một trong số các yếu tố chủ yếu làm tăng khả năng kháng thuốc Các thuốc kháng sinh trở thành nạn nhân của chính sự thành công của nó Có khoảng

40% Streptocoques gây ra bệnh viêm phổi đã kháng lại thuốc penicillin Một thực tại đáng lo ngại là Staphylococcus aureus hiện đã kháng lai thuốc kháng

sinh, trừ vancomycin Theo một số nhà khoa học, nếu như sự kháng thuốc này lan sang các vi khuẩn khác thì người ta sợ sự tái xuất hiện các bệnh “đã rơi vào quên lãng”

Việc tìm kiếm những thuốc kháng sinh mới là một trong những việc làm cần thiết Hiện có khoảng 160 thuốc kháng sinh có trên thị trường và nhiều thuốc kháng sinh đang được triển khai Theo các nhà khoa học thì oxazolidones là các dẫn chất mói đầy hứa hẹn Cấu trúc hoá học của nó khác với cấu trúc thuốc kháng sinh hiện nay Nó phát huy tác dụng bằng cách ức

chế việc tổng hợp protid ở giai đoạn rất sớm Một loạt các tác nhàn mới gốc peptid và steroid tìm thấy ở cá mập và ếch đã thu hút sự chú ý của Magainin Inc một công ty công nghệ sinh học Hoa Kỳ Một tác nhân chống vi khuẩn everninomicin, tách ra từ vi khuẩn đất, tỏ ra rất hứa hẹn Cubist Pharmaceuticals kết hợp việc chọn lọc các phân tử vi khuẩn với việc mô hình hoá phân tử để cho ra một chất ngăn chặn sự hợp thành (synthetase) vi khuẩn Các nhà khoa học khác lại tìm cách thay đổi cấu trúc hoá học của các hợp chất hiện nay nhằm lẩn tránh cơ chế kháng thuốc Đó là cách tiếp cận của Phone- Poulenc với streptogramin Còn Elililly thì dùng “vancomycin” mới chất này, vói mã hiệu LY 333328 là glycopeptid bán tổng hợp, phát huy tác dụng bằng cách cản trở việc tạo nên vách vi khuẩn, nó có tác dụng với cả các vi khuẩn kháng được vancomycin Người ta đang tiến hành các công trình nghiên cứu

để tìm ra một loại thuốc ngăn chặn sự kháng thuốc isoniazid của trực khuẩn

lao (Mycobacterium tuberculosis).

1.5.2 Hướng nghiên cứu mới trong tinh chế kháng sinh nhóm Vancomycin [ 15 ]

Trong những năm trở lại đây, trước tình hình vi khuẩn đang kháng thuốc ngày một nhiều thì vancomycin được xem như một nhóm kháng sinh rất

quan trọng trên lâm sàng , đặc biệt trong điều trị với Staphylococus aureus.

Do đó việc nghiên cứu nhóm kháng sinh này đang được các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm Trong một công bố gần đây, các nhà khoa học Trung Quốc đã đưa ra một phương pháp tinh chế kháng sinh nhóm vancomycin độc đáo Nguyên tắc của phương pháp dựa trên chính cơ chế tác dụng của vancomycin :kháng sinh nhóm vancomycin diệt vi khuẩn Gram (+) bằng cách liên kết với vách tế bào peptidoglycan của vi khuẩn ở c cuối cùng trong chuỗi D - Ala - D - Ala Dựa trên cơ sở đó, các chuỗi hấp phụ nhóm

kháng sinh vancomycin được tạo nên bởi các đoạn giống như peptidoglycan D

- Ala - D - Ala, succinyi - D - Ala và - succinyl - Gly kết nối với một polymer

Sau khi kháng sinh được hấp phụ, họ tiến hành phản hấp phụ bằng một

số hệ phản hấp phụ như: NaCl 0,5 M; nước - acetonitrile (7:3;v/v)(2); 0,4M NH^acetonitrile (5:5,v/v)(3), Na2C03 0,4M/acetonitrile (7:3;v/v)(4) Đối với hệ thân nước (ionic)(1) làm giảm khả năng phản hấp phụ, đối với hệ sơ nước (2) cho phần trăm phản hấp phụ thấp, hệ kết hợp (3), (4) cho phần trăm phản hấp phụ cao hơn, trong đó nếu sử dụng dung dịch điện ly mạnh Na2C03 thì phần trăm phản hấp phụ cao hơn sử dụng điện ly yếu là NH3

1.5.3 Actinohỉvin kháng sinh chống HIV bằng cách ngăn cản sự xâm nhập virus vào tế bào [ 16 ]

Vài năm trước, giống WK-3419 và FO-2338 đã được tìm thấy sản xuất

ra hai hợp chất mới là: Chloropeptin và isochormophilone I và II Cả hai hợp chất mới này đều có tác dụng chống HIV dựa trên khả năng ức chế gp 120 - CD4 Gần đây, theo một nghiên cứu mới nhất, Viện Kitasato - Nhật Bản công

bố một chất mới với tên gọi actinohivin Actinohivin được sinh tổng hợp bởi

chủng Actinomyces K97-0003.Nhóm nghiên cứu đã tiến hành nhiều thử

nghiệm để kiểm tra hoạt tính sinh học và cơ chế tác dụng của actinohivin Họ

đã thử nghiệm sự liên kết của actindhivin với các loại protein vỏ ngoài HIV-1 bao gồm cả phần không đường và gpl30 của SIV Kết qủa ,actinofũvin đã liên kết với mọi glycoprotein ngoại trừ phần không đường.Kết quả này chỉ ra rằng, actinohivin liên kết với saccharide của protein

Tiếp đến, họ kiểm tra ái lực của actinohivin với gpl20 Actinohivin được cho vào 96 vi giếng đã gắn sẵn gpl20 tái tổ hợp, CD4 tái tổ hợp hoặc BSA, nhận thấy actinohivin liên kết với gp 120 tái tổ hợp nhưng không liên kết với CD4 và BSA Họ cũng đã kiểm tra ảnh hưởng của một vài đường và protein tới sự liên kết giữa actinohivin và gpl20 Chỉ duy nhất men malt là ức chế sự liên kết này còn manóse hay methy-a manopyranosid đều không ảnh hưởng Đối với gpl20 , phần carbonhydrat chiếm xấp xỉ 50% tổng trọng lượng phân tử Phần carbonhy drat của gp 120 bao gồm 24 cầu N- oligosaccaride có 11 manóse cao và 13 kiểu phức hợp Sự kết hợp đặc hiệu của actinohivin và 13 kiểu phức hợp Sự kết hợp đặc hiệu của actinohivin với các glycoprotein có cầu N đã được xác định bởi phương pháp ELISA Như vậy, actinohivin liên kết với một vài glycoprotein có chứa manóse tỷ lệ cao kiểu oligosaccaride Phát hiện này đã mở ra một đích mới cho liệu pháp và thuốc ngăn ngừa HIV/ADS/gần đây, M Boyd và cộng sự cũng đã đưa ra một chất có tác dụng theo cơ chế tương tự là cyanovirin - N, nó có chứa 101 aminoacid Hiện naỵ, theo số liệu điều tra mỗi ngày có hơn 15000 trường hợp nhiềvnHIV, 95% ở những nước phất triển Việc tìm ra actinohivin và cyanovirin - N hy vọng mở ra một bước tiến mới trong việc sử dụng những vi khuẩn điển hình hữu ích ngăn chặn lây nhiễm HIV

1.5.4 Phát hiện mới về Boromycin [ 17 ]

Trong đợt sàng lọc khả năng chống HIV của hệ thống vi sinh vật, với hơn 1000 mảu dịch chiết butanol của các dịch lên men được kiểm tra, các nhà

khoa học Nhật Bản đã tìm thấy Streptomyces sp A 3376 sản xuất một chất có

tác dụng chống HIV gọi là TMC - 25 TMC - 2 5 đã được xác định nghiên cứu

về cấu trúc và cho thấy TMC - 25 giống như boromycin, một kháng sinh polyether -macrolid Boromycin đã từng được biết đến như một kháng sinh chống virus, nấm Phát hiện mới về khả năng kháng HIV mở ra một hướng sử dụng mới đối với boromycin về cơ chế chống HIV của boromycin, họ cho rằng kháng sinh này tham gia ngăn cản giai đoạn chín trong kỳ phát triển của HIV

1.5.5 Adriamycin một kháng sinh chống ung thư mới [18 ]

Streptomyces peucetius var caesius xuất phát từ chủng S.peucetius, là

nhóm vi sinh vật sản sinh daunomycin Daunomycin là một kháng sinh điều trị ung thư đã được chứng minh có hiệu quả tốt trên lâm sàng đặc biệt trong điều trị leucemi ở trẻ em Bằng việc đột biến với tác nhân N - nitroso - N- methyluretan, đã thu được biến chủng mới dẫn đến sự khác nhau trong qua trình hình thành hệ sợi sinh trưởng, đặc biệt, đó là có sự tích luỹ adriamycin kháng sinh có cấu trúc khác với daunomycin, ở giai đoạn này Các tác giả đã

nghiên cứu điều kiện lên men điển hình để tạo adriamycin Speucetius var

caesius được phát triển trong 10 ngày ở 28°c Đến giai đoạn phát triển hệ sợi

xuất hiện màu đỏ Lấy biến chủng giai đoạn này làm giống để nhân giống cho bình lên men 8001 Giống được nuôi cấy cho phát triển 48 giờ (501/801) rồi cấy sang bình lên men 8001 chứa 5001 môi trường lên men và lên men 120giờ Adriamycin được phân lập có cấu trúc 14 hydroxy daunomycin, tác dụng ức chế ung thư biểu mô, saccom và ung thư tuỷ ác tính Hiện nay, liệu pháp sử dụng adriamycin điều trị phổ biến hơn daunomycin

1.5.6 Micromonospora echinospora (ATCC15331) sản xuất kháng sinh

[ 19]

Ngược lại với Strytomyces, chi Micromonospora ít được quan tâm

nghiên cứu mặc dù tầm quan trọng công nghiệp của nó không phải nhỏ Gemtamycin là một kháng sinh quan trọng của nhóm aminoglycosid được sản

xuất từ chi Micromonospora Gần đây, hợp chất mới giữa megalomicin và calicheamicin đã được phân lập từ loài Micromonospora và nhận thấy có tác

dụng chống ung thư, virus, ký sinh trùng Qua các theo dõi trong suốt quá

trình phát triển với Micromonospora echinospora, người ta nhận thấy chủng

này cũng có khả năng sinh gentamycin Sản phẩm kháng sinh xuất hiện sau 72giờ đạt nồng độ khoảng 0,032|ig/ml và lập tức giảm nhanh tới 0 Ịig/ml sau 144giờ Theo các nhà khoa học, điều này cho thấy sự phân biệt rõ ràng giữa pha sinh trưởng và quá trình tạo bào tử, hai quá trình này hoàn toàn được điều khiển biệt lập Nó đưa ra thực tế rằng, sự sản xuất kháng sinh đòi hỏi phải có quá trình hình thành hệ sợi vi sinh vật và quá trình tạo bào tử sẽ chấm dứt quá trình sản xuất kháng sinh

1.5.7 Kháng sinh nhóm polyen chống nấm từ cơ chất Việt Nam [5 ]

Từ 125 mẩíi đất của tỉnh Quảng Nam và Thành phố Đà Nẵng, Đỗ Thu

Hà và các cộng sự đã phân lập được 58% chủng xạ chuẩn chi Streptomyces

Nhóm nghiên cứu đã sơ bộ tìm thấy 90 chủng hoạt tính kháng sinh nhóm polyen chống nấm chiếm tỷ lệ 15,33%, trong đó có nhiều chủng có khả năng sinh các chất kháng sinh có thể có giá trị còn ít được thông báo trên thế giới

và ở Việt Nam Đây chính là nguồn gen quí hiếm để có thể chọn lựa những chủng có hoạt tính kháng sinh cao, hoạt phổ rộng, ứng đụng trong sản xuất dịch kháng sinh thô dùng trong trổng trọt và chăn nuôi tại khu vực Quảng Nam-Đà Nẵng rất tốt

PHẦN II THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

♦ Giống xạ khuẩn:

Chủng Micromonospora N °9 được phân lập từ cơ chất ở Việt Nam có

độ ổn định sinh học cao, có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đã qua một số lần đột biến cải tạo giống do phòng thí nghiệm vi sinh kháng sinh bộ môn Công nghiệp dược và Tổ môn Vi nấm kháng sinh trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

♦ Chủng vi sinh vật kiểm định:

Hai chủng vi sinh vật có độ mẫn cảm cao với kháng sinh từ

Micromonospora N °9 được dùng làm vi sinh vật kiểm định là: Bacilus pumilus ATCC 1G241 (G+) và Escherichia colỉ ATCC 25922 (G -).

♦ Các môi trường đã sử dụng:

- Môi trường Gauze 1 (MTl):tinh bột 20g;K2HP04 0,5g;MnS04.7H200,5g; NaCl 0,5g; KN03 lg; FeS04.7H20 lOmg; thạch 18g; nước máy vđ1000ml pH 7,0-7,2, tiệt trùng ở latt/30 phút

- Môi trường Gauze 1 lỏng (MT2): tinh bột 20g; K2HPO4 0,5g; MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; KN03 lg; FeS04.7H20 lOmg; nước máy vđ 1000ml pH 7,0-7,2 tiệt trùng ở latt/30 phút

- Môi trường lên men tối ưu II (MT4): tinh bột 54,Og; K2HPO4 2,8g;MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; KN03 2,0g; FeS04.7H20 lOmg; nước máy vđ 1000ml pH 7,0-7,2 tiệt trùng ở latt/30 phút

- Môi trường thạchthường (MT5): pepton 5g; NaCl 5g; cao thịt 3g; thạch 18g; nước máy vđ 1000ml pH 7,0-7,2 tiệt trùng ở 0,9att/30 phút

- Môi trường canh thang (MT6): pepton 5g; NaCl 5g; cao thịt 3g; nướcmáy vđ tiệt trùng ở 0,9 att/30 phút.

♦ Các dung môi đã sử dụng:

- Dung môi chết: Cloform (d = 1,475-1,471; t°s = 60-62°C)

Dung môi khác: Dimethylformamid, ethylacetat, rv-butanol, ethanol, methanol, ìvhexan, aceton

♦ Tác nhân đột biến: ánh sáng u v với nguồn phát là đèn điện tử ngoại Toshiba

♦ Nguyên liệu dùng cho sắc ký:

2.1.2.Phương pháp nghiên cứu

♦ Phương pháp tạo giống: Cải tạo giống bằng phương pháp đột biến gây tạo kết hợp với sàng lọc ngẫu nhiên

, , ' , (Ị

- Pha hỗn dịch bào tử: dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy bào

tử Micromonospora N °9 cho vào 10ml nước muối đẳng trương vô trùng lắc

cho bào tử phân tán đều Dùng 9ml hỗn hợp dịch bào tử này cho vào một đĩa petri vô trùng

- Chiếu ánh sáng UV: đĩa petri chứa hỗn dịch bào tử đem chiếu ánh sáng UVvới liều lượng xác định Để đĩa petri chữa hỗn hợp dịch bào tử sau chiếu ánh sáng u v vào chỗ tối 2 - 4 giờ, sau đó dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10'5'

- Cấy các bào tử sau đột biến: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 1er4 và 10'5 nhỏ vào bề mặt môi trường Gauze 1 trong đĩa petri,dàn đều bằng que trang.Mỗi độ pha loãng làm 3đĩa.Tiến hành tương tự với mẫu chứng ở nồng độ 10'6.Các đĩa được ủ ở 32°c trong 6 ngày

- Đếm số khuẩn lạc để xác định % độ sống sót theo công thức:

% Độ sống sót = JÏLxl00%

m

Ni : là số khuẩn lạc trung bình sau đột biến

NO : là số khuẩn lạc trung bình trong mẫu chứng.

♦ Phương pháp sàng lọc sau đột biến:

Các khuẩn lạc sau đột biến khi đã đủ thòi gian nuôi cấy 6 ngày được lựa chọn ngẫu nhiên và cấy zigzac lên bề mặt môi trường Gauze 1 trong đĩa petri

ủ ở 32°c trong 6 ngày rồi lấy ra thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp khối thạch Làm tương tự với mẫu chứng, % biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức: