Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng streptomyces 324

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI Nguyễn Thị Thanh Dung GÓP PHẤN NGHIÊN cứu KHÁNG SINH TỪ CHỦNG STREPTOMYCES 324 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1997-2002) Người hướng dãn: TS. CAO VĂN THU ThS. KIỀU THỊ HỒNG Nơi thực : Bộ MÔN CÔNG NGHIỆP Thời gian thực hiện'. 3/2002-Ỗ/2002 Hà Nội, 05/2002 Dược LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS. Cao Văn Thu ThS. Kiều Thị Hồng. Những thầy cô trực tiếp hướng dẫn làm khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán bộ, kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dược nhiệt tình giúp đỡ trình thực khoá luận. Với trình độ thân hạn chế thời gian làm khoá luận không nhiều, chắn khoá luận nhiều thiếu sốt. Tôi mong thầy cô bạn bè đồng nghiệp góp ý kiến để khoá luận hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà n ộ i, ngày 10 tháng năm 2002 Sinh viên NGUYỄN THỊ THANH DUNG MỤC LỤC Đ ặ t vấn đề Phần Tổng quan 1.1 1.1.1 Trang ỹ Kháng sinh Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Sơ đồ sản xuất kháng sinh 1.2 Xạ khuẩn Streptomyces 1.2.1 Xạ khuẩn .2.2 Đặc điểm hình thái sinh lý xạ khuẩn chi Streptomyces 1.2.3 Phân loại Streptomyces 1.2.4 Khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 1.3 Cải tạo giông v s v 6 1.3.1 Mục đích .3 .2 Các phương pháp cải tạo giống 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Lên men mặt 1.4.2 Lên men chìm 1.5 Tách chiết tình chê 11 1.6 Một sô'thành tựu nghiên cứu kháng sinh 12 Phần 2.1 2.1.1 Thực nghiệm kết 15 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 15 Nguyên liệu 15 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2 Kết nhận xét 25 Phần Kết luận đề xuất 38 3.1 Kết luận 38 3.2 Đề xuất 38 Tài liệu tham khảo Phu luc CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT A Agitation ADN Acid deoxyribonucleic AIDS Acquired immunodeficiency syndrome As Aspergillus niger BC Bacillus cereus ATCC 9946 BP Bacillus pumilus ATC C 10241 BS Bacillus subtilis ATCC 6633 Cd Candida albicans D(mm) Đường kính vòng vô khuẩn trung bình dmhc Dung môi hữu DO Dissolved oxygen E Aeration EC Escherichia coli ATCC 25922 ELISA Enzym linked immunosorbent assay hair HIV Human immunodeficiency virus Pseu Pseudomonas aeruginosa VM 201 Pro Proteus mirabilis B V 108 MT Môi trưòtig MTdd Môi trường dung dịch N Pha nước s Spirales s Sai sô chuẩn hiệu chỉnh Sa Saccharomyces cerevisiae Sal Salmonella typhi DT 220 Shi Shigella flexneri DTI 12 sp spiny sta Staphylococcus aureus ATC C 1228 RA Retinaculiaperti RF Rectiflexibiles V Verticillati v sv Vi sinh vật wa warty ĐẶT VẤN ĐỀ ■ Streptomyces chi xạ khuẩn nhiều nhà khoa học nước quan tâm nghiên cứu, Các công trình nghiên cứu chứng minh: loài Streptomyces có khả sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng có cấu trúc đặc điểm kháng khuẩn khác nhau, số loài chi có khả sinh tổng hợp chất chữa ung thư điều trị HIV/AIDS. Các nhà khoa học Việt Nam chứng minh rằng: xạ khuẩn Streptomyces có mặt đất Việt Nam có khả sinh tổng hợp kháng sinh có tác dụng tốt (ví dụ: dekamycin .w ). Do đó, việc tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy lên men loài thuộc chi này, nhằm thu hiệu suất sinh tổng họfp kháng sinh cao nhiều công trình nghiên cứu. Đồng thời, qui trình chiết tách tinh chế kháng sinh từ môi trưòng nuôi cấy nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường đại học Dược Hà Nội tiến hành phân lập nghiên cứu số chủng Streptomyces có đất nông nghiệp tỉnh Thanh Hoá. Trong số đó, qua thử tác dụng sơ bộ, Streptomyces 324 chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng có tiềm ứng dụng thực tế. Từ phân tích trên, khoá luận "Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Streptomyces 324” tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: . - Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý nhằm phần loại, xác định tên khoa học chủng Streptomyces 324. - Chọn giống sinh tổng hợp kháng sinh tốt chọn lọc ngẫu nhiên đột biến cải tạo giống. - Bước đầu nghiên cứu môi trường nuôi cấy môi trường lên men. - Bước đầu xây dựng qui trình chiết tách - tinh chế sản phẩm. Phần 1: TỔNG QUAN 1.1. K háng sinh [1] [6] [9] 1.1.1. Định nghĩa: Kháng sinh sản phẩm đặc biệt nhận từ vi sinh vật (VSV) hay nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm tiêu diệt cách chọn lọc lên nhóm vi sinh vật xác định. 1.1.2. Phân loại kháng sinh: Kháng sinh phân loại theo nguồn gốc, chế tác dụng, cấu trúc hoá học. Trong đó, phân loại theo cấu trúc hoá học xem phân loại quan trọng nhất. Theo cấu trúc hoá học, kháng sinh phân loại thành nhóm: 1. Nhóm ß-Lactam: - Nhóm penicilin: penicilin V, penicillin G. - Nhóm cephalosporin: ceftriaxon, Cefuroxim . - Các monobactam: aztreonam - Các chất ức chế ß-lactamase : acid clavulanic . 2. Nhóm Aminosid: Streptomycin, gentamycin . 3. Nhóm Amphenicol: cloramphenicol, thiamphenicol . 4. Nhóm Tetracyclin: tetracyclin, Oxytetracyclin, doxycyclin . 5. Nhóm Macrolid: Erythromycin, spiramycin . . Nhóm Rifamicin: Rifampicin . 7. Nhóm Quinolon: ciprofloxacin . 1.1.3. Sơ đồ sản xuất kháng sinh: Hình 7. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh. 1.2. Xạ khuẩn chi Streptom yces [4] [12] 1.2.1. Xạ khuẩn (Actinomycetales): • Đặc điểm chung: Xạ khuẩn, gọi khuẩn tia, phân bố rộng rãi tự nhiên: đất, bùn ao, nước chất thải hữu cơ. Xạ khuẩn lớp vi khuẩn lại phát triển tạo sợi giống nấm mốc, v s v hiếu khí. Xạ khuẩn có số đặc điểm sau; - Đưòỉng kính sợi xạ khuẩn 0,5 - 5|Lim. - Màng tế bào celullose, kitin. - Phân chia tế bào theo kiểu phân bào vô tính. - Không có giống đực giống cái. v / - Trên môi trường đặc: khuẩn lạc rắn chắc, xù xì, có màu không màu. - Nhuộm màu Gram(+). • Phân loại: Sơ hệ phân loại xạ khuẩn đến họ, riêng họ Streptomycetaceae đến hai chi Streptomyces Micromonospora trình bày hình 2. Actinomycetales ▼ Actinoplanaceae Actinomycetaceae Streptomycetaceae t Streptomyces Hình 2: Sơ phân loại xạ khuẩn Micromonospora 2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng loại môi trường lên men đến khả sinh tổng hợp kháng sinh Đánh giá khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 324 thay đổi môi trường để chọn môi trưcmg tốt cho trình nuôi cấy lên men. Kết trình bày bảng Bảng 4: Ảnh hưởng loại môi trưòtig đến khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 324 nuôi cấy bề mặt Hoạt lực kháng sinh Môi trường Pseu BP D(mm) s D(mm) s MTl 13,20 0,34 13,87 0,89 MT2 12,65 ,8 11,56 0,29 MT3 15,04 0,47 14,66 0,72 MT4 ,0 ,0 ,0 ,0 MT5 ,0 ,0 ,0 ,0 MT6 ,0 ,0 ,0 ,0 Nhận xét: - Streptomyces 324 không sinh tổng hợp kháng sinh MT4, MT5, MT6 . Các nghiên cứu không chọn môi trường này. - Streptomyces 324 phát triển tốt cho hoạt tính kháng sinh mạnh môi trường giàu c, N (MTl, MT2, MT3). - Trong số môi trường khảo sát, MT3 môi trường Streptomyces 324 sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất. Sau nuôi cấy bề mặt tiến hành lên men máy lắc để khảo sát khả sinh tổng họfp kháng sinh Streptomyces 324 môi trường khác nhau. Đánh giá hoạt tính kháng sinh dịch lọc sau lên men phưoỉng pháp đục lỗ thạch. Kết trình bày bảng 5. Hoạt lực kháng sinh Môi trường Pseu BP D(mm) s D(mm) s MTl dd 11,50 0,78 12,85 0,74 MT2dd 13,06 0,43 12,67 0,51 MT3 dd 17,55 0,16 15,52 0,26 MT4dd ,0 ,0 ,0 ,0 MT5dd ,0 ,0 ,0 ,0 MT6 dd 14,25 ,2 15,54 0,50 Nhận xét: - Streptomyces 324 không sinh tổng hợp kháng sinh MT4, MT5. Như trình sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 324 bột đậu tưoíng, saccarose nguồn dinh dưỡng không thích họp. Ngoài nồng độ cao glucose có tác động bất lợi. - Trên MT3, Streptomyces 324 sinh tổng kháng sinh mạnh nhất. Căn vào thành phần môi trường thấy Streptomyces 324 sinh tổng họỉp kháng sinh tốt môi trường giàu c, N. Nếu nguồn cung cấp cacbon đường nồng độ đưcmg khoảng 3%, đưcmg nguồn cung cấp cacbon khác phải tăng nồng độ lên. Ngoài môi trưòfng cần phải có CaC0 với nồng độ 0,3 - 0,4%. - Trên MT6 , khác với lên men bề mặt, lên men chìm Streptomyces 324 có sinh tổng hợp kháng sinh. Như trình sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 324 MT6 cần phải có cung cấp ôxy cách lắc máy lắc. Đồng thời thấy nghiên cứu ảnh hưởng loại môi trường lên khả sinh tổng hợp kháng sinh cần nghiên cứu ảnh hưởng môi trưcmg nuôi cấy bề mặt lên men có kết luận xác. Kết hai bảng cho thấy: Streptomyces 324 sinh tổng kháng sinh mạnh MT3 nuôi cấy bề mặt lên men chìm. Các nghiên cứu chọn MT3 làm môi trường nuôi cấy lên men. 2.2.4. Kết chọn lọc ngẫu nhiên Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên để chọn dạng hoạt tính tốt Streptomyces 324 để tiến hành nghiên cứu tiếp. Kết trình bày bảng hình (phần phụ lục). Bảng 6: Kết chọn lọc ngẫu nhiên Kết Ký hiệu Pseu BP biến s s D(mm) D(mm) chủng 15,88 0,29 14,65 1,11 Ký Kết hiêu BP Pseu biến s D(mm) s D(mm) chủng 17 14,43 0,45 16,21 1,64 14,61 1,07 15,07 0,51 18 12,37 0,53 13,41 1,15 14,00 0,75 15,05 0,06 19 13,97 2,11 11,80 1,44 15,33 1,05 15,37 0,47 20 13,77 0,78 12,50 1,56 13,70 0,62 14,92 21 14,04 1,16 13,49 1,61 14,40 0,45 15,49 0,37 0,64 22 11,89 1,66 12,84 2,47 15,10 0,71 14,75 0,93 23 15,10 16,20 4,77 14,91 0,09 15,03 1,15 24 13,63 1,31 0,84 12,39 1,94 14,49 0,43 14,45 1,13 25 13,11 1,16 13,23 0,33 10 13,46 0,43 14,18 1,26 26 11,54 3,98 12,84 0,85 11 12,57 0,99 14,01 1,23 27 14,32 0,53 13,12 12 13,21 1,37 13,43 1,11 28 15,04 0,47 14,66 0,36 0,72 13 13,64 0,80 16,25 0,35 29 14,01 0,46 13,17 1,00 14 13,98 15,09 1,49 30 12,53 1,43 13,36 0,69 15 14,28 0,31 0,77 14,60 1,05 31 15,57 0,51 13,87 1,18 16 13,55 0,25 13,44 0,39 32 14,72 0,60 13,34 0,41 Sau xử lý kết giữ lại biến chủng có ký hiệu 4, 13, 17 để tiến hành lên men chìm. Dịch lên men sau lọc loại sinh khối, đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp đục lỗ thạch, kết giói thiệu bảng 7. Bảng : Hoạt tính kháng sinh biến chủng 4,13,17 sau lên men chìm Pseu BP Ký hiệu biến chủng D(mm) s D(mm) s 11,97 0,94 13,39 1,32 13 12,04 0,14 17,05 0,05 17 11,77 0,39 16,39 0,35 Nhận xét: bảng , cho thấy - Dịch lọc biến chủng số 13 17 có hoạt tính kháng sinh mạnh hon biến chủng số 4. - Kết chọn lọc ngẫu nhiên có ý nghĩa nghiên cứu ban đầu chủng có hoạt tính cao sau chọn lọc ngẫu nhiên chủng tốt cho trình lên men. - Khi nuôi cấy bề mặt kháng sinh chủng số 13 sinh tổng hợp có hoạt tính yếu lên men chìm hoạt tính tăng lên. Trong nghiên cứu sử dụng giống biến chủng số 13. 2.2.5. Khảo sát thời gian lên men chìm Để xác định thòi điểm kết thúc lên men, sau truyền giống, hoạt tính kháng sinh dịch lọc thòi điểm khác đánh giá phương pháp đục lỗ thạch. Kết trình bày b bảng hình 4, Thông số D(mm) s Thời gian lên men (h) 24 48 72 96 120 144 ,0 6,46 8,53 14,77 15,54 12,36 ,0 0,32 0,25 0,40 0,50 0,64 18 D [...]... tetracyclin: Khỏng sinh Chng Streptomyces sinh tng hp Oxytetracyclin rimosus Tetracyclin aureofaciens Nhúm macrolid: Khỏng sinh Chng Streptomyces sinh tng hrp Erythromycin erythreus Oleandomycin antibioticus Spiramycin ambofaciens Khỏng sinh chng nm Khỏng sinh Chng Streptomyces sinh tng hp Nystatin noursei Amphotericin B nodosus Nhng khỏng sinh khỏc: Khỏng sinh Chng Streptomyces sinh tng hp Actinomycin... xột: Khỏng sinh do chng Streptomyces 324 sinh tng hp khụng cú tỏc dng trờn EC - Khỏng sinh do Streptomyces 324 sinh tng hp cú tỏc dng mnh nht trờn BP v Pseu Cỏc bc nghiờn cu tip theo chn vi khun BP (gram (+)) v Pseu (gram(-)) lm hai vi khun kim nh i din 2.2.3 Nghiờn cu nh hng ca cỏc loi mụi trng lờn men n kh nng sinh tng hp khỏng sinh ỏnh giỏ kh nng sinh tng hp khỏng sinh ca chng Streptomyces 324 khi... chn cỏc mụi trng ny - Streptomyces 324 phỏt trin tt v cho hot tớnh khỏng sinh mnh trờn mụi trng giu c, N (MTl, MT2, MT3) - Trong s cỏc mụi trng kho sỏt, MT3 l mụi trng Streptomyces 324 sinh tng hp khỏng sinh tt nht Sau khi nuụi cy b mt chỳng tụi tin hnh lờn men trờn mỏy lc kho sỏt kh nng sinh tng hfp khỏng sinh ca Streptomyces 324 trờn cỏc mụi trng khỏc nhau ỏnh giỏ hot tớnh khỏng sinh ca dch lc sau... - Saccarose Raffinose + T kt qu trờn cú th s b kt lun Streptomces 324 cú tờn khoa hc l Streptomyces misionensis 2.2.2 Kh nng sinh tng hp khỏng sinh ca chng Streptomyces 324 trờn M T l Hot tớnh ca khỏng sinh do chng Streptomyces 324 sinh tng hp trờn MTl c th trờn mt s v s v kim nh, kt qu c trỡnh by bng 3 Bng 3: Hot tớnh ca khỏng sinh trờn mt sụ v s v kim nh v s v kim nh EC ng kớnh vũng vụ khun (mm)... chớnh phõn loi chi Streptomyces v t tờn l International Streptomyces Project (ISP) Khoỏ phõn loi ISP da trờn cỏc c im: - Mu b mt khun lc - B mt, hỡnh dng bo t - Mu khun ty c cht - Hỡnh dng chui bo t - S tiờu th ngun carbon 1.2.4 Kh nng sinh tng hp khỏng sinh ca Streptomyces Streptomyces cú kh nng sinh tng hp cỏc loi khỏng sinh Nhúm aminoglycosid: Khỏng sinh Chng Streptomyces sinh tng hp Kanamycin... khụng rừ rng thỡ ỏnh du () 2.2 Kt qu v nhn xột 2.2.1 Xỏc nh tờn khoa hc ca Streptomyces 324 Sau khi nuụi cy trờn cỏc mụi trng ISP, so sỏnh c trng ca Streptomyces 324 vi Streptomyces misionensis, Kt qu c trỡnh by bng 2 v hỡnh 5, hỡnh 6 (phn ph lc) Bng 2: Cỏc c trng ca Streptomyces 324 v Streptomyces misonensis Streptomyces 324 Gy Streptomyces misionensis GyR 1 1 0 0 0 0 B mt bo t s sm s sm Arabinose +... Trờn MT3, Streptomyces 324 sinh tng khỏng sinh mnh nht Cn c vo thnh phn mụi trng thy Streptomyces 324 sinh tng hp khỏng sinh tt nht trờn cỏc mụi trng giu c, N Nu ngun cung cp cacbon l ng thỡ nng cmg khong 3%, nu khụng cú cmg thỡ ngun cung cp cacbon khỏc phi tng nng lờn Ngoi ra mụi trũfng cn phi cú CaC0 3 vi nng 0,3 - 0,4% - Trờn MT6 , khỏc vi lờn men b mt, khi lờn men chỡm Streptomyces 324 cú sinh tng... cú sinh tng hp khỏng sinh Nh vy quỏ trỡnh sinh tng hp khỏng sinh ca Streptomyces 324 trờn MT6 cn phi cú s cung cp ụxy bng cỏch lc trờn mỏy lc ng thi cú th thy khi nghiờn cu nh hng ca cỏc loi mụi trng lờn kh nng sinh tng hp khỏng sinh cn nghiờn cu nh hng ca mụi trcmg ú khi nuụi cy b mt v lờn men thỡ mi cú kt lun chớnh xỏc Kt qu hai bng trờn cho thy: Streptomyces 324 sinh tng khỏng sinh mnh nht trờn MT3... ca cỏc loi mụi trũtig n kh nng sinh tng hp khỏng sinh ca Streptomyces 324 khi nuụi cy b mt Hot lc khỏng sinh Mụi trng Pseu BP D(mm) s D(mm) s MTl 13,20 0,34 13,87 0,89 MT2 12,65 0 ,8 8 11,56 0,29 MT3 15,04 0,47 14,66 0,72 MT4 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 MT5 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 MT6 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 Nhn xột: - Streptomyces 324 khụng sinh tng hp khỏng sinh trờn MT4, MT5, MT6 Cỏc nghiờn... bng 5 Hot lc khỏng sinh Mụi trng Pseu BP D(mm) s D(mm) s MTl dd 11,50 0,78 12,85 0,74 MT2dd 13,06 0,43 12,67 0,51 MT3 dd 17,55 0,16 15,52 0,26 MT4dd 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 MT5dd 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 MT6 dd 14,25 0 ,2 2 15,54 0,50 Nhn xột: - Streptomyces 324 khụng sinh tng hp khỏng sinh trờn cỏc MT4, MT5 Nh vy cú th trong quỏ trỡnh sinh tng hp khỏng sinh ca Streptomyces 324 bt u toớng, saccarose . hợp kháng sinh phổ rộng và có tiềm năng trong ứng dụng thực tế. Từ những phân tích trên, khoá luận " ;Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Streptomyces 324 được tiến hành nghiên cứu với. antibioticus Spiramycin ambofaciens Kháng sinh chống nấm Kháng sinh Chủng Streptomyces sinh tổng hợp Nystatin noursei Amphotericin B nodosus Những kháng sinh khác: Kháng sinh Chủng Streptomyces sinh tổng hợp Actinomycin. carbon. 1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp các loại kháng sinh • Nhóm aminoglycosid: Kháng sinh Chủng Streptomyces sinh tổng hợp Kanamycin kanamyceticus Neomycin fradiae Tobramycin