Góp phần nghiên cứu tanin trong chè dây (ampelopsis cantoniensis planch vitaceae)

Chè dây là dược liệu đã được nghiên cứu về thực vật, xác định tên khoa học, về thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học.. Để góp phần nâng cao giá trị sử dụng của cây chè

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

PHẠM THUỲ DƯƠNG

Ampelopsis cantoniensis Planch Vitaceae

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1999 - 2004)

- Người hướng dẫn

- Nơi thực hiện -Thời gian thực hiện

GS.TS PHẠM THANH KỲ

BỘ MÔN DƯỢC LIỆU

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn :

GS.TS Phạm Thanh Kỳ Người thầy đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn em trong suốt quá trình làm khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn :

TS Cao Văn Thu - Bộ môn Vi sinh

TS Nguyễn Thái An - Bộ môn Dược cổ truyền

TS Trần Vân Hiền - Phòng Đông Y thực nghiệm

TS Đỗ Ngọc Thanh - Phòng thí nghệm trung tâm Cùng tất cả các thầy cô giáo, các cô kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, Bộ môn

Vi sinh và các phòng ban đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận này

Nhân dịp này em xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè và người thân đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ em trong quá trình học tập cũng như làm khoá luận

Hà N ộ i, tháng 5 năm 2004

Sinh viên Phạm Thuỳ Dương

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đ ê 1

Phần 1: Tổng q u an 2

1.1 Tổng quan về cây chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.) 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật và sự phân bố 2

1.1.2 Thành phần hoá học 3

1.1.3 Tác dụng sinh học 5

1.1.4 Công dụng 7

1.2 Tổng quan về tanin 8

1.2.1 Khái niệm về tanin 8

1.2.2 Cấu trúc hoá học của tanin 8

1.2.3 Tác dụng và công dụng 12

Phần 2: Thực nghiệm và kết q u ả 14

2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 14

2.1.1 Nguyên liệu 14

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 14

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 17

2.2.1 Định tính tanin trong lá chè dây bằng các phản ứng hóa họ c 17

2.2.2 Chiết xuất t a n i n 18

2.2.3 Phân lập tanin 28

2.2.4 Sơ bộ nhận dạng chất phân lập đư ợ c 30

2.2.3 Thử một số tác dụng sinh học 31

Phán 3: Kết luận và đề xuất 38

3.1 Kết luận 38

3.2 Đề xuất 38

ĐẬT VẤN ĐỂ

Thuốc phòng bệnh và chữa bệnh hầu hết được điều chế từ hai nguồn:dược liệu và hoá dược Không chỉ các nước Á đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu Người ta thống kê thấy rằng ở các nước có nền công nghiệp phát triển thì 1/4 số thuốc thống kê trong các đơn đều có chứa hoạt chất từ thảo mộc Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có thảm thực vật rất phong phú và đa dạng, do đó cũng có nguồn dược liệu rất quý và dồi dào Điều đó càng khẳng định vị thế quan trọng của dược liệu trong ngành y tế Việt Nam Chè dây là dược liệu đã được nghiên cứu về thực vật, xác định tên khoa học, về thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học Chế phẩm AMPELỌP sản xuất từ chè dây chữa viêm loét dạ dày- hành tá tràng đã được Bộ y tế cấp giấy phép lưu hành trên thị trường Qua các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận thấy ngoài thành phần flavonoid thì tanin cũng chiếm một hàm lượng không nhỏ Để góp phần nâng cao giá trị

sử dụng của cây chè dây chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Góp phần nghiên cứu tanin trong chè dây” với các nội dung chính sau:

Về hóa học:

- Định tính tanin trong lá chè dây

- Xây dựng phương pháp chiết xuất tanin trong lá chè dây

- Phân lập một số chất chính

Về tác dụng sinh học:

- Thử tác dụng kháng khuẩn và tác dụng chống oxy hoá của tanin chiết được từ chè dây

PHẦN I TỔNG QUAN1.1 TỔNG QUAN VỂ CÂY CHÈ DÂY (AMPELOPSIS CANTONIENSIS PLANCH.)

1.1.1 Đặc điểm thực vật và sự phân bố

1.1.1.1 Đặc điểm thực vật và sư phân bố của họ Nho.

Theo Vũ Văn Chuyên [7]: các cây trong họ Nho có các đặc điểm chung như: Cây có dạng leo hoặc dạng bụi leo nhờ tua cuốn Tua cuốn có nguồn gốc

từ thân, mọc đối diện với lá Lá mọc so le có lá kèm, có hình dạng khác nhau

Lá đơn nguyên, khía thuỳ hoặc kép chân vịt hoa nhỏ tập trung thành cụm hoa xim, ngù hay chùm Hoa lưỡng tính hay có khi giảm thành hoa đơn tính.Hoa mẫu 4-5 Số nhị bằng số cánh hoa Giữa bộ nhị và bộ nhụy có đĩa mật phát triển thành vòng khuyên hay khía thùy hoặc chỉ là những tuyến riêng rẽ Nhụy gồm hai lá noãn dính lại với nhau thành bầu trên có hai ô, trong mỗi ô có hai noãn, một vòi nhụy Núm nhụy hình đĩa hoặc hình đầu Quả mọng, hạt phôi nhỏ và có nội nhũ Thụ phấn nhờ gió

Trên thế giới họ Nho có tất cả 10 chi với trên 700 loài, được phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, một số ít ở vùng ôn đới Ở Việt Nam có 7 chi với nhiều loài khác nhau

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật và sự phán bô của chi Ampelopsis.

Chi Ampelopsis là một trong những chi điển hình của họ Nho với các đặc điểm chung là: dạng dây leo, lá kép đơn hay có chia thuỳ Hoa nhỏ tập trung thành cụm hoa xim ngù hoặc tán mọc đối diện với lá Quả thường hai ô, hai lá noãn Hạt có hố nhỏ, hẹp và dài [6,7]

ở Việt Nam có 4 loài: A.brevipedunculata(Maxim.) Trautv

A.cantoniensis(Hook et Am.) Planch

A.heterophylla Sieb et Zucc

A.japonica(Thunb.) Makino

Các loài trên có ở nam Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật bản, Indonexia,Lào, Ấn độ Ở Việt Nam có ở các tỉnh miền núi phía bắc, Ninh Bình và Tây Nguyên [6]

1.1.1.3 Đặc điểm thực vật và sự phân bổ của cây chè dây.

Cây dạng dây leo dài, xanh tốt Mọc hoang và được trồng trong các vườn

bờ rào nhà dân Cành có lông nhỏ hình trụ mềm, có tua cuốn mọc đối diện với

lá Lá kép lông chim lẻ có 3 -11 lá chét Các lá chét hình trứng, phiến lá nhẩn, mặt dưới ráp, nhạt, răng cưa đôi khi giảm thành mũi nhọn, lá chét cuối thường

to, dài gấp đôi các lá chét khác Khi sao và ủ đến khô mặt dưới lá có những chấm trắng nhỏ nổi lên Cụm hoa xim hai ngả có cuống dài Hoa nhỏ cuống rất ngắn Nụ hoa hình trứng tròn có những lông nhỏ Đài hình đầu, cánh hoa 5, chỉ nhị hình chỉ, nhụy hình trụ, bầu hai ô có hai noãn Quả mọng màu nâu đen, hơi cay Hoa nở vào tháng 6, quả chín vào tháng 9

Sách “Cây cỏ Việt Nam” ghi: trên thế giới cây có ở Lào, Trung Quốc,Indonexia, Ấn Độ Ở Việt Nam cây có ở: Cao Bằng, Lào Cai, Lạng Sơn, Hải Phòng, Quảng Ninh, Hoà Bình, Hà Tây, Ninh Bình [10]

1.1.2 Thành phần hoá học:

1.1.2.1 Những nghiên cứu vê thành phần hoá học có trong chi Ampelopsis.

Nghiên cứu về chi Ampelopsis trên thế giới chủ yếu tập trung vào loài A.brevipedunculata Trautv Ở Việt Nam, A.cantoniensis Planch, là cây đầu tiên trong chi này được công bố về thành phần hóa học

Căn cứ vào các tài liệu thu thập được, chúng tôi tóm tắt thành phần hoá học một số loài trong chi Ampelopsis ở bảng 1

Bảng 1 Thành phần hoá học có trong một số loài thuộc chi Ampelopsis

Tên cây Bộ

phân

Thành phần hoá học Tài

liệuAmpelopsis

brevipedunculata

var hancei

Rễ ampelopsin D, E, H và cis-ampelopsin E

(-)- epicatechin, pallidol, myabenol c,

acid oleanolic C30H48O3, acid betulinic

[12][17]

A.meliaefolia Lá - myricetin(7,4%)

- dihydromyricetin(l,7%)

[17]

A.japonica tanin và polyphenol [24]

l.ỉ.2.2 Những nghiên cứu về thành phần hoá học của loài A cantoniensis Planch

Nghiên cứu về A.cantoniensis trên thế giới hầu như không có Ở Việt Nam nhóm nghiên cứu của Phạm Thanh Kỳ [12, 16, 17], đã công bố: Lá chè dây mọc ở Cao Bằng và Sa Pa có Havonoid, tanin, đường, caroten và sterol Trong đó flavonoid và tanin có hàm lượng cao

Hai ílavonoid đã phân lập được là myricetin và dihydro myricetin

Bên cạnh tác dụng chống oxy hóa, tác dụng chống ung thư của một số flavonoid cũng đang được quan tâm.

Camoirano A và cộng sự [18] đã nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số flavonoid thấy myricetin có khả năng ức chế sự đột biến gây nên bởi hai tác nhân là 4- nitroquinolin-l-oxyd và khói thuốc lá trên các chủng Salmonella typhimonium TA 100 và TA98 Acid tanic, myricetin ngăn cản sự

khởi đầu ung thư trên biểu bì và phổi chuột gây ra bởi tác nhân hydrocarbon thơm.

Kostas Dimas và cộng sự [19] thử tác dụng gây độc tế bào đối với dòng tế bào gây bệnh ung thư bạch cầu ở người của myricetin và hai dẫn chất của myricetin là 3,7,4\5’-tetrametyl ether myricetin và 3’,5-diacetyl myricetin, dùng vinblastin làm đối chứng Kết quả cho thấy : dẫn chất 3\5- diacetyl myricetin có tác dụng mạnh hơn dẫn chất còn lại và myricetin không

- Myricetin không gây rối loạn nhiễm sắc thể, không ảnh hưởng tới sinh sản và di truyền

- Thử sơ bộ thấy cao khô chè dây, myricetin, dyhidromyricetin có hoạt tính chống oxy hoá cao

Cao khô chè dây và myricetin có khả năng thải độc theo cơ chế trung hoà gốc tự do của tetraclorua carbon

+ Phùng Gia Hợp đã dùng cao đặc chè dây điều trị vết bỏng nông [16]: bỏng

độ II và bỏng độ III ở 32 bệnh nhân thấy vết bỏng tạo được màng thuốc bám chắc vào bề mặt vết thương Khi màng thuốc bong thì vết bỏng lành sẹo, bề mặt mềm và mịn.Thời gian khỏi trung bình của bỏng độ II là 9,2 ngày, bỏng

độ III là 18,5 ngày Cao chè dây không dùng được cho bỏng sâu, bỏng nông

đã nhiễm khuẩn, bỏng đầu mặt, cổ, bàn tay, ngón tay, chân và vùng khớp.Việc

sử dụng cao chè dây bôi lên tổn thương không gây độc hại tại chỗ cũng như toàn thân đối với bệnh nhân

1.1.4 Công dụng:

• Theo kinh nghiệm dân gian:

-Loài A.japonica: người dân Việt Nam dùng rễ gọi là Bạch liễm(vị đắng ngọt, hơi lạnh) có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu ung tán kết để chữa trĩ

rò, tràng nhạc, mụn nhọt sưng lở, bỏng lửa, nước [6]

-Loài A.heterophylla (Dâu dây): người dân Việt Nam dùng toàn cây (vị ngọt, tính mát) có tác dụng thanh nhiệt, tiêu sưng để chữa phong thấp, đau nhức xương và đắp mụn nhọt [6]

-Loài A cantoniensis (Chè dây) được dùng lá chủ yếu có vị ngọt, tính mát

+ Có nơi nhân dân dùng lá tươi giã đắp vào các vết bỏng

+ Người dân Sa Pa dùng nước sắc uống hoặc nước hãm dạng chè uống hàng ngày với tác dụng thanh nhiệt, chữa mất ngủ, kích thích tiêu hoá, đặc biệt chữa đau dạ dầy, viêm đại tràng, viêm đường ruột rất tốt

• Theo những kết quả nghiên cứu về tác dụng điều trị loét dạ dày- hành tá tràng của chè dây, chế phẩm AMPELOP sản xuất từ chè dây (A cantoniensis Planch.) đã ra đời

- Những nghiên cứu trên lâm sàng của chế phẩm AMPELOP có một số kết luận sau [13, 14]:

+ AMPELOP có tác dụng cắt cơn đau trung bình 8,9 ngày, sau 2 tuần có 90,09 % bệnh nhân hết đau.

+ AMPELOP làm liền sẹo ổ loét tá tràng 79,55%

+ AMPELOP làm sạch HP 53,9 %

+ AMPELOP có tác dụng làm giảm viêm dạ dày

+ AMPELOP không độc và không có tác dụng không mong muốn

- Để nâng cao tác dụng điều trị của thuốc AMPELOP, các nhà lâm sàng

dã nghiên cứu các phác đồ điều trị như: Dùng AMPELOP trong một tháng kết hợp với AMOXICILLIN và METRONIDAZOL dùng trong một tuần đạt kết quả rất tốt

1.2 TỔNG QUAN VỀ TANIN

1.2.1 Khái niệm về tanin

Theo tài liệu [1]: Tanin là những hợp chất polyphenol có trong thực vật có vị chát, có tính chất thuộc da, được phát hiện dương tính với “thí nghiệm thuộc da” và được định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn

Định nghĩa này không bao gồm những chất phenol đơn giản hay gặp cùng với tanin như acid gallic, các chất catechin, acid chlorogenic mặc dù những chất này ở những điều kiện nhất định có thể kết tủa với gelatin và một phần nào bị giữ trên bột da sống Chúng được gọi là Pseudotanin

1.2.2 Cấu trúc hoá học của tanin [1, 20, 21]

Tanin có cấu trúc phức tạp, dựa vào cấu trúc hoá học người ta chia tanin làm hai loại chính: tanin thuỷ phân (tanin pyrogallic) và tanin không thuỷ phân được (tanin pyrocatechic)

1.2.2.1 Tanỉn thuỷ phân được (Hydrolyzable)

Khi thuỷ phân bằng acid hoặc bằng enzym tanase thì giải phóng ra phần đường thường là glucose, đôi khi cũng gặp những loại đường đặc biệt Phần

không phải là đường là các acid Acid hay gặp là acid gallic Các acid gallic nối với nhau theo dây nối pepsid để tạo thành acid digallic, trigallic.

O H

C O O H

A cid digallic

Ngoài acid gallic, còn có các acid khác như acid ellagic, acid luteolic

Phần đường và phần không đường nối với nhau theo dây nối ester nên người

ta coi tanin loại này là những Pseudoglycosid

1.2.2.2 Tanin ngưng tụ (Condensed tannin)

Tanin ngưng tụ được hình thành từ các đơn phân tử cơ bản là catechin và epicatechin đó là hai chất đồng phân của nhau Phân tử cơ bản thuộc loại

tlavan có carbon sô 4 là nhóm methylen (-CH,-) dễ ngưng tụ thành các polyme.

OH.OH

OHOH

Sự ngưng tụ thường xảy ra ở dây nối carbon-carbon, ví dụ giữa C8 của catechin và C4 của epicatechin tạo thành một dimer như sau:

epicatechin-(4ị3-8)-catechin

K Freudenberg đã đưa ra giả thuyết nhất nguyên [9], ông đã thực nghiệm tổng hợp các catechin từ procyanidol với sụ có mặt của men phenolaza thảo mộc và đã tổng hợp được dicatechin.

Masquelier đã dựa vào trọng lượng phân tử của tanin catechic phân thành 4 loại [9]:

m QH

Procyanidol

-Monome chỉ gồm đơn phân tử flavan có trọng lượng phân tử 300, không có hoạt tính thuộc da.

-Oligome có từ 2 đến 5 phân tử cơ bản ngưng tụ có trọng lượng phân tử

từ 500 đến 1500 Loại này có hoạt tính thuộc da

-Loại tanịn thực sự có từ 6 đến 10 phân tử ngưng tụ có trọng lượngphân tử từ 1500 đến 3000, có hoạt tính thuộc da mạnh nhất

-Loại polyme có từ 11 phân tử ngưng tụ trở lên gọi là flobaphen hoặc

đỏ tanin, loại này có thuộc tính thuộc da kém hơn

Tanin kết tủa với muối kim loại nặng và với alcaloid nên dùng chữa ngộ độc đường tiêu hoá

Tanin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm máu, trĩ, rò hậu môn

Có thể dùng tanin tinh chế pha trong dung dịch nước 1-2% hoặc thuốc bột, thuốc mỡ 10-20% Khi dùng trong (uống) nên dùng chế phẩm tanalbumin hay tanalbin Đây là dạng kết hợp tanin và albumin, điều chế bằng hoà tan 10 gam albumin vào 90 gam nước, thêm vừa đủ dung dịch tanin 6% để kết tủa hết albumin, đun nhẹ 50° c để làm vón, lọc và rửa với một ít nước, sấy khô 40-

50°c rồi tán nhỏ.Tanalbin có màu vàng nhạt, không mùi, không vị, chứa 50%

tanin, không hoà tan trong nước và trong cồn, không bị dịch phân huỷ Khi vào đến ruột gặp môi trường kiềm tanin mới giải phóng, tránh được tanin tác dụng trên niêm mạc miệng - thực quản- dạ dày gây khó chịu và rối loạn tiêu hóa Người lớn uống 2- lOg chia làm liều nhỏ lg.

Có thể chế dạng tanat gelatin dùng như tanalbin Tanaform (=tanin + formol) dùng bôi ngoài

PHẦN 2 THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỤC NGHIỆM.

2.1.1 Nguyên liệu.

Lá chè dây thu hái ở Cao Bằng tháng 10 năm 2003, tên khoa học của mẫu

nghiên cứu đã được GS Vũ Văn Chuyên xác định là Ampelopsis cantoniensis Planch Vitaceae

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu.

- Escherichia coli ATCC 25922 viết tắt là E c

- Proteus mirabilis BV108 viết tắt là Pro

- Pseudomonas aeruginosa VM 201 viết tắt là Pseu

- Shigella flexneri DT 112 viết tắt là Shi

- Salmonella typhi DT 220 viết tắt là Sal

- Bacillus cereus ATCC 9946 viết tắt là B.c

- Bacillus pumilus ATCC 10241 viết tắt là B.p

- Bacillus subtilis ATCC 10241 viết tắt là B.s

- Sarcina lutea ATCC 9341 viết tắt là S.L

- Staphyloccocus aureus ATCC 122 viết tắt là Sta

* Môi trường nuôi cấy:

- Môi trường thạch thường: pepton 5,0g; cao thịt 3,0g; NaCl 5,0g; thạch 18g; nước cất vừa đủ 1000 ml; pH: 6,8 - 7,2 tiệt trùng ở 118°c, thời gian

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu.

2.1.3.1 Nghiên cứu về hóa học:

- Định tính các nhóm chất hữu cơ theo phương pháp ghi trong “Bài giảng Dược liệu”[l], và “Thực tập Dược liệu”[2]

- Định tính bằng SKLM theo phương pháp ghi trong “Thực tập Dược liệu”[2]

và “Bài giảng Dược liệu”[l]

- Sắc ký cột dùng silicagen (Merck) cỡ hạt 0,04 - 0,063mm và Sephadex LH20

- Phổ tử ngoại (UV) đo trên máy UV-VIS Spectrophotometer carry 1E- varian(Australia) tại phòng thí nghiệm trung tâm- Trường Đại học Dược Hà Nội

- Phổ hồng ngoại (IR) đo trên máy 1650-Perkin Elmer (USA) tại phòng thí nghiệm trung tâm- Trường Đại học Dược Hà Nội

- Phổ khối (MS) đo trên máy 5989 -B- MS tại Viện hoá học, Trung tâm KHTN và công nghệ quốc gia

2.1.3.2 Nghiên cứu vê tác dụng sinh học:

2.1.3.2.1 Thử tác dụng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán [3]:

* Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định Hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của các vi sinh vật tạo thành vòng vô khuẩn, đo đường kính vòng vô khuẩn Hoạt lực kháng khuẩn của mẫu thử tỷ lệ với đường kính vòng vô khuẩn Tác dụng kháng khuẩn thử tại Bộ môn Vi sinh trường Đại học Dược Hà Nội

2.1.3.2.2 Thử tác dụng chống oxy hoá của tanin:

Thử tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào não và gan chuột của tanin toànphần chiết từ lá chè dây (invitro) tại phòng Đông Y thực nghiệm Viện YHCT.Đánh giá tác dụng chống peroxy hoá lipid màng tế bào được thực hiện qua việc xác định hàm lượng MDA, một sản phẩm trung gian của quá trình này dựa theo phương pháp đã được miêu tả bởi Jadwiga Robax (Ba Lan, 1987) và Mitsno Tanaka (Nhật Bản, 1994) với một số thay đổi nhỏ [23]

Nguyên lý của phương pháp là MDA, một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxy hoá lipid, có thể phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức Trimethin có màu hồng và có đỉnh hấp thụ cực đại ở 530 - 532 nm

Malonyl dialdehyd Thiobarbituric acid Phức hợp Trimethin

Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ MDA Hàm lượng MDA là

số nmol MDA trong lg tổ chức (não và gan chuột) và được tính theo đường cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết nồng độ từ 2,00 nmol đến 15,2 nmol

2.1.3.2 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu trong thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê ứng dụng trong Y Dược [11] Xác định giá trị trung bình , độ lệch chuẩn

2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

2.2.1 Định tính tanin trong lá chè dây bằng các phản ứng hóa học

Chuẩn bị dung dịch thử: Cho 2g dược liệu vào bình nón 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi cách thuỷ 30 phút, lọc lấy dịch lọc để làm các phản ứng

- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch lọc, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, dung dịch chuyển sang mầu xanh đen (Phản ứng dương tính)

- Phản ứng với dung dịch gelatin 2%: Lấy 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm từ từ 1 ml dung dịch gelatin 2%, thêm 0,5 ml NaCl 10%, thấy xuất hiện tủa bông trắng ( Phản ứng dương tính)

- Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch lọc, thêm 2-3 giọt chì acetat 10% vào thấy xuất hiện tủa bông trắng (Phản ứng dương tính)

- Phản ứng phân biệt tanin pyrogallic và tanin pyrocatechic:

+ Phản ứng với nước Brom bão hòa: Lấy 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm , thêm từ từ 2-3 giọt nước Brom, lắc đều, xuất hiện tủa (Phản ứng dương tính với tanin pyrocatechic)

/_\ I n

Giá trị trung bình : (p) = X

A-Đô lêch chuẩn SD

+ Phản ứng Stiasny: Lấy 2ml dịch lọc thêm 5 ml dung dịch formol và 5

ml dung dịch acid clohydric đặc, đun sôi cách thuỷ 3 phút, thâý xuất hiện kết tủa (Phản ứng dương tính với tanin pyrocatechic)

Kết quả định tính tanin được tóm tắt ở bảng 2

Bảng 2 Kết quả định tính tanin trong lá chè dây

Phản ứng Kết quả Kết luận

Với FeCl3 5% + + + Có tanin

Với gelatin 2% + + + Có tanin

Với Pb(CH3COO)2 + + + Có tanin

Với nước Br2 bão hoà + + + Có tanin pyrocatechin

Phản ứng Stiasny + + + Có tanin pyrocatechin

2.2.2 Chiết xuất tanin

2.2.2.1 Xây dựng phương pháp chiết xuất tanin trong lá chè dây

Tanin catechic không bền vững, đặc biệt nhanh nhậy với tác động của ion H+ và Oxy nên các phương pháp chiết xuất và phân lập gặp nhiều khó khăn, ở đây chúng tôi tiến hành chiết xuất tanin theo hai phương pháp:

+ Phương pháp 1: Tanin trong dược liệu được chiết xuất bằng cồn 50%

Cho lOOg dược liệu vào bình cầu 1000 ml, chiết hồi lưu bằng cồn 50% liên tục trong 8 giờ Lấy dịch chiết ra để lắng, gạn dịch trong, đem dịch trong cô cách

Tủa tanin bằng dung dịch amoni sulfat 15%, lọc lấy tủa Hoà tan tủa bằng aceton : nước [6:1], thu hồi dung môi, rửa bằng ether, thu được tanin toàn phần Làm như vậy 3 lần.

Quy trình chiết xuất theo phương pháp 1 được tóm tắt ở sơ đồ 1 và hàm lượng tanin chiết được từ lá chè dây được trình bày ở bảng 3

Bảng 3 Hàm lượng tanin chiết được từ lá chè dây.

Hoà tan 0,1 g cắn T trong 10 ml nước nóng làm dung dịch thử

Kết quả định tính được ghi ở bảng 4

Bảng 4 Kết quả định tính tanin trong cắn TPhản ứng Kết quả Kết luận

Với FeCl3 5% +++ Có tanin

Với gelatin 2% +++ Có tanin

Với Pb(CH3COO)2 +++ Có tanin

Với nước Br2 bão hoà +++ Có tanin pyrocatechic

Phản ứng Stiasny +++ Có tanin pyrocatechic

Chú thích: +++: Phản ứng rất rõ

- Định tính cắn T bằng SKLM:

Hoà tan 0,1 g cắn T trong 5 ml MeOH Tiến hành SKLM trên bản Silicagen

GF 2 5 4 (Merck) tráng sẩn đã hoạt hoá, khai triển với các hệ dung môi:

Hệ I: Toluen : Ethylacetat: Acid formic [ 5 : 6 : 1]

Hệ II: Ethylacetat: n Butanol: Acid formic [ 5 : 3 : 1 ]

Hệ 3: Cloroform : Acid acetic : Nước [10 : 9 : 1]

Hệ 4: n Butanol: Acid acetic : Nước [ 4 : 1 : 2 ]Thuốc thử hiện màu là FeCl3 / MeOH (1:1)

Kết quả SKLM cho thấy các hệ dung môi trên đều không tách tốt Do đó chúng tồi tiếp tục khảo sát cắn T bằng SKLM hai chiều với hệ dung môi (1) và (2) Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ (hình 1)

-►

Chiều 2Hình 1: sắc ký đồ SKLM hai chiều tủa T

Nhận xét:

- Tanin toàn phần thu được có 8 vết chất xuất hiện trên sắc ký đồ của SKLM 2 chiều

Chiều 1: Toluen : Ethylacetat: Acid formic [ 5 : 6 : 1 ]

Chiều 2: Ethylacetat: n Buthanol: acid formic [ 5 : 3 : 1]

- Hàm lượng tanin thu được bằng phương pháp chiết 1 tương đối thấp (3,77 %)

+ Phương pháp 2: Chiết xuất tanin theo phương pháp của Masquelier [9]Lấy khoảng lOOg bột dược liệu , loại tạp bằng ether dầu hoả, lấy bột dược liệu ra cho bay hơi hết dung môi rồi chiết bằng hỗn hợp dung môi aceton : nước (tỉ lệ 2 :1) Sau khi loại aceton bằng áp lực giảm thu được dạng cao lỏng

Từ lượng cao chiết được ở trên , để lắng , gạn lấy dịch trong , cho muối Natri Clorid vào đến khi đạt nồng độ bão hoà (30%) các tanin ngưng tụ và tanin thực sự (tanin trọng lượng phân tử từ 1500 trở lên) sẽ kết tủa

Lọc lấy tủa, hoà tan tủa trong 50 ml aceton, lọc thu hồi dung môi được bột vô định hình màu nâu thẫm , ký hiệu Tj

Lấy dịch lọc đã tách riêng phần Tj cho vào bình gạn, thêm 20 ml ethylacetat vào lắc trong 10 phút, để yên gạn lấy phần ethylacetat, chiết lại hai lần nữa Gộp cả 3 dịch chiết ethylacetat lại , thu hồi dung môi còn lại 30 ml ethylacetat, thêm 60 ml Cloroform tạo thành tủa màu vàng nâu nhạt , lọc lấy tủa Trong quá trình lọc tủa trở nên sẫm màu hơn do bị oxy hóa Tủa này được

ký hiệu là T2

Quy trình chiết tanin theo phương pháp 2 được tóm tắt ở sơ đồ 2 và hàm lượng tanin chiết được từ lá chè dây theo phương pháp này được trình bày ở bảng 5

Sơ đồ 2 Sơ đồ chiết xuất tanin theo phương pháp 2

Bảng 5 Hàm lượng tanin chiết được theo phương pháp 2

Số lần chiết Khối lượng

Khối lượng tannin (Tj + T2) trung bình 3 lần chiết đạt 7,69 %.

So sánh với phương pháp chiết 1, chiết theo phương pháp 2 thu được lượng tanin cao hơn

-Đặc điểm của tanin Tp

Tj là chất bột màu nâu, vị chát, tan trong nước, cồn, aceton, methanol, không tan trong các dung môi hữu cơ khác

+Hoạt tính thuộc da: Lấy 0,01 gam bột chất Ti hoà trong 2ml nước, nhỏ 2

- 3 giọt dung dịch gelatin 2% tạo tủa bông

+ Phản ứng Stiasny: Lấy 0,1 gam chất Tj hoà tan trong 10 ml nước , thêm 5

ml formol và 5 ml acid clohydric đặc, đun sôi 3 phút , chất Tj chuyển hoàn toàn thành tủa đỏ cam

Nhận x é t: Qua các đặc điểm trên cho thấy chất T\ phù hợp với tanin catechic + Định tính TI bằng sắc kỷ lớp mỏng:

Lấy 0,1 gam bột chất T\ hoà tan trong 5 ml methanol làm dung dịch chấm sắc ký

Tiến hành chấm trên bản mỏng silicagel tráng sẵn của Merck 60 GF254

Các hệ dung môi khai triển:

Hệ I : Chloroform : Ethylacetat: Acid formic [1 : 7 : 1]

Hệ II : Toluen : Chloroform : Aceton [ 8 : 5 : 7 ]

Hệ I I I : Toluen : Chloroform : Acid formic [ 5 : 6 : 1]

Hệ IV : n butanol : Acid acetic : Nước [ 4 : 1 : 2 ]

Hệ V : Chloroform : methanol : Nước [ 5 : 4 : 1]

Phát hiện vết tanin bằng cách soi dưới đèn tử ngoại (Ằ, =254 nm) hoặc phun hiện màu bằng T.T sắt III Clorid 5% + methanol (1:1)

Kết qua: Hệ dung môi I cho kết qủa tốt nhất trong số các hệ dung môi đã khảo

sát, kết quả được trình bày ở bảng 6 và sắc ký đồ 2 (Hình 2)

Hình 2: Ảnh sắc ký đồ SKLM của cắn T\