Góp phần nghiên cứu tanin trong chè dây (ampelopsis cantoniensis planch vitaceae)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI PHẠM THUỲ DƯƠNG GÓP PHẦN NGHIÊN cứu TANIN TRONG CHÈ DÂY Ampelopsis cantoniensis Planch. Vitaceae (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999 - 2004) - Người hướng dẫn - Nơi thực hiện -Thời gian thực hiện GS.TS. PHẠM THANH KỲ BỘ MÔN DƯỢC LIỆU Hà Nội, tháng 5 - 2004 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn : GS.TS. Phạm Thanh Kỳ Người thầy đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn em trong suốt quá trình làm khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn : TS. Cao Văn Thu - Bộ môn Vi sinh TS. Nguyễn Thái An - Bộ môn Dược cổ truyền TS. Trần Vân Hiền - Phòng Đông Y thực nghiệm TS. Đỗ Ngọc Thanh - Phòng thí nghệm trung tâm Cùng tất cả các thầy cô giáo, các cô kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Vi sinh và các phòng ban đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận này. Nhân dịp này em xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè và người thân đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ em trong quá trình học tập cũng như làm khoá luận. Hà N ội, tháng 5 năm 2004 Sinh viên Phạm Thuỳ Dương MỤC LỤC Trang Đặt vấn đ ê 1 Phần 1: Tổng quan 2 1.1. Tổng quan về cây chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.) 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật và sự phân bố 2 1.1.2. Thành phần hoá học 3 1.1.3. Tác dụng sinh học 5 1.1.4. Công dụng 7 1.2. Tổng quan về tanin 8 1.2.1. Khái niệm về tanin 8 1.2.2. Cấu trúc hoá học của tanin 8 1.2.3. Tác dụng và công dụng 12 Phần 2: Thực nghiệm và kết quả 14 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 14 2.1.1. Nguyên liệu 14 2.1.2. Phương tiện nghiên cứu 14 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu . 15 2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 17 2.2.1. Định tính tanin trong lá chè dây bằng các phản ứng hóa học . 17 2.2.2. Chiết xuất ta n in 18 2.2.3. Phân lập tanin 28 2.2.4. Sơ bộ nhận dạng chất phân lập được 30 2.2.3. Thử một số tác dụng sinh học 31 Phán 3: Kết luận và đề xuất 38 3.1. Kết luận 38 3.2. Đề xuất 38 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A.s Ánh sáng DL Dược liệu IR Infra red spectrometry MeOH Methanol MS Mass spectrometry NXB Nhà xuất bản SKLM Sắc ký lớp mỏng T.T Thuốc thử uv Ultra violet spectrometry ĐẬT VẤN ĐỂ Thuốc phòng bệnh và chữa bệnh hầu hết được điều chế từ hai nguồn: dược liệu và hoá dược. Không chỉ các nước Á đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Người ta thống kê thấy rằng ở các nước có nền công nghiệp phát triển thì 1/4 số thuốc thống kê trong các đơn đều có chứa hoạt chất từ thảo mộc. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có thảm thực vật rất phong phú và đa dạng, do đó cũng có nguồn dược liệu rất quý và dồi dào. Điều đó càng khẳng định vị thế quan trọng của dược liệu trong ngành y tế Việt Nam. Chè dây là dược liệu đã được nghiên cứu về thực vật, xác định tên khoa học, về thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học. Chế phẩm AMPELỌP sản xuất từ chè dây chữa viêm loét dạ dày- hành tá tràng đã được Bộ y tế cấp giấy phép lưu hành trên thị trường. Qua các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận thấy ngoài thành phần flavonoid thì tanin cũng chiếm một hàm lượng không nhỏ. Để góp phần nâng cao giá trị sử dụng của cây chè dây chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Góp phần nghiên cứu tanin trong chè dây” với các nội dung chính sau: Về hóa học: - Định tính tanin trong lá chè dây. - Xây dựng phương pháp chiết xuất tanin trong lá chè dây. - Phân lập một số chất chính. Về tác dụng sinh học: - Thử tác dụng kháng khuẩn và tác dụng chống oxy hoá của tanin chiết được từ chè dây. 1 PHẦN I TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỂ CÂY CHÈ DÂY (AMPELOPSIS CANTONIENSIS PLANCH.) 1.1.1. Đặc điểm thực vật và sự phân bố 1.1.1.1. Đặc điểm thực vật và sư phân bố của họ Nho. Theo Vũ Văn Chuyên [7]: các cây trong họ Nho có các đặc điểm chung như: Cây có dạng leo hoặc dạng bụi leo nhờ tua cuốn. Tua cuốn có nguồn gốc từ thân, mọc đối diện với lá. Lá mọc so le có lá kèm, có hình dạng khác nhau. Lá đơn nguyên, khía thuỳ hoặc kép chân vịt. hoa nhỏ tập trung thành cụm hoa xim, ngù hay chùm. Hoa lưỡng tính hay có khi giảm thành hoa đơn tính.Hoa mẫu 4-5. Số nhị bằng số cánh hoa. Giữa bộ nhị và bộ nhụy có đĩa mật phát triển thành vòng khuyên hay khía thùy hoặc chỉ là những tuyến riêng rẽ. Nhụy gồm hai lá noãn dính lại với nhau thành bầu trên có hai ô, trong mỗi ô có hai noãn, một vòi nhụy. Núm nhụy hình đĩa hoặc hình đầu. Quả mọng, hạt phôi nhỏ và có nội nhũ. Thụ phấn nhờ gió. Trên thế giới họ Nho có tất cả 10 chi với trên 700 loài, được phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, một số ít ở vùng ôn đới. Ở Việt Nam có 7 chi với nhiều loài khác nhau. 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật và sự phán bô của chi Ampelopsis. Chi Ampelopsis là một trong những chi điển hình của họ Nho với các đặc điểm chung là: dạng dây leo, lá kép đơn hay có chia thuỳ. Hoa nhỏ tập trung thành cụm hoa xim ngù hoặc tán mọc đối diện với lá. Quả thường hai ô, hai lá noãn. Hạt có hố nhỏ, hẹp và dài [6,7]. ở Việt Nam có 4 loài: A.brevipedunculata(Maxim.) Trautv. A.cantoniensis(Hook. et Am.) Planch. 2 A.heterophylla Sieb. et Zucc. A.japonica(Thunb.) Makino. Các loài trên có ở nam Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật bản, Indonexia, Lào, Ấn độ. Ở Việt Nam có ở các tỉnh miền núi phía bắc, Ninh Bình và Tây Nguyên [6]. 1.1.1.3. Đặc điểm thực vật và sự phân bổ của cây chè dây. Cây dạng dây leo dài, xanh tốt. Mọc hoang và được trồng trong các vườn bờ rào nhà dân. Cành có lông nhỏ hình trụ mềm, có tua cuốn mọc đối diện với lá. Lá kép lông chim lẻ có 3 -11 lá chét. Các lá chét hình trứng, phiến lá nhẩn, mặt dưới ráp, nhạt, răng cưa đôi khi giảm thành mũi nhọn, lá chét cuối thường to, dài gấp đôi các lá chét khác. Khi sao và ủ đến khô mặt dưới lá có những chấm trắng nhỏ nổi lên. Cụm hoa xim hai ngả có cuống dài. Hoa nhỏ cuống rất ngắn. Nụ hoa hình trứng tròn có những lông nhỏ. Đài hình đầu, cánh hoa 5, chỉ nhị hình chỉ, nhụy hình trụ, bầu hai ô có hai noãn. Quả mọng màu nâu đen, hơi cay. Hoa nở vào tháng 6, quả chín vào tháng 9. Sách “Cây cỏ Việt Nam” ghi: trên thế giới cây có ở Lào, Trung Quốc, Indonexia, Ấn Độ. Ở Việt Nam cây có ở: Cao Bằng, Lào Cai, Lạng Sơn, Hải Phòng, Quảng Ninh, Hoà Bình, Hà Tây, Ninh Bình [10] 1.1.2. Thành phần hoá học: 1.1.2.1. Những nghiên cứu vê thành phần hoá học có trong chi Ampelopsis. Nghiên cứu về chi Ampelopsis trên thế giới chủ yếu tập trung vào loài A.brevipedunculata Trautv Ở Việt Nam, A.cantoniensis Planch, là cây đầu tiên trong chi này được công bố về thành phần hóa học. Căn cứ vào các tài liệu thu thập được, chúng tôi tóm tắt thành phần hoá học một số loài trong chi Ampelopsis ở bảng 1 3 Bảng 1. Thành phần hoá học có trong một số loài thuộc chi Ampelopsis Tên cây Bộ phân Thành phần hoá học Tài liệu Ampelopsis brevipedunculata var. hancei Rễ ampelopsin D, E, H và cis-ampelopsin E (-)- epicatechin, pallidol, myabenol c, acid oleanolic C30H48O3, acid betulinic ^30^48^3 [25] Lá ampelopsin A, ampelopsin B, ampelopsin c Ampelopsis cantoniensis Lá -flavonoid: trong đó nhiều nhất là myricetin và dihydromyricetin - tanin - flavon(4,73%), protein(9,25%), nguyên tố vi lượng:K,Ca,Fe, Zn, và các vitamin E,B1, B2 [12] [17] A.meliaefolia Lá - myricetin(7,4%) - dihydromyricetin(l,7%) [17] A.japonica tanin và polyphenol [24] l.ỉ.2.2. Những nghiên cứu về thành phần hoá học của loài A. cantoniensis Planch Nghiên cứu về A.cantoniensis trên thế giới hầu như không có. Ở Việt Nam nhóm nghiên cứu của Phạm Thanh Kỳ [12, 16, 17], đã công bố: Lá chè dây mọc ở Cao Bằng và Sa Pa có Havonoid, tanin, đường, caroten và sterol. Trong đó flavonoid và tanin có hàm lượng cao. Hai ílavonoid đã phân lập được là myricetin và dihydro myricetin 4 ỔH Ồ Myricetin Dihydro Myricetin 1.1.3. Tác dụng sinh học 1.1.3.1.Những nghiên cứu về tác dụng sinh học của một số flavonoid trong loài Ampelopsis Cũng như một số flavonoid khác, myricetin trong một số loài Ampelopsis có hoạt tính vitamin p [16]. Nghiên cứu ảnh hưởng của myricetin trên hệ thống tạo gốc tự do và peroxy hóa trong microsom tế bào gan chuột, Laughton M.J và cộng sự [16] nhận thấy những cây có nhiều flavonoid không những có tác dụng chống oxy hoá mà còn làm giảm các chất tiền oxy hóa. Bên cạnh tác dụng chống oxy hóa, tác dụng chống ung thư của một số flavonoid cũng đang được quan tâm. Camoirano A. và cộng sự [18] đã nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số flavonoid thấy myricetin có khả năng ức chế sự đột biến gây nên bởi hai tác nhân là 4- nitroquinolin-l-oxyd và khói thuốc lá trên các chủng Salmonella typhimonium TA 100 và TA98. Acid tanic, myricetin ngăn cản sự 5 khởi đầu ung thư trên biểu bì và phổi chuột gây ra bởi tác nhân hydrocarbon thơm. Kostas Dimas và cộng sự [19] thử tác dụng gây độc tế bào đối với dòng tế bào gây bệnh ung thư bạch cầu ở người của myricetin và hai dẫn chất của myricetin là 3,7,4\5’-tetrametyl ether myricetin và 3’,5-diacetyl myricetin, dùng vinblastin làm đối chứng. Kết quả cho thấy : dẫn chất 3\5- diacetyl myricetin có tác dụng mạnh hơn dẫn chất còn lại và myricetin không có tác dụng này. 1.1.3.2. Những nghiên cứu vê tác dụng sinh học của cây chè dây (A.cantoniensis Planch.): + Theo kết quả nghiên cứu của nhóm Phạm Thanh Kỳ[12, 16, 17] có thể tóm tắt như sau: - Cao khô chè dây và các flavonoid khác không gây ngộ độc cấp tính trong chuột thí nghiệm. - Cao chè dây không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu hoá sinh và huyết học bao gồm: số lượng hồng cầu, bạch cầu, công thức bạch cầu, điện di protein huyết thanh, ure máu, khi cho thỏ dùng thuốc trong thời gian dài 5 tuần. - Myricetin không gây rối loạn nhiễm sắc thể, không ảnh hưởng tới sinh sản và di truyền. - Thử sơ bộ thấy cao khô chè dây, myricetin, dyhidromyricetin có hoạt tính chống oxy hoá cao. Cao khô chè dây và myricetin có khả năng thải độc theo cơ chế trung hoà gốc tự do của tetraclorua carbon. + Phùng Gia Hợp đã dùng cao đặc chè dây điều trị vết bỏng nông [16]: bỏng độ II và bỏng độ III ở 32 bệnh nhân thấy vết bỏng tạo được màng thuốc bám chắc vào bề mặt vết thương. Khi màng thuốc bong thì vết bỏng lành sẹo, bề mặt mềm và mịn.Thời gian khỏi trung bình của bỏng độ II là 9,2 ngày, bỏng độ III là 18,5 ngày. Cao chè dây không dùng được cho bỏng sâu, bỏng nông 6 [...]... quả định tính tanin được tóm tắt ở bảng 2 Bảng 2 Kết quả định tính tanin trong lá chè dây Phản ứng Kết quả Kết luận Với FeCl3 5% +++ Có tanin Với gelatin 2% +++ Có tanin Với Pb(CH3COO)2 +++ Có tanin Với nước Br2bão hoà +++ Có tanin pyrocatechin Phản ứng Stiasny +++ Có tanin pyrocatechin Chú thích: +++: phản ứng rất rõ Nhận xét: Trong lá chè dây có tanin pyrocatechic (tanin ngưng tụ) Trong các khoá... dây có tanin pyrocatechic (tanin ngưng tụ) Trong các khoá luận trước mới chỉ nghiên cứu tanin ở mức độ phản ứng định tính và định lượng , để tiếp tục các công trình nghiên cứu trước , chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp chiết xuất tanin 2.2.2 Chiết xuất tanin 2.2.2.1 Xây dựng phương pháp chiết xuất tanin trong lá chè dây Tanin catechic không bền vững, đặc biệt nhanh nhậy với tác động của ion H+... chữa mất ngủ, kích thích tiêu hoá, đặc biệt chữa đau dạ dầy, viêm đại tràng, viêm đường ruột rất tốt • Theo những kết quả nghiên cứu về tác dụng điều trị loét dạ dày- hành tá tràng của chè dây, chế phẩm AMPELOP sản xuất từ chè dây (A cantoniensis Planch. ) đã ra đời - Những nghiên cứu trên lâm sàng của chế phẩm AMPELOP có một số kết luận sau [13, 14]: 7 + AMPELOP có tác dụng cắt cơn đau trung bình 8,9... cùng với tanin như acid gallic, các chất catechin, acid chlorogenic mặc dù những chất này ở những điều kiện nhất định có thể kết tủa với gelatin và một phần nào bị giữ trên bột da sống Chúng được gọi là Pseudotanin 1.2.2 Cấu trúc hoá học của tanin [1, 20, 21] Tanin có cấu trúc phức tạp, dựa vào cấu trúc hoá học người ta chia tanin làm hai loại chính: tanin thuỷ phân (tanin pyrogallic) và tanin không... muốn - Để nâng cao tác dụng điều trị của thuốc AMPELOP, các nhà lâm sàng dã nghiên cứu các phác đồ điều trị như: Dùng AMPELOP trong một tháng kết hợp với AMOXICILLIN và METRONIDAZOL dùng trong một tuần đạt kết quả rất tốt 1.2 TỔNG QUAN VỀ TANIN 1.2.1 Khái niệm về tanin Theo tài liệu [1]: Tanin là những hợp chất polyphenol có trong thực vật có vị chát, có tính chất thuộc da, được phát hiện dương tính... Hàm lượng tanin chiết được từ lá chè dây Số lần Khối lượng chiết Tỷ lệ tanin( g) Khối lượng DL(g) (%) 1 100 3,51 3,51 2 100,13 4,12 4,11 3 100,05 3,70 3,69 3,77 % Trung bình - Để kiểm tra cắn T có phải là tanin hay không chúng tôi tiến hành các phản ứng định tính sau: Hoà tan 0,1 g cắn T trong 10 ml nước nóng làm dung dịch thử Kết quả định tính được ghi ở bảng 4 Bảng 4 Kết quả định tính tanin trong cắn... lấy dịch trong , cho muối Natri Clorid vào đến khi đạt nồng độ bão hoà (30%) các tanin ngưng tụ và tanin thực sự (tanin trọng lượng phân tử từ 1500 trở lên) sẽ kết tủa Lọc lấy tủa, hoà tan tủa trong 50 ml aceton, lọc thu hồi dung môi được bột vô định hình màu nâu thẫm , ký hiệu Tj Lấy dịch lọc đã tách riêng phần Tj cho vào bình gạn, thêm 20 ml ethylacetat vào lắc trong 10 phút, để yên gạn lấy phần ethylacetat,... lập gặp nhiều khó khăn, ở đây chúng tôi tiến hành chiết xuất tanin theo hai phương pháp: + Phương pháp 1: Tanin trong dược liệu được chiết xuất bằng cồn 50% Cho lOOg dược liệu vào bình cầu 1000 ml, chiết hồi lưu bằng cồn 50% liên tục trong 8 giờ Lấy dịch chiết ra để lắng, gạn dịch trong, đem dịch trong cô cách thuỷ còn 1/10 thể tích 18 Tủa tanin bằng dung dịch amoni sulfat 15%, lọc lấy tủa Hoà tan... bị viêm loét, hoặc ổ loét do nằm lâu Tanin có thể dùng trong chữa viêm ruột, chữa tiêu chảy Tanin kết tủa với muối kim loại nặng và với alcaloid nên dùng chữa ngộ độc đường tiêu hoá Tanin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm máu, trĩ, rò hậu môn Có thể dùng tanin tinh chế pha trong dung dịch nước 1-2% hoặc thuốc bột, thuốc mỡ 10-20% Khi dùng trong (uống) nên dùng chế phẩm tanalbumin... được tanin tác dụng trên niêm mạc miệng - thực quản- dạ dày gây khó chịu và rối loạn tiêu hóa Người lớn uống 2- lOg chia làm liều nhỏ lg Có thể chế dạng tanat gelatin dùng như tanalbin Tanaform ( =tanin + formol) dùng bôi ngoài 13 PHẦN 2 THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỤC NGHIỆM 2.1.1 Nguyên liệu Lá chè dây thu hái ở Cao Bằng tháng 10 năm 2003, tên khoa học của mẫu nghiên cứu . Để góp phần nâng cao giá trị sử dụng của cây chè dây chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Góp phần nghiên cứu tanin trong chè dây với các nội dung chính sau: Về hóa học: - Định tính tanin. TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI PHẠM THUỲ DƯƠNG GÓP PHẦN NGHIÊN cứu TANIN TRONG CHÈ DÂY Ampelopsis cantoniensis Planch. Vitaceae (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999 - 2004) -. dihydromyricetin(l,7%) [17] A.japonica tanin và polyphenol [24] l.ỉ.2.2. Những nghiên cứu về thành phần hoá học của loài A. cantoniensis Planch Nghiên cứu về A .cantoniensis trên thế giới hầu như không có. Ở Việt Nam nhóm nghiên