2.2.3.1. Phân lập tanỉn trong cắn Tj bằng sắc ký cột
Chất hấp phụ: Silicagel (Merck) có kích thước hạt (0,04 - 0,063mm), dung môi phản hấp phụ là Cloroform và tăng dần tỷ lệ phân cực bằng MeOH.
Cột sắc ký sử dụng có kích thước (|) 2cm X 25cm.
*. Chuẩn bị cột sắc ký: Cột được rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng. Đáy cột được lót bằng lớp bông thuỷ tinh. Chất hấp phụ được hoạt hóa ở 110 °c, trong
1 giờ. Lắc Silicagel với dung môi cloroform và rót từ từ lên cột. Rót dung môi, mở vòi cho chảy liên tục, ổn định cột trong vòng 5 giờ. Sau khi cột đã ổn định cho dung môi chảy vừa đến mặt lớp chất hấp phụ khoá vòi lại. Cho cắn Tị/
MeOH (đã trộn với một lượng nhỏ Silicagel) dải nhẹ lên bề mặt cột, sau cùng cho một lớp nhỏ Silicagel lên trên (để tránh xáo trộn cột khi dung môi rửa chạy qua).
*. Khai triển cột sắc ký: cho dung môi chảy qua cột với tốc độ 1 5 - 2 0 giọt trong một phút. Hứng các phân đoạn bằng ống nghiệm 5 ml có đánh số thứ tự, mỗi ống hứng khoảng 2 ml.
Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM với hệ dung môi Cloroform : Ethylacetat : Acid formic [1 : 7 : 1], gộp các ống nghiệm có Rf trong bản sắc ký tương đương lại với nhau.
Qua kiểm tra bằng SKLM thấy:
+ Phân đoạn từ ống số 20 đến 24 xuất hiện một vết có Rf tương tự nhau. Gộp các ống từ 20 đến 24 lại, để bay hơi tự nhiên, kết tinh lại nhiều lần thu được chất kết tinh có tinh thể hình kim màu vàng nhạt. Ký hiệu chất này là TD,
+ Phân đoạn từ ống số 47 đến 50 xuất hiện một vết có Rf tương tự nhau. Gộp các ống này lại, để bốc hơi tự nhiên, kết tinh lại nhiều lần, thu được tinh thể hình kim màu vàng xanh. Ký hiệu chất này là TD2.
*. Kiểm tra độ tinh khiết của TD^
Hoà tan TDj vào một ít MeOH rồi chấm lên hai tấm sắc ký, sau đó khai triển trên hai hệ dung môi khác nhau:
Hệ I : Cloroform : Ethylacetat: Acid formic [ 1 : 7 : 1 ] , Hệ II: Toluen : Cloroform : Acid formic [ 5 : 6 : 1], Kết qua SKLM trên 2 hệ dung môi của TDj đều cho một vết. *. Kiểm tra độ tinh khiết của TD2.
Hòa tan TD2 vào một ít MeOH rồi chấm lên hai tấm sắc ký, triển khai với hai hệ dung môi khác nhau:
Hệ I : Cloroform : Ethylacetat: Acid formic [ 1 : 7 : 1 ] . Hệ II: Toluen : Cloroform : Acid formic [ 5 : 6 : 1]. Kết quả SKLM trên hai hệ dung môi đều cho một vết.
2.2.3.2. Phân lập tanin trong cắn T2
*. Giai đoạn 1: Phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là Silicagel dùng cho sắc kỷ cột (Merck) kích thước hạt (0,04 - 0,063mm), dung môi phản hấp phụ là Cloroform được tăng dần độ phân cực bằng MeOH.
Tiến hành tương tự như khi phân lập Tj, thu được phân đoạn D2 từ ống 25 đến ống số 40 có 2 vết chất.
*. Giai đoạn 2: Tiếp tục phân lập phân đoạn D2 bằng sắc ký cột Sephadex LH20, dung môi phản hấp phụ là MeOH 80%:
+ Chuẩn bị cột : Cột có kích thước (ị)l,8cm X 20 cm, rửa sạch cột, lắp thẳng đứng, đáy cột lót bằng một lớp bông thuỷ tinh. Dùng Sephadex LH20 ngâm trong MeOH 80% đến trương nở hoàn toàn sau đó nhồi vào cột .Khi cột đã ổn định cho dung môi chảy vừa đến mặt lớp chất hấp phụ, khoá vòi lại. Cho cắn tanin hòa tan bằng một lượng vừa đủ MeOH lên trên. Mở khoá cột, khi chất
cần phân tích chảy vừa đến mặt lớp chất hấp phụ cho dung môi chảy từ từ qua cột với tốc độ 20 giọt / phút. Dùng ống nghiệm 5 ml để hứng các phân đoạn, mỗi ống hứng khoảng 2 ml.
Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM với hai hệ dung môi: Hệ I: Cloroform : Ethylacetat: Acid formic [ 5 : 4 : 1 ] Hệ II: Toluen : Ethylacetat: Acid formic [ 5 : 6 : 1 ] .
Kết quả ở phân đoạn D2 từ ống sô 25 đến ống sô 30 xuất hiện một vết có cùng Rf, gộp các ống này lại, để bay hơi tự nhiên thu được một chất bột không màu, ký hiệu chất này là TD3.
2.2.4. Sơ bộ nhận dạng chất phân lập được (TDj, TD2, TD3)
2.2.4.I. Chất TD1
- Chất TDj ở dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt. Tan tốt trong MeOH, ethanol, aceton, không tan trong các dung môi hữu cơ khác.
- Phổ uv đo trong MeOH cho các đỉnh hấp thụ Ằ.max ở 275,5 nm; 233,3 nm và 206,6 nm.
2.2A.2. Chất TD2
- Chất TD2 ở dạng tinh thể hình kim màu vàng xanh. Tan tốt trong MeOH, ethanol, aceton, nước, không tan trong các dung môi hữu cơ khác.
- Phổ uv đo trong MeOH cho các đỉnh hấp thụ ^ max ở 275,5 nm; 226,6 nm và 204,4 nm.
2.2.4.3. Chất TD3
- Chất TD3 ở dạng bột vô định hình, không màu. Tan tốt trong MeOH, ethanol, aceton, nước, không tan trong các dung môi hữu cơ khác.
- Phổ ƯV đo trong MeOH cho các đỉnh hấp thụ ^max ở 291,1 nm; 227,7 mn và 210 nm.
- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở 3328,8; 1637,4; 1472,9; 1349,3; 1272,9; 1169,1; 1082,9; 1030,0 c m 1
- Phổ khối (MS) có các pic mảnh: 57, 60, 97, 129, 149, 185, 213, 236, 256, 284, 353, 368 mu.
Nhận xét:
Vì lượng chất phân lập được chưa nhiều do đó chất TDj và TD2 mới đo được phổ ƯV, TD3 mới đo được phổ u v , IR và MS. Hơn nữa cấu trúc tanin rất phức tạp do đó để nhận dạng cấu trúc hoá học các chất trên cần có thời gian nghiên cứu tiếp.
2.2.3. Thử một sỏ tác dụng sinh học
2.2.3.1. Thử tác dụng kháng khuẩn của tanỉn
Chúng tôi chọn cắn T1 và T2 chiết xuất từ lá chè dây theo phương pháp 2 làm mẫu thử.
*. Chuẩn bị khoanh giấy lọc.
Dùng khoanh giấy có đường kính khoảng 6mm, hấp tiệt trùng ở 110°c trong 30 phút.
*. Chuẩn bị mẫu thử: tẩm chất cần thử đã pha với nồng độ 4 mg/ml lên khoanh giấy lọc trong vòng 3 - 5 phút, sấy nhẹ (t° < 50°C), làm như vậy 3 lần.
- Mẫu 1: cắn T !, làm 40 khoanh - Mẫu 2: cắn T2, làm 40 khoanh
Mỗi khoanh giấy chứa hoạt chất tương đương khoảng 0,4 mg *. Chuẩn bị mẫu đối chứng:
- Pha dung dịch penicillin 20 UI/ ml và dung dịch gentamicin 20 |Xg/ ml. -Tẩm các dung dịch kháng sinh trên vào các khoanh giấy lọc trong vòng 3 - 5 phút, sấy nhẹ (t° < 50°C) cho đến khô, làm như vậy 3 lần.
+ Mỗi khoanh giấy tẩm gentamicin chứa khoảng 2\ig kháng sinh. Mỗi mẫu đối chứng làm 20 khoanh giấy như thế.
*. Chuẩn bị môi trường kiểm định: vi sinh vật kiểm định trước khi thử được cấy vào môi trường canh thang trước 1 8 - 2 4 giờ (ủ ở 37°C), tạo thành nhũ dịch vi sinh vật kiểm định có nồng độ 107 - 108 tế bào trên 1 ml, cho vào môi trường thạch thường (đã được tiệt trùng ở 118°c , thời gian 30 phút) ở 45-
50°c với tỷ lệ nhũ dịch : vthạch thường= 1 : 40 và đổ ra hộp petri có đường kính như nhau (20 ml/hộp).
*. Đặt mẫu thử:
Dùng panh vô trùng, đặt khoanh giấy lọc đã tẩm chất thử lên đĩa thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định.
Song song tiến hành trong cùng điều kiện với mẫu đối chứng là penicillin đối với các chủng vi sinh vật Gram(+) và gentamicin đối với các chủng vi sinh vật Gram(-).
Sau khi đưa mẫu thử và mẫu đối chứng vào các đĩa petri được đưa vào tủ ấm
(37°c ), thời gian từ 18 - 24 giờ, để vi sinh vật kiểm định phát triển. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính của vòng vô khuẩn với dụng cụ là thước kẹp panmer với độ chính xác 0,02 mm. Kết quả thực nghiệm được xử lý theo toán thống kê và trình bày ở bảng 8 và hình 4, hình 5.
Bảng 8: Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của cắnT1 và T2 Mẫu n Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
B.s B.c B.p Sta S.L Sal Shi E .c Pro Pseu
1 TI 4 9,21 ±4,32 8.52 ±0,02 8.96 ±0,00 8,05 ±0,03 12,46 ±0,37 8,79 ±0,01 8,2 ±0,00 8,42 ±0,11 8,78 ±0,03 8,49 ±0,03 2 T2 4 7,41 ±0,16 7,30 ±0,11 7,33 ±0,25 6,5 ±0,21 8,46 ±0,44 7,53 ±0,04 7,23 ±0,30 7,4 ±0,00 6,35 ±0,10 7,39 ±0,32 3 K.s 4 13,11 ±1,11 12,62 ±0,88 13,02 ±0,36 10,45 ±0,41 16,31 ±0,69 11,33 ±0,19 12,39 ±0,05 11,59 ±0,63 13,10 ±0,04 13,04± 0,29 Mẫu đối chứng là penicillin
2 UI
Mẫu đối chứng là gentamicin 2 ^ g
Nhận x é t : Các mẫu thử T\ và T2 đều có hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ khá thấp, trong đó Ti thể hiện tác dụng kháng khuẩn mạnh hơn T2. Trong các chủng vi sinh vật kiểm định T\ và T2 đều tác dụng tốt hơn trên Sarcina lutea và Salmonella ty phi.
Bacillus subtilis Salmonella typhi
Hình 4 : Ảnh các mẫu thử kháng khuẩn của Ti và T2. Chú thích : 1: mẫu T]
2: mẫu T2
3: kháng sinh penicillin 4: kháng sinh gentamicin
Pseudomonas aeruginosa Shigella flexneri
Escherichia coli
Hình 5: Ảnh các mẫu thử kháng khuẩn của Tị và T2. Chú thích: 1: mẫu Tị
2: mẫu T2
2.2.3.2. Thử tác dụng chống oxy hoá của tanỉn toàn phần:
Thử tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não chuột (invitro). Tiến hành:
+ Pha tanin toàn phần (Tủa T) trong nước với nồng độ 1 mg/ml. Sau đó đưa dung dịch này vào 6 ống nghiệm đã đánh số thứ tự với các thể tích tương ứng là 0,000 ml; 0,100 ml; 0,200 ml; 0,300 ml; 0,400 ml; 0,500 ml.
+ Chuẩn bị dịch đồng thể gan và não chuột:
Cân chính xác khoảng 0,4g tế bào gan chuột (hoặc não chuột) cho vào cối sứ
đã chứa sẩn 5ml KC1. Đặt cối sứ vào khay đá ở 4°c rồi nghiền hỗn hợp trong 3 phút thành hỗn dịch đồng đều. Chuyễn hỗn dịch vào một cốc thuỷ tinh sạch, thêm dung dịch KC1 sao cho thể tích của hỗn hợp là 19,6 ml. Thêm vào mỗi ống nghiệm đã đánh số ở trên lml dịch đồng thể này.
- Đối với dịch đồng thể gan chuột, tiến hành oxy hoá invitro bằng cách cho thêm 0,2 ml dung dịch Fe2+/ Acid ascorbic. Lắc đều các ống và ủ 20 phút ở 37°c trong bình điều nhiệt. Thêm dung dịch KC1 để thể tích các ống vừa đủ 2 ml.
- Đối với dịch đồng thể não chuột, do mô não rất nhạy cảm với phản ứng peroxy hoá lipid nên các ống nghiệm không cho thêm tác nhân oxy hoá mà để ổn định trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Thêm dung dịch KC1 để thể tích các ống vừa đủ 2 ml.
+ Thêm 1 ml dung dịch acid tricloacetic 40% vào tất cả các ống nghiệm. Ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút.
+ Cho thêm vào mỗi ống 1 ml acid thiobarbituric. Đun cách thuỷ 30 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng.
+ Đo độ hấp thụ quang học của các ống ở 532nm. Xác định hàm lượng MDA theo đường chuẩn sử dụng MDA tinh khiết nồng độ từ 2,00nm - 15,2nm.
Kết quả xác định độ ức chế ở các nồng độ khác nhau của mẫu thử tanin toàn phần được trình bày ở bảng 9.
Bảng 9: Kết quả thử tác dụng chống oxy hoá trên dịch đồng thể gan và não chuột Lượng T đưa vào phản ứng (ml) Nồng độ cuối cùng của T trong hỗn hợp phản ứng(mg/ ml) X e ± S D n — 3 X mda± S D n = 3 Tỷ lệ % so với đối chứng
Não Gan Não Gan Não Gan
0,000 0,000 0,346 ±0,005 0,405 ± 0,0007 9,85 ±0, 2 10,39 ±0,02 100 100 0,100 0,025 0,1555 ±0,004 0,175 ± 0,004 4,57 ± 0,3 4,96 ±0,1 43,9 47,7 0,200 0,05 0,142± 0,01 0,155 ± 0,01 4,03 ± 0,16 4,4 ±0,04 40,9 42,3 0,300 0,75 0,128 ± 0,0007 0,129 ± 0,01 3,68 ± 0,18 3,66 ± 0,04 37,4 35,2 0,400 0,100 0,125 ± 0,0007 0,112 ± 0,003 3,54 ± 0,02 3,18 ± 0,08 35,9 33,6 0,500 0,125 0,123 ± 0,0007 0,105 ± 0,001 3,48 ± 0,02 2,98 ±0,04 35,3 31,6
Ghi chú: X ^ : Hàm lượng MDA trung bình
Nhận xét: Tủa T thể hiện tác dụng ức chế phản ứng peroxy hóa lipid dịch đồng thể đối với cả tế bào gan và não chuột. Độ ức chề đều đạt trên 50 % .
PHẦN 3
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.1. KẾT LUẬN
Qua thời gian làm thực nghiệm chúng tôi đã thu được những kết quả sau: • Bằng phản ứng hoá học đã xác định tanin trong dược liệu là tanin pyrocatechic
• Đã xây dựng được hai phương pháp chiết xuất tanin từ lá chè dây, so sánh hàm lượng tanin chiết được chúng tôi thấy phương pháp 2 chiết được tanin nhiều hơn so với phương pháp 1.
• Bằng phương pháp sắc ký cột đã phân lập được 3 chất tinh khiết (TDj, TD2, TD3). Vì lượng phân lập được chưa nhiều, chất TDj và TD2 chúng tôi mới đo được phổ u v , chất TD3 mới đo được phổ u v , IR, MS. Để nhận dạng cần tiếp tục nghiên cứu thêm.
• Đã thử tác dụng kháng khuẩn của tanin trên 5 chủng vi sinh vật Gram (+) và 5 chủng vi sinh vật Gram(-) đều cho kết quả dương tính, trong đó chất Tj có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn chất T2 và cả hai chất đều tác dụng trên Sarcina lutea và Salmonella typhi mạnh hơn các chủng khác trong số vi khuẩn thử.
• Đã nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá cho thấy tanin toàn phần thể hiện tác dụng ức chế phản ứng peroxy hoá lipid dịch đồng thể đối với tế bào gan và tế bào não chuột thí nghiệm. Độ ức chế đạt trên 50 %.
3.2. ĐỀ XUẤT
Tiếp tục nghiên cứu, phân lập các chất có hoạt tính sinh học cao, tạo ra chế phẩm để thử nghiệm lâm sàng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Mục lục Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ môn dược liệu (1998), Bài giảng dược liệu , Trường Đại học Dược Hà Nội, tập 1.
2. Bộ môn dược liệu (1999), Thực tập dược liệu (phần hoá học), Trường Đại học Dược Hà Nội
3. Bộ môn Vi sinh (1999), Kí sinh trùng 1, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 138-167.
4. Bộ môn Vi sinh (1999), Thực tập Vi sinh-Kí sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội.
5. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, NXB Y học.
6. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học. 7. Vũ Văn Chuyên(1976), Thực vật học, NXB Y học, tập II, tr. 99.
8. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học.
9. Triệu Duy Điệt (1995), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và tác dụng sinh học của một số chất chiết từ cây xoan trà(Choerospondias axillaris Burtt et Anacardỉaceae), Luận án Phó tiến sĩ khoa học Y Dược , Trường Đại học Dược Hà Nội.
10.Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, tập II, tr. 454-477.
11. Nguyễn Tiến Khanh(1997), Thống kê ứng dụng trong công tác dược, tủ sách sau đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 87- 135.
12. Phạm Thanh Kỳ, Phùng Thị Vinh (1994),”Favonoid trong chè dây”, Tạp chí Dược học, 6, tr. 10.
13. Nguyễn Thị Tuyết Lan (1999), Đánh giá tác dụng điều trị loét hành tá
METRONIDAZOL-AMOXICILLIN, Luận văn thạc sĩ Y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội.
14. Vũ Nam(1995), Góp phần nghiên cứu tác dụng của chè dây trong điều trị loét dạ dày hành tá tràng, Luận án Phó tiến sĩ Y khoa Trường Đại học Y Hà Nội.
15. Ngô Văn Thu(1980),Hoá học Saponin, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
16. Vương Thị Hổng Vân (2002),Nghiên cứu cây chè dây Sapa(Ampelopsis cantoniensis (Hook, et Arn) Planch. Vitaceae), Luận văn thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
17. Phùng Thị Vinh (1995), Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây chè dây(Apelopsis cantoniensis Planch ,,vitaceae), Luận án Phó tiến sĩ khoa học Y dược, Trường Đai học Dược Hà Nội.
Tài liệu Tiếng Anh
18. Camoirano A., Balansky R. M., Bennicelli c. (1994), “Experimental database on inhibition of the bacterial mutagenicity of 4- Nitroquinoline 1 - oxide and cigarette smoke”, Mutat - Res.,2, p. 89.
19. Kotas Dimas, Costas Demetzos etc.(2000), “Biological activity of myricetin and its derivatives against human leukemic cell lines in vitro”,
Pharmacological Research, 5, p. 475 - 478.
20. J . B. Harborne (1993), Methods in Plant Biochemistry, Academic press, volume 1, P. 389- 418.
21. E . Haslam(1996), Chemistry o f Vegetable tanin, Academic press, p. 18-