Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng micronospora 16119

ĐẶT VẤN ĐỂCùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngày càng có nhiều chủng kháng sinh mới được sản xuất bằng phương pháp bán tổng hợp hay tổng hợp toàn phần , nhưng việc tìm ra các

Bộ y tếTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

VŨ THỊ HƯƠNG GIANG

MICROMONOSPORA 16119

( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHOÁ 1999-2004)

Người hướng dẫn: TS CAO VĂN THU Nơi thực hiện: Bộ môn công nghiệp dược

Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: 1/3 - 20/5/2004

LỜ I CẢM Ơ N

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tớ i:

Thầy giáo TS Cao Văn Thu

Người đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận tốt

nghiệp này

Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới tất cả các thầy cô trong bộ môn Công Nghiệp Dược và các bộ môn khác, các kỹ thuật viên trường Đại Học Dược Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Xin cảm ơn tất cả bạn bè và gia đình tôi, những người đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian qua

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm2004

Sinh viên: Vũ Thị Hương Giang

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đề 1

Phần 1- Tổng quan 2

1.1- Đại cương về Micromonospora 2

1.1.1- Đặc điểm của chi Micromonospora 2

1.1.2- Một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Micromonospora 2

1.1.3- Sự tạo thành kháng sinh của Micromonospora 3

1.2- Đột biến cải tạo giống 4

1.2.1- Đột biến ngẫu nhiên 4

1.2.2- Đột biến nhân tạo 4

1.2.3- Tối ưu hoá đột biến và tuyển chọn sau đột biến 5

1.3- Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 5

1.3.1- Lên men bề măt 5

1.3.2- Lên men chìm 6

1.4- Chiết tách và tinh chế 7

1.4.1- Chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 8

1.4.2- Sắc ký 8

1.5- Phân loại bước đầu 9

1.6- Một số nghiên cứu về phân loại Micromonospora 10

Phần 2- Thực nghiệm và kết qủa 13

2.1- Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 13

2.1.1- Nguyên vật liệu 13

2.1.2- Phương pháp nghiên cứu 17

2.2- Kết quả và bàn luận 24

2.2.1- Chọn biến chủng để nghiên cứu 24

2.2.2- Kết quả thử khả năng STH kháng sinh của chủng trên các MT nuôi cấy khác nhau 25

2.2.3- Kết quả cải tạo, chọn giống v s v 26

2.2.4- Kết quả lên men STH kháng sinh 31

2.2.5- Kết quả chiết xuất, tinh chế 34

2.2.6- Kết quả các thử nghiệm phân loại 40

Phần 3- Kết luận và đề xuất 43

3.1- Kết luận 43

3.2- Đề xuất 43

Phụ lục.

Tài liệu tham khảo.

Pro : Proteus mirabilis

Pseu : Pseudomonas aeruginosa

Shi : Shigella flexneri

ĐẶT VẤN ĐỂ

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngày càng có nhiều chủng kháng sinh mới được sản xuất bằng phương pháp bán tổng hợp hay tổng hợp toàn phần , nhưng việc tìm ra các kháng sinh mới nguyên gốc từ các loài v s v vẫn đang được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm

Penicillin là kháng sinh đầu tiên được tìm ra vào năm 1928 do nhà bác học Alexander Fleming Từ đó đến nay đã có khoảng hơn 8000 kháng sinh được biết đến nhờ quá trình STH của v s v trong đó xạ khuẩn chiếm một tỷ lệ cao Việt Nam có điều kiện khí hậu nhiệt đới là điều kiện tốt cho các loài v s v phát triển mạnh nên công việc nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam trong những năm gần đây tuy quy mô còn bé song cũng đã và đang được khởi sắc Điển hình là việc phân

lập đươc một số chủng Micromonospora có khả năng STH kháng sinh hoạt phổ

rộng và có tính ổn định di truyền tốt Đây là nguồn gen quý hiếm giúp cho việc tạo ra các kháng sinh, đem lại nhiều ứng dụng trong lĩnh vực phòng bệnh, chữa bệnh cho người và động vật

Chủng Micromonospora 16119 là kết quả của việc phân lập xạ khuẩn từ cơ

chất bùn đất ở Việt Nam Để góp phần nghiên cứu về đặc tính sinh lý, sinh hoá,

khả năng STH kháng sinh, từ chủng Micromonospora 16119 chúng tôi đã lựa

- Nghiên cứu sơ bộ phương pháp chiết tách và tinh chế kháng sinh

- Tiến hành nghiên cứu bước đầu phân loại Micromonospora 16119.

PHẦN 1- TỔNG QUAN

1.1- Đại cương về Mỉcromonospora [7], [13], [14]

1.1.1- Đặc điểm của chi Micromonospora.

Mỉcromonospora là một chi thuộc lớp phụ xạ khuẩn Actinomycetes phân bố

khá phổ biến trong tự nhiên : trong đất, bùn ao hồ, bùn cát sông, biển.v.v Chúng không hình thành khuẩn ty khí sinh, chỉ tạo khuẩn ty cơ chất với đường kính khuẩn ty khoảng 0 ,6-0,8)j, m

Khuẩn lạc của chúng hình thành sau 5-7 ngày nuôi cấy Bào tử đơn độc đính trên cuống bào tử có thể có dạng đơn (monopodial), dạng đôi (dipodial) hoặc dạng chùm (sympodial) trên hệ sợi của khuẩn ty cơ chất Khuẩn lạc màu vàng sáng chuyển dần sang da cam hay đỏ da cam với màu đen, đen sẫm cùng với sự hình thành bào t ử Bào tử đươc tạo thành cả ở nuôi cấy chìm và nuôi cấy bề mặt

Bề mặt bào tử xù xì hoặc có gai, đường kính khoảng lịam

1.1.2- Một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Mỉcromonospora.

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng là từ 20- 40°c, nhiệt độ tối

thích là 30 ± 2°c Nhiệt độ trên 50°c các loài Micromonospora đều không phát

triển được, nhưng bào tử của chúng lại rất bền với nhiệt Ở điều kiện 60°c trong

20 phút, 50% bào tử của chúng vẫn chịu được Bào tử phát triển ở pH = 6,5 - 8,0

nhưng dễ mẫn cảm ở pH < 6 Là vi khuẩn Gram (+), khả năng kháng acid kém

Hầu hết các loài của chi Micromonospora đều là vi sinh vật hiếu khí Cho đến nay biết được có 2 loài là vi sinh vật kị khí đó là: M.acetoformici và

M.propionici Một tính chất có thể dùng để xác định loài đối với chi

Micromonospora là sự tạo sắc tố hoà tan có màu sắc khác nhau trên môi trường

nuôi cấy Ngoài các sắc tố cơ chất màu da cam thì các sắc tố hoà tan lại luôn

khác nhau: Nâu, hồng, tím, xanh lá cây, xanh.

1.1.3- Sự tạo thành kháng sinh của Micromonospora.

Nhiều loài của chi Micromonospora có khả năng tạo ra kháng sinh và một

số kháng sinh đã được ứng dụng trong thực tế

Một số nhóm kháng sinh mà chúng tạo ra: Aminoglycosid, macrolid, ansamycin, polipeptid Theo những nghiên cứu của các nhà khoa học các kháng

sinh được tạo ra từ Micromonospora có hoạt phổ rộng và sử dụng rộng rãi là:

- Verdamicin do M.grísea ( Weinstein và cộng sự, 1975 ).

- Fortimicin do M.olivoasterospora ( Naro và cộng sự, 1977 )

- Sagamicin do M.sagamiensỉs ATc c 21083

* Nhóm macrolid

- Rosamicin do M.rosaría ( Wagman và cộng sự, 1972 ).

- Megalomicin do M.megalonicea ( Weinstein và cộng sự, 1969 ).

- Erythromycin do M.sp 1225 ( Marquez, 1976 ).

* Nhóm polipeptid

- Chalcidin do M.chalcea H 85 ( Gauze và cộng sự, 1970 ).

* Kháng sinh chống nấm và tế bào u

- Pyrolosporin A do Micr.sp ATTC 53803 ( Mair M.G Mishrask ).

* Một số kháng sinh khác như: Eveminomicin do M carbonacea.

1.2- Đột biến cải tạo giống [2], [4], [8]

Dạng đột biến quan trọng nhất trong cải tạo giống v s v là những biến đổi trong trình tự sắp xếp các base trong ADN hay sự thêm bớt các cặp base trong ADN Sự sinh ra đột biến gọi là phát sinh đột biến Các yếu tố gây đột biến gọi là các tác nhân đột biến Tuỳ theo nguyên nhân phát sinh đột biến mà người ta chia đột biến ra làm 2 lo ạ i:

1.2.1- Đột biến ngẫu nhiên.

Là những thể đột biến phát sinh mà không có sự can thiêp của các tác nịiânđột biến Các v s v bị biến dị tự nhiên theo tần suất khác nhau Ta cần chọn lấy các cá thể có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp

Trên thực tế, phương pháp chon loc ngẫu nhiên các cá thể có hoạt tính cao dùng để nghiên cứu ban đầu Để thu được các chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh cần phải áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo để tuyển chọn giống

1.2.2 - Đột biến nhân tạo.

Là những thể đột biến được tạo ra bởi các tác nhân với mục đích nâng cao tần suất xuất hiện đột biến từ 1 0 - 1 0 0 0 0 0 lần

Các tác nhân đột biến thường sử dụng là:

- Tác nhân vật lý: Tia X(Rơngen), tia cực tím có X = 250 - 280nm các tia

này có tác dụng gây chết mạnh và gây đột biến với các chủng vi sinh vật

Ngoài ra còn dùng tia gama, neutron làm tác nhân gây đột biến

- Tác nhân hoá học: Methyl-bis-(P -clor-diethyl)-amin, triethyllen melanin, dimethylsulíat, NG(N-methyl-N’-nitro-N-nitroso-guanidin), HN02

- Tác nhân sinh học: Đột biến do hiện tượng thiếu các base nitơ hay do tảcỊỊ

động của các gen gây đột biến

1.2.3- Tối ưu hoá đột biến và tuyển chọn sau đột biến.

Ngoài tác dụng gây đột biến của các tác nhân gây đột biến thì sự thay đổi các tính trạng của vi sinh vật còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: pH môi trường,

hệ đệm, nồng độ hay cường độ của tác nhân gây đột biến, thời gian xử lý cũng như trạng thái phát triển của vi sinh vật Do đó cần phải tối ưu hoá các yếu tố trên

để có thể thu được kết quả mong muốn

Phương pháp hữu hiệu để đánh giá là lập đường cong biểu diễn sự tác động kết hợp của các yếu tố với tần xuất gây đột biến Thông thường khi xử lý đột biến

số lượng vi sinh vật còn sống sót là rất thấp (0 1 - 1%) và ta phải tìm, lựa chọn trong số ít ỏi các vi sinh vật còn sống các biến chủng dương so với chủng ban đầu Để có thể chọn lựa ta đem khảo sát khả năng tạo sản phẩm mục tiêu (khả năng sinh tổng hợp kháng sinh), song song làm mẫu đối chứng để thấy được rõ tác dụng của tác nhân gây đột biến

Phương pháp này đòi hỏi nhiều công sức và thời gian nhưng trong đa số

trường hợp lại là con đường duy nhất mang lại kết quả

1.3- Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [5], [8], [10], [13]

Hiện nay ngoài Cloramphenicol do có cấu trúc đơn giản có thể tổng hợp hoá học hoàn toàn, còn lại hầu hết các sản phẩm kháng sinh hiện nay có được đều có nguồn gốc lên men của các chủng vi sinh vật tạo kháng sinh

Tuy nhiên điều kiện lên men( pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, thành phần môi trường) ở mỗi chủng khác nhau là rất khác nhau, do đó việc nghiên cứu điều kiện lên men là rất cần thiết

Có hai kiểu lên men chính hay sử dụng: Lên men chìm và lên men bề mặt.1.3.1- Lên men bề măt

Đây chính là qúa trình nuôi cấy phát triển của vi sinh vật trên bề mặt môi trường lên men Môi trường lên men có thể là rắn hay lỏng

- Môi trường rắn hay dùng là: Cám, tấm, bột ngô, bột khoai.

- Môi trường lỏng hay dùng là: Dung dịch đường (glucose, fructose,

maltose, sacaroze) phối hợp với một số chất vi lượng

Lên men bề mặt dù trên môi trường rắn hay lỏng thì môi trường cũng phải đảm bảo các yêu cầu sau: Bề mặt môi trường phải đủ rộng, môi trường không quá sâu (4 - 8cm), ủ trong điêu kiện nhiệt độ, độ ẩm phù hợp

+ Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầuthấp

+ Nhược điểm là tốn nhiều mặt bằng diện tích, khó cơ giới hoá do đó phương pháp này chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm để nghiên cứu tuyển chọn giống

1.3.2- Lên men chìm

Ở phương pháp này vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng và chúng phát triển trên toàn bộ thể tích môi trường Giống vi sinh vật trước khi lên men phải có khả năng phát triển mạnh, thường sử dụng các tế bào sinh dưỡng

đang ở pha luỹ thừa Vì vậy giống được tạo giống qua các cấp tạo giống khác

nhau, từ thể tích nhỏ đến thể tích lớn ( giống cấp I, cấp n, cấp I II) Tỷ lệ cấy giống từ 1 -10% so với môi trường lên men Qui mô giống phụ thuộc vào qui mô của bình lên men

Phương pháp này có một số ưu điểm: Sử dụng được tối đa môi trường dinh dưỡng, hiệu suất lên men cao, tiết kiệm được mặt bằng có thể cơ giới hoá và tự động hoá toàn bộ quá trình sản xuất Song phương pháp này cũng cần có những điều kiện nhất định, phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị kỹ thuật hiện đại, điều kiện sản xuất phải tuyệt đối vô trùng

Lên men chìm được chia thành nhiều kiểu: Lên men gián đoạn, lên men bán liên tục và lên men liên tục Lên men gián đoạn là lên men trong một hệ

thống kín, trong suốt thời gian lên men không có tác động bổ sung vào hệ thống ngoại trừ việc cung cấp oxi, chất phá bọt, chất điều chỉnh pH Sự phát triển của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn gọi là các pha: Pha tiềm tàng, pha logarit, pha dừng

và pha suy tàn Trong sản xuất công nghiệp việc kết thúc quá trình lên men ở pha nào phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất bị dừng ở pha nào trong chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật Ngoài ra còn phải tính đến giá trị kinh tế để dừng quá trình lên men lại

Ở đây ta chưa nói đến thành phần của môi trường lên men, điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật

1.4- Chiết tách và tinh chế [3], [5], [8]

Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Tuỳ theo đặc điểm của loài

mà sản phẩm thứ cấp đó được tiết vào môi trường lên men ( Penicillin,

streptomycin) hoặc giữ lại trong sinh khối của vi sinh vật sau khi lên men ( Gramixidin, nystatin) Tuy nhiên kháng sinh thường tồn tại ở dạng lẫn nhiều tạp chất, do đó việc chiết tách và tinh chế là rất cần thiết

Một số phương pháp chiết tách hay dùng:

- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ: ví dụ như Penicillin

Phương pháp này dựa vào hệ số phân bố của hoạt chất trong các dung môi

không đồng tan với nhau ở cùng điều kiện, từ đó ta có thể chiết được hoạt chất

- Ở phương pháp này phải có các ionit có dung lượng trao đổi ion lớn, dễ phản hấp phụ để không ảnh hưởng đến hoạt chất.

Nếu như kỹ thuật chiết xuất và tinh chế kháng sinh phù hợp sẽ cho những sản phẩm kháng sinh đạt chất lượng cao, bảo quản được lâu dài Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh thường áp dụng một số phương pháp tinh chế như: lọc, chiết, hấp phụ, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột

1.4.1- Chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ.

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dựa vào sự phân bố của chất kháng sinh giữa hai pha không đồng tan với nhau, gồm dung môi chiết và dịch lọc của dịch lên men hay sinh khối Từ đó có thể tách riêng chất kháng sinh hoặc nhóm chất có hoạt tính diệt khuẩn

Với kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dịch lên men của vi sinh vật ta ứng dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng với một số cách:

- Chiết đơn (chiết một lần)

- Chiết lặp (chiết nhiều lần)

- Chiết ngược dòng

1.4.2- Sắc ký.

Sắc ký là phương pháp tách và phân tích các chất dựa vào sự phân bố của hoạt chất giữa hai pha: Pha động và pha tĩnh

Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Chất nào

có ái lực lớn với pha tĩnh thì sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký, chất nào có ái lực yếu với pha tĩnh thì sẽ chuyển động nhanh hơn qua hệ thống sắc ký

Do đó các chất trong hỗn hợp có thể tách riêng xa nhau

Theo bản chất có thể chia sắc ký thành 4 loại: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion và sắc ký trên gel

- Sắc ký phân bố: Pha tĩnh là chất lỏng không hoà tan được với pha động Chất

lỏng này được bao trên bề mặt một chất rắn gọi là giá (chất mang).

- Sắc ký hấp phụ: Pha tĩnh là chất rắn có khả năng hấp phụ

- Sắc ký trao đổi ion: Pha tĩnh là chất mang có nhóm hoạt hoá chứa các ion trao đổi, sắc ký trao đổi ion dựa vào hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch với các ion trong thành phần của chất trao đổi ion

- Sắc ký trên gel: Chất hấp phụ là các gel Pha tĩnh là dung môi nằm trong các

lỗ xốp của hạt, pha động là dung môi giữa các hạt Các phân tử lượng lớn thí sẽ không bị giữ và di chuyển theo dung môi, các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ chui vào các lỗ xốp rất khó ra

Khi rửa dải các phân tử sẽ ra lần lượt là các cỡ lớn đến cỡ nhỏ Có nhiều loại gel với các lỗ xốp khác nhau để tách các phân tử có trọng lượng khác nhau Khi chiết tách và tinh chế sản phẩm người ta thường dùng kết hợp cả hai phương pháp: Phương pháp chia cắt pha và phương pháp chuyển pha

1.5 - Phân loại bước đầu [11], [12], [13], [14]

Phân loại Micromonospora là một công việc cần thiết nhưng cũng phức tạp và

tốn nhiều công sức: Chúng tôi chưa tham khảo được một nghiên cứu nào tiến

hành phân loại thành công Micromonospora ở Việt Nam.

Để nghiên cứu phân loại Micromonospora chúng ta có thể dựa trên các đặc

điểm sau:

- Khả năng tiêu thụ nguồn cacbon - Số lượng bào tử trên 1 chuỗi bào tử

- Sự thuỷ phân tinh bột

1.6 - một số nghiên cứu về phân loại Micromonospora [12], [13]

1.6.1- Nghiên cứu về phân loại Micromonospora phân lập từ đất của Jensen.

Vào năm 1932, Jensen đã tiến hành phân lập được 67 biến chủng

Micromonospora từ cơ chất bùn đất Australia 60 biến chủng đã được định tên là Micromonospora chaỉcea 7 biến chủng khác được quy vào 3 nòi:

- Micromonospora parva có những đặc điểm: Phát triển chậm và ít hình

thành bào tử, khuẩn ty cơ chất có màu từ hồng tới cam, không thuỷ phân

sacarose

- Micromonospora fusca có đặc điểm: Sợi sinh dưỡng phát triển chuyển

nhanh từ màu cam sang màu nâu tối, và cuối cùng là màu sẫm đen Một đặc điểm

có ý nghĩa của nòi này là sản xuất ra một sắc tố hoà tan màu nâu tối tới màu đen trên nền thạch

Chỉ có 2 trong số 67 biến chủng phân lập được sản xuất ra sắc tố hoà tan Các

biến chủng được gọi tên là Micromonospora fusca đã hiện có trong trung tâm giữ

giống CBS và NRRL và được coi là nằm trong mô tả nguyên gốc của Jensen

- Micromonospora coeruỉea có đặc điểm: Khuẩn lạc phát triển chậm, sản xuất

khuẩn ty cơ chất dày đặc, có màu xanh hơi lục Sau 25 ngày thì chuyển sang màu gần tối Sự hình thành bào tử rất ít và đôi lúc trên bề mặt khuẩn lạc có màu xám nhạt giống với màu khuẩn ty khí sinh nhưng không có bào tử Không thuỷ phân đường sacarose và không phát triển trên lát khoai tây Có 2 trong số 67 chủng

trên đã được định tên theo nòi này

Luedemann đã quan sát thấy 2 chủng Micromonospora phân lập từ đất, khuẩn

ty cơ chất cũng có màu xanh hơi lục Ông cho rằng màu này rất hiếm gặp và cho

rằng nó tương tự như Micromonospora coerulea đã được Jensen phân lập Những

chủng này lại phát triển trên lát khoai tây và thuỷ phân đường sacarose Ông cho

rằng nó có thể là một nòi phụ của Micromonospora coerulea Đôi khi màu sắc

được sử dụng như là một đặc trưng ban đầu, nhưng trong trường hợp đặc biệt này dường như nó không đủ để định loại Rất nhiều màu sắc mà một số nòi

Micromonospora đã đạt được nhưng không có một màu nào là xanh hơi lục

tương tự Micromonospora coerulea.

Những tiêu chuẩn của Jensen trong việc định loài không được Kriss ( 1939 ) xem xét đánh giá cao nhưng Luedemann tin rằng những đặc điểm mô tả về

Micromonospora fusca, Micromonospora coerulea đã đủ giá trị để có thể định

loài Nhưng thật không may mắn là Micromonospora parva đã không được tìm

thấy ở các phân lập trên ngoài sự phát triển nghèo nàn, ít hình thành bào tử, và không có một đặc trưng nào khác thường, đặc biệt đối với những biến chủng này

1.6.2- Một số Micromonospora đã được định tên.

• Micromonospora purpurea{ Luedemann, Brodsky 1964)

Cấu trúc giống như bào tử hay chuỗi bào tử hiếm khi nhìn thấy Sự hình thành bào tử không điển hình hay phát triển không đầy đủ Bào tử vách dầy ở tận

cùng và ờ giữa sợi thường hiện diện Khuẩn lạc phát triển nhô lên, có nếp gấp, có

màu tía đặc trưng hay màu hạt dẻ khi già đi Nhưng cũng có thể gặp một chút màu vàng cam và vàng cam tối Khuẩn lạc khô hoặc sáp, hiếm khi ướt, không bao giờ nhày nhớt Chủng này phát triển trên nền thạch Czapek có sacarose, không phát triển trên lát khoai tây vô trùng, nhưng lại phát triển tốt nếu cho thêm CaC03 vào Kiểu tiêu thụ carbonhydrat điển hình: Phát triển chậm trên

ơ- melibiose, D-mannitose, L-rhamnose Phát triển từ khá đến tốt trên D-ribose Chủng này phát triển mạnh trên L-arabinose, D(+)-cellobiose, D-glucose, D(+)- mannose, sacarose, ơ,ơ-trehalose, D-xylose và tinh bột tan Phát triển từ kém đến khá trên D-galactose, D-fructose, ß-lactose Phát triển kém trên dulcitol, glycerol, inositol, raffinose, salicin, D-sorbitol, L-sorbose Phát triển cực kém trên cellulose

Khả năng làm chảy gelatin kém, có khả năng tiêu thụ sữa, không sản xuất sắc tố melanoid và giống thế, phát triển tốt ở 27-37°C, không phát triển ở 45°c Sản xuất ra kháng sinh gentamicin

• Micromonospora coerulea{Jensen 1932).

Dạng thuỷ quả phát triển trong môi trường nuôi cấy trên máy lắc được tạo bởi những sợi dài quấn quện lỏng lẻo với nhau, bào tử đơn độc thường dính trên cuống bào tử ngắn hoặc dài ở bên Khuẩn ty có đường kính từ 0,4-0, 6 |im, bào tử hình cầu có đường kính khoảng 0,8-l,5|im, nhẵn, khuẩn ty ít khi phân đoạn trừ khi già Nuôi cấy trên môi trường thạch có glucose, asparagine hay có tinh bột, casein thì phát triển kém Khuẩn lạc có kết cấu hạt, nhỏ và thường bóng, có màu xanh lục hơi tối Không sản xuất sắc tố khuếch tán cũng như khuẩn ty khí sinh, phát triển tốt trên môi trường thạch có 1% cao nấm men, 1% glucose Khuẩn lạc

có màu vàng cam ở ngoại vi, có màu xanh lục tối ở trung tâm Phát triển chậm trên môi trường thạch khác, phải mất 3-5 tuần Ban đầu có màu vàng cam nhạt, sau đó chuyển sang màu xanh vàng, và cuối cùng là màu xanh lục tối Khuẩn ty

có sắc tố màu xanh hơi lục, có khả năng hoà tan trong nước và là một chỉ thị màu, có màu xanh lục trong miền kiềm, có màu xanh xám kết tủa ở miền acid

Phát triển tốt trên D-galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannitose,

ơ-melibiose, raffinose, sacarose và D-xylose Phát triển khá trên li-lactose Phát triển kém trên L-arabinose, D-arabinose, dulcitol, glycerol, ỉ-inositol, melibiose, D-ribose và L-rhamnose Thuỷ phân tinh bột, và trên cellulose có thể bị mục rữa chậm

Khả năng chịu muối là 1,5% Phát triển tốt trên lát khoai tây mà không cần

bổ sung CaC03 Thuỷ phân gelatin và sữa kém, không có khả năng khử nitrat

Phát triển tốt ở 24-37°C, không phát triển ở 45°c.

PHẦN 2- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1- Nguyên vật liêu và phương pháp thực nghiệm

2.1.1 - Nguyên vật liệu

• Giống xạ khuẩn:

Chủng giống xạ khuẩn Micrmonospora 16119 cố khả năng sinh tổng hợp

kháng sinh cao được phân lập từ bùn đất Việt Nam đã qua tuyển chọn

do phòng Thực tập kỹ thuật Vi Sinh - Kháng Sinh bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

• Chủng vi sinh vật kiểm định:

Mười chủng vi sinh vật thuần chủng được dùng làm vi sinh vật kiểm định

Escherichia colỉ (EC) ATCC 25922

Pseudomonas aeruginosa ịPseu) VM 201

Proteus mirabilis (Pro) BV 108

Shỉgella ỷlexneri ịshi) DT112

Salmonella typhi (Typhi) DT220

Bacilỉus cereus (BC) A T c c 9946

Bacillus pumilus (Bp) ATCC10241

Bacillus subtilis (Bs) ATCC10241

Sarcina lutea (SL) ATCC9341

Staphyỉococcus aureus ịsta) ATCC 1228

• Các môi trường nuôi cấy đã sử dụng:

* Môi trường phân lập (MT1): Tinh bột 20,Og; K2HP04 0,50g; NaCl 0,50g; MgS04.7H20 0,50g; KN03 lg; FeS04.7H20 lOmg ; Thạch 18,Og;

Nước vđ 1000,0 ml; pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút.

• MT2: Tinh bột 20,Og; K2HP04 l,0g; NaNOg 2,0g; KC1 0,50g

MgS04.7H20 0,50g; Thạch 18,Og; Nước vđ 1000,0 ml; pH = 7,0 ± 0,2;

Tiệt trùng ở latm trong 30 phút

• MT3: Lactose 30,Og; NH4N 03 2,0g; Cao ngô 5,0g; KH2P04 l,0g;

MgS04.7H20 0,2g; Na2S04 0,5g; CaC03 3,0g; Thạch 18,Og; Nước vđ 1000,0 ml;

pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút

• MT4: Glucose 20,Og; Cao ngô 5,0g; KH2P04 0,5g; MgS04.7H20 0,5g; CaC03 3,0g; NH4NƠ3 2,0g; Thạch 18,Og; Nước vđ 1000,0 ml; pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút

• MT5: Bột ngô 2,0g; Bột đậu tương l,5g; NaCl 0,lg; CaC03 0,2g;

KH2P04 0,lg; CoC12.7H20 0,0002g; Thạch 18,0g; Nước vđ 1000,0 ml;

pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút.

• MT6 : Bột đậu tương l,5g; Tinh bột khoai tây 2,0g; (NH4)2S04 0,2g; Cao nấm men 0,5g; CaC03 0,4g; CoC12.7H20 0,002g; Thạch 18,Og;

Nước vđ 1000,0 ml; pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút

• MT7: Saccarose 3,0g; Bột đậu tương l,0g; (NH4)2S04 0,2g; CaC03 0,2g; NaCl 0,lg; CoC12.7H20 0,0002g; Thạch 18,Og; Nước vđ 1000,0 ml;

pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút

*MT lên men:

• MT1*: Tinh bột 20,Og; K2HP04 0,50g; NaCl 0,50g; MgS04.7H20 0,50g; KNO3 lg; FeS04.7H20 lOmg ; Nước vđ 1000,0 ml; pH = 7,0± 0,2; Tiệt trùng ở

latm trong 30 phút

•MT2*: Tinh bột 20,Og; K2HP04 l,0g;NaNƠ3 2,0g; KC1 0,50g;

MgS04.7H20 0,50g; Nước vđ 1000,0 ml; pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm

trong 30 phút.

• MT5*: Bột ngô 2,0g; Bột đậu tương l,5g; NaCl 0,lg; CaC03 0,2g;

KH2P04 0,lg; CoC12.7H20 0,0002g; Nước vđ 1000,0 ml; pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút

*MT thạch thường: dùng để nuôi cấy giống vi sinh vật kiểm định

Pepton 5,0g; NaCl 5,0g; Cao thịt 3,0g; Thạch 18g; Nước vđ 1000,0 ml;

pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút

*Môi trường canh thang : dùng để nuôi cấy giống vi sinh vật kiểm định Pepton 5,0g; NaCl 5,0g; Cao thịt 3,0g; Nước vđ 1000,0 ml; pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút

*MT phân loại:

• MT thử khả năng tiêu thụ nguồn cacbon (MT1 ’): Cao nấm men 0,5%; CaC030,l%; Thạch 1,8%; Carbonhydrat 1%; Nước cất vđ; pH = 7,0 ± 0,2;

Tiệt trùng ở latm trong 30 phút

• MT thử khả năng thuỷ phân sữa (MT2’): Cao nấm men 0,5%; Glucose 1%; CaC03 0,2%; Thạch 2%; Sữa 1%; Nước cất vđ; pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở

latm trong 30 phút

• MT quan sát bào tử (MT3’):

- Môi trường A (MT3’A): Cao nấm men 0,1%; Tinh bột 0,1%; Glucose 0,1%; CaC03 0,1%; Thạch 1,8%; Nước cất vđ; pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút

- Môi trường B (MT3’B): Cao nấm men 1%; Tinh bột 2%; Thạch 1,8%;

Nước cất vđ; pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút.

- Môi trường c (MT3’C): Cao nấm men 0,5%; Glucose 1%; CaC030,l%; Thạch 1,8%; Nước cất vđ; pH = 7,0 ±0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút.

- Môi trường D (MT3’D): Cao nấm men 0,1%; Glucose 1%; CaC030,l%; Thạch 1,8%; Nước cất vđ; pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt trùng ở latm trong 30 phút.

• MT thử khả năng chịu NaCl (MT4’): Cao nấm men 1%; Tinh bột 2%;

Thạch 1,8%; NaCl ở các nồng độ khác nhau; Nước cất vđ; pH = 7,0 ± 0,2; Tiệt

trùng ở latm trong 30 phũt

• Các nguồn đường gồm các dung dịch đường 10% của các đường sau:

D - xylose; Rhamnose; Arabinose; D - manitol; Raffinose; Inositol; Saccarose;

Glucose; Lactose; Mannose; Glycerin Tiệt trùng theo phương pháp Tyndal

• Nguồn sữa đã sử dụng: Dung dịch 10% sữa bột nguyên kem.Tiệt trùng

theo phương pháp Tyndal

• Dung môi, hoá chất đã sử dụng

Kính hiển vi quang học A.Kruss optronic Hamburg, Đức

Máy lắc tròn: Taitec Bio - Shaker BR - 300 LF, Nhật

Cân phân tích: Sartorius, Đức.

Máy đo pH: Mettler Toledo MP 220 pH Meter

Tủ cấy vô trùng: Sanyo clean bench, Nhật

• Nguyên liệu dùng cho sắc ký:

Bản mỏng Sillicagel 60F254, Merck

Silicagel (0,05 - 0,2 mm) nhồi cột sắc ký, Nhật

• Tác nhân đột biến:

Dùng ánh sáng tử ngoại (UV) có bước sóng 254nm Nguồn phát là đèn tử

ngoại Toshiba của Nhật

2.1.2- Phương pháp nghiên cứu

• Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng:

- Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng: Cân, pha MT1, chỉnh pH rồi phân

đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5 - 6ml môi trường Đem tiệt trùng ở 120°c

trong 30 phút Lấy ra đặt thạch nghiêng

- Cấy giống: Khi môi trường thạch nghiêng nguội, dùng que cấy vô trùng

cấy zigzăc các bào tử của Micrmonospora 16119 không bị lây nhiễm đã chọn

Cấy trong điều kiện vô trùng Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 30 ± 0,1°C trong 7 -1 4

ngày Ống giống đem cất giữ trong tủ lạnh 2 - 4°c, có thể giữ trong 4 - 6 tháng

hoặc có thể đem ra làm các nghiên cứu tiếp theo

• Phương pháp cải tạo giống bằng ánh sáng tử ngoại (UV):

+ Chuẩn bị: 1 đĩa petri vô trùng, giống Micrmonospora 16119 nuôi cấy

trên thạch nghiêngJ7j 14,ngày tuổi, 1 ống nghiệm chứa lOml nước muối đẳng

trương vô trùng, 9 ống nghiệm chứa 9ml nước muối đẳng trương vô trùng, 9 đĩa

petri chứa MT1 nguội vô trùng

+ Tiến hành

- Pha hỗn dịch bào tử: Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy bào

tử của Micrmonospora 16119 vào ống nghiệm chứa 10ml nước muối đẳng trương

vô trùng đã chuẩn bị, lắc đều ( ta có hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 1 0 ' 1 định

ước ) Hút lml đem làm mẫu chứng Còn 9ml hỗn dịch trên cho vào đĩa petri vô

trùng

- Chiếu ánh sáng UV: Đĩa petri chứa 9ml hỗn dịch bào tử đem chiếu ánh

sáng u v vói thời gian 5 phút và khoảng cách 60cm Sau đó để đĩa petri đã chiếu

ánh sáng u v vào chỗ tối trong 2 - 3 giờ Lấy ra rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 1 0'5

- Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng cấy chính xác 0,lml

hỗn dịch bào tử đã đột biến ở các độ pha loãng 1 0 ' 4 và 1 0 ' 5 lên bề mặt đĩa petri

chứa MT1 đã chuẩn bị trên Dàn đều bằng que trang vô trùng Ở mỗi nồng độ

pha loãng cấy ra 3 đĩa petri

Tiến hành tương tự đối với mẫu chứng ở nồng độ pha loãng 10'6

- Sau 6 ngày ủ ở 30°c, đếm số khuẩn lạc để xác định % độ sống sót % Độ sống sót tính theo công thức

% Đô sống sót = ^ T * 1 0 0 (1)

No

Trong đó: Nm : Số khuẩn lạc trung bình sau đột biến, ^

N0 : SỐ khuẩn lạc trung bình của mẫu chứng Ẳ

• Phương pháp sàng lọc sau đột biến:

Để đột biến thu được kết quả thì chủng giống sau khi đột biến phải được

sàng lọc để lựa chọn biến chủng tốt Các khuẩn lạc sau đột biến khi đã đủ 6 ngày tuổi, được lựa chọn ngẫu nhiên và cấy zigzac lên đĩa petri chứa MT1 vô trùng, rồi đem ủ ở 30 ± 0.1°c trong 6 ngày Sau đó lấy ra thử hoạt lực kháng sinh theo

phương pháp khối thạch Song song làm mẫu chứng.

Để lựa chọn biến chủng sau đột biến ta dựa vào % biến đổi hoạt tính, theo

công thức

%Biến đổi hoạt tính z= ^L* 1 0 0% (2)

D

Trong đó: Dị’ Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i,

D0: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của chủng chứng.

Dựa vào bảng kết quả, ta lựa chọn các biến chủng có % biến đổi hoạt tính cao, đem nuôi cấy và giữ giống hoặc làm các nghiên cứu tiếp theo

• Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:

Hoạt tính kháng sinh được thử theo phương pháp khuyếch tán theo 3 cách khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu đem thử: Giếng thạch, khoanh giấy lọc và khối thạch

+ Nguyên tắc của phương pháp khuyếch tán: Trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định ta đưa mẫu thử vào theo các cách trên Trong thời gian

vi sinh vật kiểm định phát triển, kháng sinh sẽ khuyếch tán trên lớp thạch từ đó gây ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

+ Tiến hành

- Chuẩn bị giống vi sinh vật kiểm định: Vi sinh vật kiểm định được cấy từ ống giữ giống thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 5ml môi trường canh thang

đã tiệt trùng, đem ủ ở 37°c trong 24 giờ

- Cấy vi sinh vật kiểm định vào môi trường thạch thường: Môi trườngthạch thường đã được tiệt trùng, để nguội đến 45 - 50°c, sau đó cấy giống vi sinh vật kiểm định ở trên vào theo tỷ lệ thể tích Vgiống/ Vthạch thirỀmg = 5 / 200ml, lắc đều Phân ra đĩa petri vô trùng cứ 20ml môi trường / 1 đĩa -í) l

- Đưa mẫu thử vào: Mỗi đĩa cho 6 mẫu (có thể cho 7 mẫu trong đó một

mẫu ở giữa):

* Mẫu thử là các khối thạch chứa vi sinh vật sinh kháng sinh: Dùng patuyn

vô trùng chuyển các khối thạch (<t> = 6mm) đặt trực tiếp lên bề mặt môi trường thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định

* Mẫu thử là các khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc khô, đã tiệt trùng và có đường kính khoảng 5 , 8 - 6mm đem tẩm chất cần thử, tẩm 1 - 3 lần, mỗi lần tẩm trong 5 phút sấy nhẹ đến khô (t° < 50°C) Đặt các khoanh giấy đã tẩm chất cần thử lên bề mặt môi trường đã cấy vi sinh vật kiểm định

* Mẫu thử ở dạng dung dịch (dịch lên men, dịch chiết nước ): Dùng bộ

dụng cụ đục giếng thạch (O = 6mm) vô trùng, đục giếng thạch trên đĩa petri đã chuẩn bị Dùng pipet vô trùng nhỏ dịch cần thử vào các giếng vừa đục Mỗi giếng nhỏ 0,05ml dịch cần thử

+ Các đĩa có mẫu thử đem ủ ở 37°c để cho vi sinh vật kiểm định phát triển

Sau 18-24 giờ lấy ra đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước đo panmer có độ chính xác 0,0 2mm

Đánh giá kết quả: Mỗi mẫu thử song song làm trên 3 mẫu Kết quả được

xử lý bằng phương pháp toán thống kê

* Phương pháp lên men:

Trong ngiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp lên men gián đoạn Quá trình tiến hành như sau:

a - Nhân giống: Chủng giống Micrmonospora 16119 trên môi trường thạch

nghiêng đã được 7 -1 4 ngày tuổi, đem cấy vô trùng trong bình nón 500ml chứa lOOml môi trường MT1* vô trùng, bằng lOml nước vô trùng Lắc trên máy lắc tròn với vận tốc 179 - 181 vòng / phút ở nhiệt độ 30 ± 0,1°C trong 48 giờ

V' b - Len men: Giống sau khi đủ thời gian cấy chuyển sang bình nón 500ml chứa lOOml môi trường lên men tối ưu (MT5*) với tỷ lệ Vgiống / v lên men = 1/10 ml,

rồi lại tiếp tục lắc lên men sinh tổng hợp kháng sinh trong thời gian 1 2 0 giờ ở nhiệt độ 30 ± 0,1°C.

• Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ:

Sau khi kết thúc lên men, dịch lọc được đem lọc loại sinh khối Dịch lọc chỉnh về pH phù hợp rồi chiết bằng dung môi hữu cơ thích hợp với tỷ lệ thể tích

v dung môI / v dịch lọc = 1/4 lắc 3 lần mỗi lần 1 phút, để yên cho phân lớp rồi gạn lấy dung môi hữu cơ

Hiệu quả của quá trình chiết được kiểm tra bằng cách thử hoạt tính kháng sinh ở pha nước và pha hữu cơ bằng phương pháp khoanh giấy

Dung môi chạy sắc ký là những dung môi tinh khiết, pha đúng tỷ lệ với độ dày dung môi không quá lcm

Đặt bản mỏng đã chấm chất thử vào bình chạy có hệ dung môi đã bão hoà

ở trên sắc ký Tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng, cho chạy đến khi vết dung môi cách mép trên của bản mỏng khoảng lcm thì lấy ra Đánh dấu vết dung môi chạy, sấy nhẹ đến khô rồi đem xác định vết

- Xác định vết bằng đèn tử ngoại: Đặt bản mỏng đã chạy sắc ký dưới đèn

tử ngoại có X = 254nm, vết chất thử có màu hồng tím trên nền huỳnh quang sáng.

- Xác định bằng phương pháp hiện hình vi sinh vật: Bản mỏng sau khi đã chạy sắc ký và xác định vết chất bằng đèn tử ngoại cho vào đĩa petri vô trùng, đổ