Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng micronospora 16119

Bộ y tế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI VŨ THỊ HƯƠNG GIANG GÓP PHẦN NGHIÊN cứu KHÁNG SINH TỪ CHỦNG MICROMONOSPORA 16119 ( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHOÁ 1999-2004) Người hướng dẫn: TS. CAO VĂN THU Nơi thực hiện: Bộ môn công nghiệp dược Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: 1/3 - 20/5/2004 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tớ i: Thầy giáo TS . Cao Văn Thu Người tận tình bảo, giúp đỡ hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Đồng thời xin bày tỏ lời cảm ơn tới tất thầy cô môn Công Nghiệp Dược môn khác, kỹ thuật viên trường Đại Học Dược Hà Nội giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập. Xin cảm ơn tất bạn bè gia đình tôi, người giúp đỡ động viên thời gian qua. Hà Nội, ngày 20 tháng năm2004 Sinh viên: Vũ Thị Hương Giang MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề . Phần 1- Tổng quan .2 1.1- Đại cương Micromonospora 1.1.1- Đặc điểm chi Micromonospora . 1.1.2- Một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá Micromonospora 1.1.3- Sự tạo thành kháng sinh Micromonospora 1.2- Đột biến cải tạo giống 1.2.1- Đột biến ngẫu nhiên 1.2.2- Đột biến nhân tạo .4 1.2.3- Tối ưu hoá đột biến tuyển chọn sau đột biến 1.3- Lên men sinh tổng hợp kháng sinh .5 1.3.1- Lên men bề măt . 1.3.2- Lên men chìm 1.4- Chiết tách tinh chế 1.4.1- Chiết xuất kháng sinh dung môi hữu 1.4.2- Sắc ký 1.5- Phân loại bước đầu .9 1.6- Một số nghiên cứu phân loại Micromonospora .10 Phần 2- Thực nghiệm kết qủa .13 2.1- Nguyên vật liệu phương pháp thực nghiệm 13 2.1.1- Nguyên vật liệu 13 2.1.2- Phương pháp nghiên cứu 17 2.2- Kết bàn luận 24 2.2.1- Chọn biến chủng để nghiên cứu 24 2.2.2- Kết thử khả STH kháng sinh chủng MT nuôi cấy khác 25 2.2.3- Kết cải tạo, chọn giống v s v 26 2.2.4- Kết lên men STH kháng sinh 31 2.2.5- Kết chiết xuất, tinh chế . 34 2.2.6- Kết thử nghiệm phân loại . 40 Phần 3- Kết luận đề xuất 43 3.1- Kết luận 43 3.2- Đề xuất .43 Phụ lục. Tài liệu tham khảo. CHÚ G IẢ I CHỮ V IẾ T TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic BC : Bacillus cereus Bp : Bacillus pumilis Bs : Bacillus subtilỉs EC : Escherichia coli Pro : Proteus mirabilis Pseu : Pseudomonas aeruginosa Shi : Shigella flexneri SL : Sarcina lutea Sta : Staphylococcus aureus STH : Sinh tổng hợp Typhi : Samoneỉla typhi Rf : Rectiflexible vsv : Vi sinh vật ĐẶT VẤN ĐỂ Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật, ngày có nhiều chủng kháng sinh sản xuất phương pháp bán tổng hợp hay tổng hợp toàn phần , việc tìm kháng sinh nguyên gốc từ loài v s v nhiều quốc gia giới quan tâm. Penicillin kháng sinh tìm vào năm 1928 nhà bác học Alexander Fleming. Từ đến có khoảng 8000 kháng sinh biết đến nhờ trình STH v s v xạ khuẩn chiếm tỷ lệ cao. Việt Nam có điều kiện khí hậu nhiệt đới điều kiện tốt cho loài v s v phát triển mạnh nên công việc nghiên cứu xạ khuẩn Việt Nam năm gần quy mô bé song khởi sắc. Điển hình việc phân lập đươc số chủng Micromonospora có khả STH kháng sinh hoạt phổ rộng có tính ổn định di truyền tốt. Đây nguồn gen quý giúp cho việc tạo kháng sinh, đem lại nhiều ứng dụng lĩnh vực phòng bệnh, chữa bệnh cho người động vật. Chủng Micromonospora 16119 kết việc phân lập xạ khuẩn từ chất bùn đất Việt Nam. Để góp phần nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hoá, khả STH kháng sinh, từ chủng Micromonospora 16119 lựa chọn đề tà i: “ Góp phần nghiến cứu kháng sinh từ chủng Micromonospora 16119 “ với mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo giống lên men để nâng cao hiệu suất STH kháng sinh. - Nghiên cứu sơ phương pháp chiết tách tinh chế kháng sinh. - Tiến hành nghiên cứu bước đầu phân loại Micromonospora 16119. PHẦN 1- TỔNG QUAN 1.1- Đại cương Mỉcromonospora [7], [13], [14] 1.1.1- Đặc điểm chi Micromonospora. Mỉcromonospora chi thuộc lớp phụ xạ khuẩn Actinomycetes phân bố phổ biến tự nhiên : đất, bùn ao hồ, bùn cát sông, biển.v.v. Chúng không hình thành khuẩn ty khí sinh, tạo khuẩn ty chất với đường kính khuẩn ty khoảng ,6 -0 ,8 )j, m. Khuẩn lạc chúng hình thành sau 5-7 ngày nuôi cấy. Bào tử đơn độc đính cuống bào tử có dạng đơn (monopodial), dạng đôi (dipodial) dạng chùm (sympodial) hệ sợi khuẩn ty chất. Khuẩn lạc màu vàng sáng chuyển dần sang da cam hay đỏ da cam với màu đen, đen sẫm với hình thành bào tử . Bào tử đươc tạo thành nuôi cấy chìm nuôi cấy bề mặt. Bề mặt bào tử xù xì có gai, đường kính khoảng lịam. 1.1.2- Một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá Mỉcromonospora. Nhiệt độ thích hợp cho phát triển chúng từ 20- 40°c, nhiệt độ tối thích 30 ± 2°c. Nhiệt độ 50°c loài Micromonospora không phát triển được, bào tử chúng lại bền với nhiệt. Ở điều kiện 60°c 20 phút, 50% bào tử chúng chịu được. Bào tử phát triển pH = 6,5 - 8,0 dễ mẫn cảm pH < . Là vi khuẩn Gram (+), khả kháng acid kém. Hầu hết loài chi Micromonospora vi sinh vật hiếu khí. Cho đến biết có loài vi sinh vật kị khí là: M.acetoformici M.propionici. Một tính chất dùng để xác định loài chi Micromonospora tạo sắc tố hoà tan có màu sắc khác môi trường nuôi cấy. Ngoài sắc tố chất màu da cam sắc tố hoà tan lại khác nhau: Nâu, hồng, tím, xanh cây, xanh. 1.1.3- Sự tạo thành kháng sinh Micromonospora. Nhiều loài chi Micromonospora có khả tạo kháng sinh số kháng sinh ứng dụng thực tế. Một số nhóm kháng sinh mà chúng tạo ra: Aminoglycosid, macrolid, ansamycin, polipeptid. Theo nghiên cứu nhà khoa học kháng sinh tạo từ Micromonospora có hoạt phổ rộng sử dụng rộng rãi là: * Nhóm aminoglycosid. - Gentamicin tạo chủng M.purpurea M.echinospora (Weinstein cộng sự, 1963). - Sisomicin M.inyoensis ( Weinstein cộng sự, 1970 ). - Neomycin M.sp 69-683 ( Weinstein cộng sự, 1975 ). - Verdamicin M.grísea ( Weinstein cộng sự, 1975 ). - Fortimicin M.olivoasterospora ( Naro cộng sự, 1977 - Sagamicin M.sagamiensỉs ATc c 21083. ). * Nhóm macrolid. - Rosamicin M.rosaría ( Wagman cộng sự, 1972 ). - Megalomicin M.megalonicea ( Weinstein cộng sự,1969 ). - Erythromycin M.sp 1225 ( Marquez, 1976 ). * Nhóm polipeptid. - Chalcidin M.chalcea H 85 ( Gauze cộng sự, 1970 ). * Kháng sinh chống nấm tế bào u. - Pyrolosporin A Micr.sp. ATTC 53803 ( Mair M.G Mishrask ). * Một số kháng sinh khác như: Eveminomicin M. carbonacea. 1.2- Đột biến cải tạo giống [2], [4], [8] Dạng đột biến quan trọng cải tạo giống v s v biến đổi trình tự xếp base ADN hay thêm bớt cặp base ADN. Sự sinh đột biến gọi phát sinh đột biến. Các yếu tố gây đột biến gọi tác nhân đột biến . Tuỳ theo nguyên nhân phát sinh đột biến mà người ta chia đột biến làm lo ại: 1.2.1- Đột biến ngẫu nhiên. Là thể đột biến phát sinh mà can thiêp tác nịiânđột biến. Các v s v bị biến dị tự nhiên theo tần suất khác nhau. Ta cần chọn lấy cá thể có hoạt tính cao để nghiên cứu tiếp. Trên thực tế, phương pháp chon loc ngẫu nhiên cá thể có hoạt tính cao dùng để nghiên cứu ban đầu. Để thu chủng có khả siêu tổng hợp kháng sinh cần phải áp dụng phương pháp đột biến nhân tạo để tuyển chọn giống. 1.2.2 - Đột biến nhân tạo. Là thể đột biến tạo tác nhân với mục đích nâng cao tần suất xuất đột biến từ 10 - 100.000 lần. Các tác nhân đột biến thường sử dụng là: - Tác nhân vật lý: Tia X(Rơngen), tia cực tím có X = 250 - 280nm tia có tác dụng gây chết mạnh gây đột biến với chủng vi sinh vật. Ngoài dùng tia gama, neutron làm tác nhân gây đột biến. - Tác nhân hoá học: Methyl-bis-(P -clor-diethyl)-amin, triethyllen melanin, dimethylsulíat, NG(N-methyl-N’-nitro-N-nitroso-guanidin), HN02. - Tác nhân sinh học: Đột biến tượng thiếu base nitơ hay tảcỊỊ động gen gây đột biến. 1.2.3- Tối ưu hoá đột biến tuyển chọn sau đột biến. Ngoài tác dụng gây đột biến tác nhân gây đột biến thay đổi tính trạng vi sinh vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: pH môi trường, hệ đệm, nồng độ hay cường độ tác nhân gây đột biến, thời gian xử lý trạng thái phát triển vi sinh vật. Do cần phải tối ưu hoá yếu tố để thu kết mong muốn. Phương pháp hữu hiệu để đánh giá lập đường cong biểu diễn tác động kết hợp yếu tố với tần xuất gây đột biến. Thông thường xử lý đột biến số lượng vi sinh vật sống sót thấp (0 . - %) ta phải tìm, lựa chọn số ỏi vi sinh vật sống biến chủng dương so với chủng ban đầu. Để chọn lựa ta đem khảo sát khả tạo sản phẩm mục tiêu (khả sinh tổng hợp kháng sinh), song song làm mẫu đối chứng để thấy rõ tác dụng tác nhân gây đột biến. Phương pháp đòi hỏi nhiều công sức thời gian đa số trường hợp lại đường mang lại kết quả. 1.3- Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [5], [8 ], [10], [13] Hiện Cloramphenicol có cấu trúc đơn giản tổng hợp hoá học hoàn toàn, lại hầu hết sản phẩm kháng sinh có có nguồn gốc lên men chủng vi sinh vật tạo kháng sinh. Tuy nhiên điều kiện lên men( pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, thành phần môi trường) chủng khác khác nhau, việc nghiên cứu điều kiện lên men cần thiết. Có hai kiểu lên men hay sử dụng: Lên men chìm lên men bề mặt. 1.3.1- Lên men bề măt. Đây qúa trình nuôi cấy phát triển vi sinh vật bề mặt môi trường lên men. Môi trường lên men rắn hay lỏng. - Chủng sau sàng lọc ngẫu nhiên: 16119-6, 16119-12. - Chủng sau đột biến: 16119-1-11, 16119-1-16, 16119-1-18. Kết giới thiệu bảng . Bảng : Kết thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men số biến chủng sau sàng lọc ngẫu nhiên, sau đột biến. (D đường kính vòng vô khuẩn trung bình, s độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh) Kết B.pumilis E.coli D(mm) s Dịmm) s 11,35 0,65 13,01 0,50 11,70 1,21 12,07 1,50 10,50 1,04 11,10 1,34 16119-1-16 ^ 11,48 1,16 14,09 0,26 16119-1-18 17,25 1,12 20,14 0,51 Biến chủng 16119-6 16119-1-11^16119-12 Nhận xét: - Khả STH kháng sinh biến chủng 16119-1-18 tốt lên men chìm. - Quyết định chọn biến chủng 16119-1-18 dùng để lên men chìm cho nghiên cứu tiếp theo. • Kết thử độ ổn định dịch lên men bảo quản pH khác nhau. Dịch lên men cất giữ pH khác nhau, sau đem thử hoạt tính kháng sinh phương pháp giếng thạch, v s v kiểm định E.coli. Kết 33 giới thiệu bảng 7. Bảng 7: Kết thử độ ổn định dịch lên men pH. ( D đường kính vòng vô khuẩn trung bình, s độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh ) PH 11 D(mm) 9,17 10,80 12,1 14,57 12,07 s 0,42 0,36 0,4 0,4 0,6 Kết Nhận xét: - Dịch lên men cho hoạt tính tất pH. - Ở pH9 dịch lên men cho hoạt tính cao nhất. - Dịch lên men bền pH kiềm pH acid, pH kiềm hoạt tính dịch lên men ổn định hơn. - Chọn pH9 để bảo quản dịch lên men. 2.2.5- Kết chiết xuất, tinh chế. • Kết chiết kháng sinh từ dịch lên men sang dung môi hữu cơ. Bốn dung môi sử dụng để chiết xuất nghiên cứu là: Butylacetat, butanol, cloroíorm, diclorometan. Việc chiết pH phụ thuộc vào phân bố kháng sinh dung môi. Kết đánh giá đường kính vòng vô khuẩn pha theo phương pháp khoanh giấy lọc với v s v kiểm định E.coli. Kết giới thiệu bảng , 9, 10, 11. 34 Bảng 8: Kết chiết xuất kháng sinh lần Butanol. ( D đường kính vòng vô khuẩn trung bình, \ Kết s độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh) Pha nước Pha Butanol Dịmm) s D(mm) s 10,73 0,11 6,90 0,08 12,92 0,11 13,48 0,11 11,79 0,12 11 12,09 0,17 Nv pH Bảng9: Kết chiết xuất kháng sinh lần Butylacetat. ( D đường kính vòng vô khuẩn trung bình, s độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh) x\ K ế t p Pha nước Pha Butylacetat s D(mm) s 15,07 0,67 13,25 0,61 13,43 1,50 13,20 0,92 8,00 1,73 H \ Dịmm) 35 13,74 11 1,55 0,58 7,67 BảnglO: Kết chiết xuất kháng sinh lần Cloroíbrm. ( D đường kính vòng vô khuẩn trung bình, s độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh ) ph Pha nước Pha Cloroíòrm \ Dịmm) s D(mm) s 17,78 0,08 8,44 0,13 17,36 0,15 13,20 0,04 17,45 0,14 12,07 0,05 17,00 0,10 12,00 0,02 11 16,32 0,01 11,99 0,08 B ảngll: Kết chiết xuất kháng sinh lần Diclorometan. ( D đường kính vòng vô khuẩn trung bình, s độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh) ^ \Ị £ ế t Pha nước Pha Cloroform Dịmm) s Dịmm) s 21,00 0,50 14,05 0,60 18,61 1,20 15,26 0,80 19,04 0,88 14,90 0,95 18,30 1,50 15,61 2,37 11 17,19 1,38 14,34 0,35 Nhận xét: - Cả bốn dung môi chiết kháng sinh từ dịch lên men. - Butanol chiết kiệt hoàn toàn kháng sinh từ dịch lên men (trừ pH3). 36 - Butylacetat chiết hoàn toàn kháng sinh pH3, pH5, pH7. - Cloroíòrm Diclorometan không chiết kiệt kháng sinh từ dịch lên men theo phương pháp chiết lần kết khả quan. Có thể kết tốt chiết nhiều lần ( Cloroform chiết tốt pH3). • Kết thử độ ổn định kháng sinh sau bảo quản dung môi chiết khác nhau. Kháng sinh sau chiết bảo qùản tủ lạnh thời gian đem thử hoạt lực kháng sinh phương pháp khoanh giấy lọc, v s v kiểm định E.coli. Kết giới thiệu bảng 11. Bảng 12: Kết thử hoạt lực kháng sinh sau bảo quản dung môi chiết khác nhau. ( D đường kính vòng vô khuẩn trung bình, s độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh ) E.colỉ Kết Dung Dịmm) Cloroform 16,73 0,90 Diclorometan 14,63 0,85 Butanol 14,59 0,78 Butylacetat 10,71 0,58 Nhận xét: - Kháng sinh bảo quản dung môi Cloroíorm có hoạt lực cao nhất. - Do nhiệt độ sôi Butanol (1 -1 18°C), Butylacetat (1 17°c - 118°C) tương đối cao. Và cao nhiều so với nhiệt độ sôi Cloroform (60°c 62°C).VÌ quy mô phòng thí nghiệm định chọn Cloroíorm làm dung môi chiết kháng sinh pH3 cho nghiên cứu tiếp theo. 37 • Kết sắc ký lớp mỏng: Dịch chiết kháng sinh thu từ dịch lên men phương pháp chiết nhiều lần với Cloroform dùng để chấm cho sắc ký lớp mỏng 24 hệ dung môi khác nhau, vết kháng sinh sau sắc ký phát kiểm định v s v ( dùng E.coli) Từ lựa chọn hệ dung môi tách tốt nhất: - Hệ 1: Diclorometan : Aceton (3: 1) cho vết kháng sinh với vết to có Rfj = 0,14, vết nhỏ có Rf2 = 0,4. - Hệ 2: Cloroform : Metanol: NH4 OH 25% ( : : 0,05) cho vết kháng sinh, vết nhỏ có Rfj= 0,32, vết to có Rf2 = 0,59. Nhận xét: qua kết sắc ký lớp mỏng nhận thấy thành phần dịch chiết có thành phần kháng sinh khác hoạt tính không giống nhau. • Kết sắc ký cột. Dựa vào kết sắc ký lớp mỏng tiến hành sắc ký cột với hệl làm dung môi chạy. Kết giới thiệu hình 2: 38 20 19 18 17 16 15 • 14 • 13 • 12 • 11 • 10 • • • • • • • • • • • Phân đoạn KSi KS2 Rf 0,98 0,6 Hình 2: Kết chạy sắc ký cột. 39 Nhận xét: Kết chạy sắc ký cột cho thấy có phân đoạn 4, phân đoạn có hai vết thử sắc ký lớp mỏng. Các phân đoạn khác có vết kháng sinh. Tổng kết kết chiết xuất sắc ký trên, sơ đề xuất quy trình chiết xuất tinh chế theo sơ đồ hình 3: Hình 3: Sơ đồ chiết xuất tinh chế kháng sinh từ Micromonosporalól 19. 2.2.6 - Kết thử nghiệm phân loại. Sau trình làm việc với nỗ lực cố gắng, thu số kết ban đầu phục vụ cho công việc phân loại chủng Micromonospora 16119. Kết giới thiệu bảng 13. 40 Bảng 13: Màu sắc khuẩn ty Vàng da cam Màu sắc khuẩn lạc Vàng cam đến đen SỐ lượng bào tử chuỗi Bề mặt bào tử Khử nitrat Sự thuỷ phân sữa — + Sự thuỷ phân tinh bột Thử khả chịu NaCl 0,75% + Glucose Saccarose — Manose ± Arabinose + Xylose + Inositose + Rhamnose + Raffinose + Latose + Glycerin — Nhận xét: Như trình bày trên, việc nghiên cứu phân loại Micromonospra khó khăn phức tạp. Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu công bố phân loại Micromonospora. Việc phân loại Micromonospora phải vào nhiều tiêu chí khác : Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá .v .v. Việc tìm tài liệu đánh giá phân 41 loại Micromonospora khó khăn để tìm tài liệu hướng dẫn cách làm cho trình phân loại khó khăn nhiều. Sự không thống nghiên cứu trở ngại lớn cho trình nghiên cứu phân loại chúng tôi. Với trình nghiên cứu làm việc nỗ lực, hoàn thành số tiêu chí để đánh giá phân loại Micromonospora. Tuy chưa đủ để đến phân loại với hy vọng đóng góp phần cho nghiên cứu tiếp theo. 42 PHẦN 3- KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 3.1- Kết luận: Sau thời gian tiến hành làm thực nghiệm hoàn thành mục tiêu đề thu kết sau: * Kháng sinh chủng Micromonospora 16119 STH trình nuôi cấy có tác dụng tốt vi khuẩn Gram(+) Gram(-) * Chủng Micromonospora 16119 STH kháng sinh tốt nuôi cấy MT1 lên men MT5*. * Qua trình cải tạo chọn giống v s v thu biến chủng có khả STH kháng sinh tốt so với chủng gốc biến chủng 161191-4,16119-1-11,16119-1-14,16119-1-16,16119-1-18. * pH9 pH tối ưu cho trình lưu giữ kháng sinh chủng Micromonospora 16119 tạo ra. * Chọn Cloroíorm dung môi chiết thích hợp quy mô phòng thí nghiệm pH3 pH chiết tối ưu. * Dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng lựa chọn hệ dung môi thấy kết sắc ký cho hai vết có hoạt tính kháng sinh. * Tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi HI tách riêng hai kháng sinh ( nhiên vùng xen phủ). * Đã tiến hành nghiên cứu bước đầu phân loại chủng Micromonospora 16119 3.2- Đề xuất: Qua trình nghiên cứu nhận thấy kháng sinh chủng Micromonospora 16119 STH có hoạt tính mạnh bền.Do có số 43 đề xuất sau: * Cần tiếp tục nghiên cứu sâu chủng Micromonospora 16119 đặc biệt trình chiết xuất tinh ch ế. * Tiến hành cải tạo giống để thu chủng có khả STH kháng sinh ngày tốt hơn. * Lên men quy mô lớn sau chiết xuất tinh chế nhằm thu lượng kháng sinh đủ để tiến hành xác định cấu trúc, tính chất lý, hoá tiến hành thử tiền lâm sàng điều kiện cho phép. * Tiếp tục nghiên cứu đề định tên cho chủng Micromonospora 16119. 44 TÀ I LIỆU THAM KHAO 1. Nguyễn Lân Dũng, Phan Thị Trân Châu .(1978), Một số phương pháp nghiên cứu vỉ sinh vật học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tập 3. 2. Kiều Khắc Đôn (1999), Giáo trình vi sinh học. Trường Đại học Dược Hà Nội. 3. Phạm Gia Huệ (1998), Giáo trình hoá phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội. 4. Nguyễn Thị Huệ (2002), Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 318 , Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Hà Nội. 5. Từ Minh Koóng (2001), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Trường Đại học Dược Hà Nội, tập . . Chu Thị Lộc (1996), Giáo trình kiểm nghiệm thuốc phương pháp sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 7. Nguyễn Tiên Phong (2000), Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Micromonospora N° 9, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Hà Nội. 8. Cao Văn Thu (1998), Bài giảng kháng sinh vitamin, Hà Nội. 9. Cao Văn Thu, Chu Thị Lộc, Lương Quốc Tuấn (1993), “Góp phần nghiên cứu số loài Micromonospora sinh tổng hợp kháng sinh từ bùn, bùn cát Việt Nam”, Tạp chí Dược học, Số 5, trang 3-6. 10. Trần Thị Thanh (2000), Công nghệ vi sinh, Nhà xuất giáo dục. 11. p. Simon , R. Meunier (1981), c ông nghệ vi sinh kỹ thuật hoá sinh học, Nhà xuất Y học, tập 1. 12. R. E. Buchanan (chairman) (1977), Bergey’s Manual of Deteminative Bacteriology, USA, page 846-881. 13. Luedeman. G. M (1971), International Journal of systematic bacteriology, USA, Vol 21, page 240-247. 14. Selman A. Waksman, (1959), The Actinomycetes, London, Vol 1, page 198-206 and 225-242. PH Ụ LỤC w / Maí jẾ m \ i \ J " \ WM*- N-, \ lU M. Hình Pl: Thử hoạt lực kháng sinh Micromonospora 16119 MT nuôi cấy phương pháp khối thạch Hình P2: Thử hoạt lực kháng sinh dịch lọc sau lên men phương pháp giếng thạch Hình P3: Thử hoạt tính kháng sinh pha dung môi sau chiết dịch lên men CIoroform theo phương pháp khoanh giấy lọc HìnhP4: Phát vết kháng sinh sắc ký lớp mỏng hình vsv [...]... 32 13,51 0,93 15,65 1,08 Nhận xét: - Từ kết quả bảng 3 chúng tôi quyết định giữ lại các biến chủng: 16119- 1, 16119- 4 ,16119- 5 ,16119- 6 ,16119- 12 và 16119- 17 - Biến chủng 16119- 1 cho hoạt lực kháng sinh cao nhất Vì thế nên chúng tôi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trên biến chủng 16119- 1 • Kết quả đột biến bằng ánh sáng UV: Tiến hành đột biến bào tử Micromonospora 16119 bằng ánh sáng u v Sau đột biến... hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh ( tính theo đường kính vòng vô khuẩn trên vi sinh vật kiểm định là E.coỉiị D100%= 15,18) Nhận xét: - Các biến chủng thu được sau đột biến hầu hết tăng khả năng STH kháng sinh so với khi chưa đột biến - Quyết định giữ lại các biến chủng 16119- 1-4 ,16119- 1-U, 16119- 1-14, 16119- 1-1^, 16119- 1-18 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo 2.2.4- Kết quả lên men STH kháng sinh Sau... xét: - Từ kết quả bảng 1, Chúng tôi nhận thấy chủng Micromonosporalól 19 cho kết quả đường kính vòng vô khuẩn lớn với nhiều loại VK kiểm định do đó chúng tôi lựa chọn biến chủng 16119 để nghiên cứu tiếp - Kháng sinh do chủng Micromonospora 16119 sinh ra có tác dụng trên cả VK Gr (+) và Gr (-) 2.2.2- Kết quả thử khả năng STH kháng sinh trên các MT nuôi cấy Sau thời gian nuôi cấy chủng Micromonospora 16119. .. luận 2.2.1- Chọn biến chủng để nghiên cứu Từ 36 chủng phân lập từ bùn đất Việt Nam, tiến hành thử hoạt tính STH 24 kháng sinh theo phương pháp khối thạch chúng tôi chọn được chủng Micromonospora 16119 Kết quả được giới thiệu ở bảng 1 Bảng 1: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của biến chủng (B.c) Micromonospora 16119 D (mm)(đường kính vòng vô khuẩn trung bình) \K q B c \ BC 16119 BP Bs 17,20 14,54 15,88... 12 PHẦN 2- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1- Nguyên vật liêu và phương pháp thực nghiệm 2.1.1 - Nguyên vật liệu • Giống xạ khuẩn: Chủng giống xạ khuẩn Micrmonospora 16119 cố khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao được phân lập từ bùn đất Việt Nam đã qua tuyển chọn do phòng Thực tập kỹ thuật Vi Sinh - Kháng Sinh bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp • Chủng vi sinh vật kiểm định: Mười chủng. .. - Chủng Micromonosporal 6119 STH kháng sinh trên MT6 rất kém - Khả năng STH kháng sinh trên MT1 là tốt nhất Sau đó là MT2, MT5 - Quyết định chọn MT thử nghiệm lên men là MT1*, MT2*, MT5* 2.2.3- Kết quả cải tạo, chọn giống v s v • Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên: Biến chủng Micromonosporalól 19 được chúng tôi tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, để phân lập những biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. .. chiết xuất và tinh chế kháng sinh phù hợp sẽ cho những sản phẩm kháng sinh đạt chất lượng cao, bảo quản được lâu dài Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh thường áp dụng một số phương pháp tinh chế như: lọc, chiết, hấp phụ, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột 1.4.1- Chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dựa vào sự phân bố của chất kháng sinh giữa hai pha không... Trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định ta đưa mẫu thử vào theo các cách trên Trong thời gian vi sinh vật kiểm định phát triển, kháng sinh sẽ khuyếch tán trên lớp thạch từ đó gây ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn + Tiến hành - Chuẩn bị giống vi sinh vật kiểm định: Vi sinh vật kiểm định được cấy từ ống giữ giống thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 5ml môi... Nhiệt độ phát triển - Sự thuỷ phân tinh bột 9 1.6 - một số nghiên cứu về phân loại Micromonospora [12], [13] 1.6.1- Nghiên cứu về phân loại Micromonospora phân lập từ đất của Jensen Vào năm 1932, Jensen đã tiến hành phân lập được 67 biến chủng Micromonospora từ cơ chất bùn đất Australia 60 biến chủng đã được định tên là Micromonospora chaỉcea 7 biến chủng khác được quy vào 3 nòi: - Micromonospora parva... 0 % (2) D Trong đó: Dị’ Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i, D0: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của chủng chứng Dựa vào bảng kết quả, ta lựa chọn các biến chủng có % biến đổi hoạt tính cao, đem nuôi cấy và giữ giống hoặc làm các nghiên cứu tiếp theo • Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh: Hoạt tính kháng sinh được thử theo phương pháp khuyếch tán theo 3 cách khác nhau tuỳ . vật. Chủng Micromonospora 16119 là kết quả của việc phân lập xạ khuẩn từ cơ chất bùn đất ở Việt Nam. Để góp phần nghiên cứu về đặc tính sinh lý, sinh hoá, khả năng STH kháng sinh, từ chủng. Micromonospora 16119 chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “ Góp phần nghiến cứu kháng sinh từ chủng Micromonospora 16119 “ với các mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo giống và lên men để nâng cao hiệu suất STH kháng. Bộ y tế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI VŨ THỊ HƯƠNG GIANG GÓP PHẦN NGHIÊN cứu KHÁNG SINH TỪ CHỦNG MICROMONOSPORA 16119 ( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHOÁ 1999-2004) Người hướng