Sắc ký lớp mỏng: - Chuẩn bị:
Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút.
Dung môi pha đúng tỷ lệ, đổ vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1 cm), để bão hòa trong 30 phút.
Dùng mao quản chấm 3-5 lần dịch chiết DMHC lên bản mỏng, cách mép dưới 1,5 cm, cách 2 mép bên 1 cm. Để khô tự nhiên hoặc sấy ở 500C.
- Khai triển sắc ký: Đặt bản mỏng vào bình sắc ký, khi dung môi chạy đến ¾ bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy.
- Hiện sắc đồ: Sấy khô bản mỏng, sau đó quan sát bằng mắt thường soi đèn UV hoặc hiện hình VSV
Soi đèn UV: Bản mỏng sắc ký tráng sẵn đã trộn với một chất phát huỳnh quang khi chiếu ánh sáng UV. Nên vết chất sẽ tương ứng với vết huỳnh quang sẫm màu.
Hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng, đổ thạch có cấy VSV kiểm định, để ở tủ 370C trong 18-24h. Vết kháng sinh được xác định dựa vào vòng vô khuẩn.
Tính Rf: Rf
dv: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết.
ddm: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến đường dung môi chạy.
Sắc ký cột: - Chuẩn bị:
Mẫu thử: Bột KS thô thu được sau khi cất quay dịch chiết DMHC.
Dung môi: pha theo đúng tỷ lệ.
Chất nhồi cột: Silicagel 60 F 254 Merck cỡ hạt 0,04-0,063 mm. Cân khoảng 8 g hạt, hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút. Hòa thành hỗn dịch với dung môi chạy rồi đưa dần lên cột, ổn định cột trong 30 phút.
Đưa mẫu thử lên cột: Bột kháng sinh thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol, rồi trộn với khoảng 2 g silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 500C cho bay hết methanol thì cho lên cột đã ổn định.
- Chạy cột: Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5 ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch (đã tráng cồn để khô), mỗi phân đoạn 5-10 ml.
- Xác định phân đoạn chính chứa kháng sinh cần tách:
Thử hoạt tính KS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có hoạt tính KS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất. Phân đoạn chính là các phân đoạn có những vết có Rf tương đương và có hoạt tính kháng sinh mạnh.