Góp phần nghiên cứu nâng cao hoạt tính tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 184 21

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUYÊN Mã sinh viên: 1101089 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HOẠT TÍNH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.21 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUYÊN Mã sinh viên: 1101089 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HOẠT TÍNH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.21 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh- Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI- 2016 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy giáo, PGS.TS Cao Văn Thu- người tận tình hướng dẫn em từ ngày nghiên cứu khoa học tới hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy công tác Bộ môn Vi sinh- Sinh học, Bộ môn công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội; Bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa học trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập trường Cuối xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm, động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập thực khóa luận Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận có nhiều thiếu sót Em mong nhận đóng góp ý kiến từ thầy cô bạn bè để khóa luận hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2016 Sinh viên NGUYỄN THỊ DUYÊN MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Phân loại kháng sinh 1.1.3 Ứng dụng kháng sinh 1.2 Đại cương xạ khuẩn (Actinomycetes) 1.2.1 Đặc điểm hình thái kích thước 1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 1.2.3 Phân loại xạ khuẩn 1.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 1.4 Cải tạo, bảo quản giống vi sinh vật 1.4.1 Phương pháp cải tạo giống xạ khuẩn 1.4.2 Bảo quản giống 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Khái niệm lên men 1.5.2 Phương pháp lên men Chiết tách, tinh chế kháng sinh 10 1.6.1 Chiết xuất kháng sinh (chiết lỏng-lỏng) 10 1.6.2 Tách tinh chế kháng sinh 10 1.6 1.7 Sơ nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 12 1.7.1 Phổ hồng ngoại (IR) 12 1.7.2 Phổ tử ngoại (UV) 12 1.7.3 Phổ khối (MS) 12 1.7.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 12 Một số nghiên cứu liên quan 13 1.8 1.8.1 Tìm hiểu gen Streptomyces ambofaciens 13 1.8.2 13-Deoxytetrodecamycin, kháng sinh chống lại 13 Staphylococcus aureus kháng thuốc 1.8.3 Hoạt tính kháng khuẩn sản phẩm chuyển hóa 14 Streptomyces AP-123 hiệu ứng độc tế bào 1.8.4 Actinomycin X2, chất kháng sinh phân lập từ trình lên 14 men sinh tổng hợp Streptomyces micoflavus CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1 Nguyên vật liệu 16 2.1.2 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp thực nghiệm 19 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giống 19 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 19 2.3.3 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 20 2.3.4 Phương pháp chọn chủng có hoạt tính cao chọn lọc ngẫu nhiên 20 2.3.5 Phương pháp đột biến ánh sáng UV 21 2.3.6 Phương pháp đột biến hóa học HNO2 22 2.3.7 Phương pháp lên men chìm máy lắc 23 2.3.8 Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc dung môi hữu 23 2.3.9 Phương pháp xác đinh độ bền nhiệt, độ bền pH kháng sinh 23 2.3.10 Phương pháp tách kháng sinh sắc ký 24 2.3.11 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 25 2.3.12 Phương pháp xác định kháng sinh tinh khiết thu 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 26 3.1 Kết lựa chọn môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 26 3.2 Kết chọn lọc ngẫu nhiên 27 3.3 Kết đột biến cải tạo giống 28 3.3.1 Kết đột biến UV lần 28 3.3.2 Kết đột biến UV lần 29 3.4 Kết lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30 3.4.1 Chọn môi trường lên men tốt 30 3.4.2 Lựa chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt 31 3.4.3 Kết lên men sinh tổng hợp kháng sinh với biến chủng môi 32 trường tốt 3.5 Dung môi pH chiết xuất 32 3.6 Kết sắc ký lớp mỏng 33 3.7 Kết sắc ký cột 34 3.7.1 Chạy cột lần 34 3.7.2 Chạy cột lần 36 3.7.3 Chạy cột lần 37 3.8 Kết đo nhiệt độ nóng chảy biện giải phổ xác định sơ 38 nhóm chức đặc trưng kháng sinh thu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 42 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Acid 2’-deoxyribonucleic B.subtilis Bacillus subtilis CW Cell wall (thành tế bào) D Đường kính trung bình vòng vô khuẩn DAP Diaminopimelat DMHC Dung môi hữu E.coli Escherichia coli G(+) Gram dương G(-) Gram âm IR Infrared (hồng ngoại) ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces Quốc tế) KS Kháng sinh MS Mass Spectrometry (phổ khối) MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể NMR Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) s Sai số thực nghiệm chuẩn hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng UV UtraViolet (tử ngoại) UV-VIS UtraViolet- Visible (tử ngoại- khả kiến) V Thể tích VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học Bảng 2.1 Các chủng VSV kiểm định Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng Kết lựa chọn môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 3.2 Kết chọn lọc ngẫu nhiên Bảng 3.3 Kết đột biến UV lần Bảng 3.4 Kết đột biến UV lần Bảng 3.5 Kết chọn môi trường lên men Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính dịch lên men dạng chủng, biến chủng Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính dịch lên men biến chủng UV2.27 môi trường MT2dt Bảng 3.8 Kết lựa chọn dung môi chiết dịch lọc Bảng 3.9 Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi Bảng 3.10 Kết thử hoạt tính phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần Bảng 3.11 Kết SKLM phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.12 Kết SKLM phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.13 Kết SKLM phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.14 So sánh phổ NMR actinomycin X2 với KS1 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Nội dung Tên hình Hình P1 Dịch lên men thu Hình P2 Kết thử hoạt tính kháng sinh Hình P3 Kháng sinh tinh khiết Hình P4 Phổ UV kháng sinh Streptomyces 184.21 sinh tổng hợp Hình P5 Phổ IR kháng sinh Streptomyces 184.21 sinh tổng hợp Hình P6 Phổ MS kháng sinh Streptomyces 184.21 sinh tổng hợp Hình P7 Hình P8 Phổ NMR 13C + DEPT kháng sinh Streptomyces 184.21 sinh tổng hợp Phổ NMR 1H kháng sinh Streptomyces 184.21 sinh tổng hợp ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1928, khả kháng khuẩn nấm Penicilium notatum Alexander Fleming phát ra, mở đầu cho nghiên cứu sử dụng kháng sinh Ngày kháng sinh sử dụng phổ biến toàn giới Ngoài việc kháng sinh sử dụng cho người kháng sinh sử dụng chăn nuôi, trồng trọt công nghệ thực phẩm Do tình trạng sử dụng kháng sinh tràn lan bừa bãi nay, vấn đề kháng kháng sinh ngày trở nên nghiêm trọng Vi khuẩn không kháng thuốc mà đa kháng kháng đồng thời nhiều loại kháng sinh làm cho việc sử dụng kháng sinh trở thành khó khăn Khi kháng sinh trở nên vô dụng, người có nguy chết vi khuẩn nhiều chết ung thư, bệnh thông thường trở thành kẻ giết người thầm lặng biện pháp kịp thời trận chiến chống lại vi khuẩn kháng thuốc Do mà nhà khoa học ngày đêm tìm kiếm kháng sinh để đưa vào sử dụng, nâng cao hiệu chữa bệnh công khó khăn Để góp phần vào công tìm chất kháng sinh mới, chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu nâng cao hoạt tính tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.21” với mục tiêu:  Cải tạo giống nâng cao khả tổng hợp KS Streptomyces 184.21  Nghiên cứu lên men, chiết xuất tinh chế KS Streptomyces 184.21 tổng hợp  Sơ xác định số tính chất kháng sinh tinh chế PHỤ LỤC Hình P1: Dịch lên men thu đươc Hình P2: Kết thử hoạt tính kháng sinh Hình P3: Kháng sinh tinh khiết Hình P4: Phổ UV kháng sinh Streptomyces 184.21 sinh tổng hợp Hình P5: Phổ IR kháng sinh Streptomyces 184.21 sinh tổng hợp Hình P6: Phổ MS kháng sinh Streptomyces 184.21 sinh tổng hợp Hình P7: Phổ NMR 13C + DEPT kháng sinh Streptomyces 184.21 sinh tổng hợp Hình P8: Phổ NMR 1H kháng sinh Streptomyces 184.21 sinh tổng hợp