Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 155 21

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM HUY BÁCH NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 155.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM HUY BÁCH NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 155.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Cao Văn Thu HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN T i xi g i ời gười ậ h hướ g ẫ i ế hiệ nghiên cứu h T i xi y họ Dư hi h g h ih h h y gi g ướ i ậ v y h y gi h h i ế PGS TS C V Th - t lúc chuân bị ề h ậ vi Vi i h - Si h họ C g ghiệ g gi g T ườ g Đ i H N i; B môn Hóa vật liệu - khoa Hóa, T ườ g Đ i học Khoa học tự nhiên Hà N i, Phòng phân tích phổ - Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học công gi nghệ Việt Nam Nh h y h gi i v y i g hời gi ối g ố hời gi D hời gi y h T i xi hự hiề ậ h hiế h gi y v hiệ ọi iề g h iệ h ậ i i ườ g ời i g i ới gi hự hiệ ghiệ ế H N i i họ ậ g hự g xi g i ời ườ g Đ i họ Dư g hời gi V i ị i hv g vi gi ậ v ghiệ T i g hư iế g hậ h ựg h ậ h y hiệ h h h H N i g y 30 h g 08 Học viên PHẠM HUY BÁCH 2015 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chư g I TỔNG QUAN 11 Đ i g kháng sinh 1 Định ghĩ .2 1.1.2 Phân lo i 113 C hế tác dụng 1.1.4 Ứng dụng c a ch t kháng sinh 12 Đ i g x khuẩn 1.2.1 M t số ặ i m 1.2.2 Các yếu tố h hưở g ến sinh tổng h p kháng sinh .8 Đặ i m x khuẩn chi Streptomyces 1.2.4 Phân lo i chi Streptomyces 10 Đặ i m x khuẩn Streptomyces 155.21 10 1.3 C i t o giống lên men 11 1.3.1 C i t o giống 11 1.3.2 Lên men sinh tổng h p KS 12 1.4 Chiết tách, tinh chế 14 1.4.1 Chiết xu t 14 1.4.2 Tách tinh chế 14 1.5 Nghiên cứu c u trúc KS bằ g hổ 15 1.5.1 Phổ hồng ngo i 15 1.5.2 Phổ t ngo i 15 1.5.3 Phổ c g hưởng t h t nhân 16 1.5.4 Khối phổ .16 1.6 Phân lo i x ịnh tên x khuẩn k thuật gen 17 1.7 M t số nghiên cứu tổng h p kháng sinh t ch ng Streptomyces 19 1.7.1 K thuậ g i h h p toyocamycin t Streptomyces diastatochromogenes 1628 19 1.7.2 Kháng sinh kháng n m dòng Actinomycin-D Streptomyces sp IA1 phân lập t Chư t vùng Saharan 19 g ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 Đối ng nghiên cứu 21 2.1.1 Ch ng x khuẩn nghiên cứu 21 ịnh 21 2.1.2 Vi sinh vật ki 2 M i ường nghiên cứu 21 2 M i ường nuôi c y ch ng x khuẩn nghiên cứu 21 2 M i ường nuôi c y VSV ki ịnh 22 2.2.1 Thuốc th , dung môi, hoá ch t .22 2 Phư Phư g iện máy móc 22 g h ghi ứu 23 Phư g h i Phư g h h gi h 3 Phư g h g ọ Phư g h iế 24 Phư g h men mẻ .25 Phư g h hiế h g i h Phư g h h ậ Phư g h i Phư g h x Chư y v gi giố g 23 h h g i h ằ g hư gẫ hi h g h h ế h 23 24 ị h ọ ằ g g ih 26 h 26 tinh khiết h p ch t phân lậ c .26 ịnh c u trúc hoá học h p ch t 27 g KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Nghiên cứu c i t o giống 29 3.1.1 Kết qu sàng lọc ngẫu nhiên 29 3.1.2 Kết qu t biến l n 30 3.1.3 Kết qu t biến l n 33 3.2 Nghiên cứu chọn ch ng lên men mẻ phù h p 35 3.3 Chiết tách, phân lập kháng sinh sinh tổng h 3.3.1 Kh o sát h hưở g H 3.3.2 Kết qu tách bằ g hư c 37 i ườ g ến trình chiết xu t 37 g h c ký c t 39 3.3.3 Ki 334 S Chư g4 tinh khiết h p ch t phân lậ biện gi i h p ch t phân lậ c 40 c 44 ÀN LUẬN .47 4.1 Nghiên cứu c i t o giống c a ch ng Streptomyces 155.21 47 4.2 Nghiên i ường lên men chìm 48 4.3 Chiết xu t, tinh chế biện gi i phổ kháng sinh phân lậ c 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt AND Acid Deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ATCC American Type Culture Collection (T DM Dung môi Đ Đ iế IR I f e (hồ g g i) ISP International Streptomyces Project (Chư g gi g h hS e gH Kỳ) y e Q ố ế) KS Kháng sinh MT M i ườ g NMR Nuclear magnetic resonance (C SLNN S g ọ SKLM (TLC) S STH Si h ổ g h UV Ultra vio e ( VK Vi h ẩ VSV Vi i h vậ gẫ g hưở g h h ) hi ỏ g (Thin layer chromography) g i) Danh mục bảng, biểu g Bảng 2.1 C i ườ g i yx h ẩ Bảng 2.2 M i ường nuôi c y vi sinh vật ki Bảng 3.1 Kế q sàng ọ ự hi Trang h 21 ịnh 22 g Streptomyces 155.21 29 Bảng 3.2 Kết qu th ho h h g i h t biến l n 31 Bảng 3.3 Kết qu th ho h h g i h t biến l n 33 Bảng 3.4 Kết qu lên men d ng ch ng, biến ch ng tốt nh t Bảng 3.5 Kết qu th h hưở g H ến kh i ường MT2dd g hiết kháng sinh Bảng 3.6 Kết qu biện gi i m t số ỉnh carbon c a khung 2-amino-1,4,6,9- 35 38 46 tetramethyl-3H-phenoxazin-3-one ch t KS2 Bảng 3.7 Nồ g ức chế tối thi u c a Actinomycin X2 m t số vi khuẩn 50 Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình Trang Hình 1.1 M t số c u trúc h g i h hường dùng Hình 3.1 Bi th ho t tính kháng khuẩn c a d ng ch ng chọn 30 th h y ổi ho t tính kháng khuẩn B subtilis 32 lọc ngẫu nhiên Hình 3.2 Bi P mirabilis t biến lẩn th h y ổi ho t tính kháng khuẩn B subtilis Hình 3.3 Bi P mirabilis 34 t biến lẩn Hình 3.4 Hình nh vòng vô khuẩn c a d ng ch ng, biến ch ng B 36 subtilis P mirabilis lên men chìm th ho t tính kháng khuẩn d ng ch ng, biến ch ng Hình 3.5 Bi 37 B subtilis P mirabilis lên men chìm Hình 3.6 Kết qu hiệu su t tách kháng sinh s dụng pH khác với dung 38 môi etyl acetat Hình 3.7 S phân lập kháng sinh sinh tổng h c t Streptomyces 39 155.21 Hình 3.8 S TLC h Hình 3.9 H h h KS2 (q é ỏ g ướ Hình 3.10 S Hình 3.11 S ( ướ ỏ gx ị h g UV 440 nm h h g 443 ) i h hiế hi h h h h c 40 KS1 41 ẫ 42 h ố h ) ậ g HPLC x ị h i h hiế h KS1 ( ướ g h 43 HPLC x ị h i h hiế h KS2 ( ướ g h 43 ) Hình 3.12 S hiệ 442 HPLC ị h h g i h ổ g h hiệ 443 n FR2 ch t kháng sinh phân lậ ) Hình 3.13 H h h hổ UV h A i y i D h KS2 khung 2- 45 amino-1,4,6,9-tetramethyl-3H-phenoxazin-3-one Hình 3.14 C g A i ycin D 46 ĐẶT VẤN ĐỀ ướ Cùng với phát tri n c a xã h i, mô hình bệnh tật c d ng vai trò c h g i h g iều trị g y g y g g c nâng cao Kháng sinh nhóm ho t ch t có tác dụng sinh học r t m h c tổng h p hay bán tổng h p t vi khuẩn, x khuẩn, vi n m t m t số thực vật bậc cao [1], [6] Ngày nay, với phát tri n m nh mẽ c a sinh học hiệ i h tr c a nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm ứng dụ g h g i h nh ng thành tựu rực r C gười không tìm kiếm nh ng ch ng vi sinh vật sinh kháng sinh t tự nhiên mà c i t o chúng nhiề thuật di truyền, công nghệ gen g y [1], [6] Ch ế y hát hiệ hư g h [7] Và số Streptomyces s n xu hư g hỉ có 1-2% tiêu chuẩn ứng dụng y học [1], [6], g kho ng 60% x khuẩn t h yếu chi hi x khuẩn lớn, gồm nhiều vi sinh vật có kh g hư D g g i h h p kháng sinh ch a sinh tổng h p kháng sinh, m t số loài có kh nhiễm trùng khuẩn Gr(-), g c kho ng 17.000 ch t kháng sinh có nguồn gốc h g i h) Đ y hư ị h hướng, chọn dòng gen sinh tổng h p t biế t vi sinh vật kho ng 60.000 ch t kháng sinh bán tổng h (kho ng 600-1200 ch c hi x khuẩ y g ước ta tập trung nghiên cứu Qua nh ng nghiên u cho th y ch ng Streptomyces 155.21 b môn Vi sinh - Sinh học cung c p có ho t tính kháng sinh m nh ổ nhiều tiề g thực tế [2], [9] nên chọ ịnh, phổ r ng có ề tài: "Nghiên cứu sinh tổng h p kháng sinh t Streptomyces 155.21" với mục tiêu: Nghiên cứu c i t o giống he hướ g g i h h p kháng sinh c a ch ng Streptomyces 155.21 Chiết tách, phân lập m t số ho t ch t c a ch ng Streptomyces 155.21 Chƣơng I TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa V i e i (1889) ề cậ kháng gi a sinh vật sống 1942 W ến t ch t kháng sinh - “ i i i ” với ghĩ b o vệ cho b n thân vật ch [8], [33] S ị h ghĩ ch t kháng sinh - “ i i i ” h ng ch m c t o vi sinh vật, chống l i phát tri n tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật 34] Xét mặt t ng “ sống) – ng, bao gồm c thuố l i h ghĩ q g i i i ” ghĩ h g i h( = kháng, bios = g hư E OH c tính chuyên biệt vi sinh vật gây bệ h iv c tính th p mức liều iều trị [14], [34] The ị h ghĩ ới nh t: Kháng sinh h p ch t có nguồn gốc tự nhiên hay tổng h p, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọ g hư) nồ g tế ối với VSV ( g hư th p [6] 1.1.2 Phân loại Có nhiều cách phân lo i KS: hư h dụng, theo c u trúc hóa họ T g h i theo nguồn gố he i theo c u trúc hóa họ hế tác c xem khoa học thông dụng nh t [6] 1.1.2.1 Phân loại theo cấu trúc hóa học - Nh β-Lactam: penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalosporin hệ - Nhóm aminoglycosid: streptomycin, gentamicin, kanamycin, neomycin - Nhóm polypeptid: colistin, bacitracin, polymyxin - Nhóm tetracycline: tetracyclin, oxytetracyclin, chlotetracyclin, - Nhóm phenicol: chloramphenicol, thamphenicol, - Nhóm macrolid: erythromycin, spiramycin, tylosin, kháng sinh g n giống macrolid: lincomycin, virginiamycin - Nhóm sulfamid: sulfaguanidin, sulfacetamid, sulfamethoxazol - Nhóm quinolone: acid nalidixic, flumequin, norfloxacin [6], [14] PHỤ LỤC 2.1: HÌNH ẢNH PHỔ UV CHẤT KS2 PHỤ LỤC 2.2: HÌNH ẢNH PHỔ IR CHẤT KS2 PHỤ LỤC 2.3: HÌNH ẢNH PHỔ MS CHẤT KS2 PHỤ LỤC 2.4: HÌNH ẢNH PHỔ NMR CHẤT KS2 [...]... Một số nghiên cứu mới về tổng hợp kháng sinh từ chủng Streptomyces 1.7.1 Kỹ thuật tăng sinh tổng hợp toyocamycin từ Streptomyces diastatochromogenes 1628 N 2015 Li i Tao và các c ng sự hư g h g hiệu qu sinh tổng h p kháng sinh toyocamycin t Streptomyces diastatochromogenes 1628 – g các ch hiệu qu th p Theo các nghiên cứu, trong S diastatochromogenes 1628 có gen toyG mã hóa sinh tổng h p kháng sinh toyocamycin... TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Chủng xạ khuẩn nghiên cứu Ch ng Streptomyces 155. 21 q phân lập và tuy n chọn có kh g sinh ườ g Đ i học tổng h p KS cao, phổ tác dụng r ng, do b môn Vi sinh - Sinh họ Dư c Hà N i cung c p 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis ATCC 6633 Vi khuẩn Gram (-): Proteus mirabilis BV 108 Các ch ng vi sinh vật ki Dư c Hà... h ậ x ịnh trình tự ge v Streptomyces [27], [36] 1.2.5 Đặc điểm xạ khuẩn Streptomyces 155. 21 X khuẩn Streptomyces 155. 21 ư c B môn Vi sinh – Sinh họ họ Dư c Hà N i phân lập t v T ườ g Đ i ư c b o qu n trong iều kiện thích h N 2010, khi nuôi c y ịnh danh theo khóa phân lo i ISP c a Nonomura [27] C H i h y 9/14 ặ i m c a ch ng x khuẩn Streptomyces 155. 21 giống với ch ng x khuẩn Streptomyces flavescens... so với d ng ch g h h g i h u) Kháng sinh sinh tổng h p t Steptomyces 155. 21 có phổ r ng trên c Gr(+) và Gr(-) g nh nh t là trên ch ng Bacillus pumilus và Proteus mirabilis M i ường lên men bề mặ 10 g g hư dịch th tốt nh t có các thành ph n là tinh b t (nguồn C), NO3- (nguồn N) và các khoáng ch h hư K P Mg S The ết qu phân lậ , kháng sinh sinh tổng h p t Streptomyces 155. 21 có tính acid, bền ở pH 3,... ết qu g i ý cho việc kết h p tái tổ h p gen nhằm nâng cao hiệu su t sinh kháng sinh [23] 1.7.2 Kháng sinh kháng nấm dòng Actinomycin-D do Streptomyces sp IA1 phân lập từ đất vùng Saharan Ch ng x khuẩn Streptomyces IA1 ư c phân lập t m t sa m c Sahara ở In Amenas, Algeria Các nghiên cứu về trình tự 16S rDNA c a dòng này g n giống với Streptomyces mutabilis NBRC 12800 (T) (trùng khớp 99,93%) Dòng IA1... khuẩn Streptomyces flavescens GV1 có tác dụng trong việc b o vệ giố g ư h t khỏi sự xâm h i c a ch ng n m Fusarium oxysporum và Botrytis cinerea ở rễ [21] C g he Kolomiets và c ng sự ư c nghiên cứu cho (1999), ch ng x khuẩn Streptomyces flavescens GV1 tiếp tụ th y thành ph n kháng sinh ch yếu là các polyen như h he [22] T các nghiên cứu trên có th th y ư c tri n vọng lớn khi nghiên cứu ch ng x khuẩn Streptomyces. .. t kháng sinh ở x khuẩn H u hết phát tri n tốt ở 18-32°C, tối thích ở kho ng 22-30°C [6], [14] 8 - H i ường: Sinh tổng h p ch t kháng sinh phụ thu c r t lớn vào pH môi ường pH thích h p cho sinh tổng h h g i h hường là 7,5-8, pH acid hay base ều ức chế quá trình sinh tổng h p [6], [12] - Đ thông khí: X khuẩn là vi khuẩn hiếu khí có nhu c h hưởng quyế yếu tố thông khí có ị h h g h D i h ổng h p ch t kháng. .. Tác nhân sinh họ : t biến do hiệ ư ng thiế e i h y hân ổi gen sinh học biế h Sau khi bị x lý với KS ( t biến, ph n lớn các VSV chết Các cá th sống ổi nhiễm s c th sót sẽ có sự biế g h yee h y ổi các tính tr ng dẫ g h t biến âm tính) hoặ hi Tiến hành sàng lọc ngẫ ến m t (gi m) kh g i h KS ( chọn biến ch ng tốt nh t biế ư g h) nghiên cứu [6], [11] 1.3.2 Lên men sinh tổng hợp KS L e q h ổi ch t sinh họ... vị 30S và phong bế sự kết h p - Kháng sinh chloramphenicol g n với ti vị 50S, ức chế enzym peptidyl - Kháng sinh tetracyclin c a tARN với mARN transferase không cho amino acid g n vào chu i polypeptid - Kháng sinh macrolid (erythromycin, azithromycin ) tranh giành vị trí g n ở ribosome v g n vị trí dịch chuy n các acid amin [4], [6], [14] 1.1.4 Ứng dụng của chất kháng sinh 1.1.4.1 Ứng dụng trong y học... bền ở pH 3, tan tốt trong dung môi h hư MeOH E OA [9] Tiếp tục nghiên cứ 2012 Ph H y h thêm m t số tính ch t c a kháng sinh t Streptomyces 155. 21 hư ch y là 217 ,3°C; phân t ư ng dự kiế hiệ ổ sung nóng 1254 3 vC [2] Theo công bố trong bằng sáng chế số US4340725 c a Fusao Timita và các c ng sự (1984) h ậ ư c ho t ch t DC-38-V có ho t tính kháng khuẩn m nh và diệt g hư H t ch t DC-38-V có m t số ặ tế v ... Một số nghiên cứu tổng hợp kháng sinh từ chủng Streptomyces 1.7.1 Kỹ thuật tăng sinh tổng hợp toyocamycin từ Streptomyces diastatochromogenes 1628 N 2015 Li i Tao c ng hư g h g hiệu qu sinh tổng. .. methanol Kháng sinh – KS3 (5 mg) Hình 3.7 S Kháng sinh – KS1 (10 mg) Kháng sinh – KS2 (21 mg) phân lập kháng sinh sinh tổng h Sau trình phân lậ h c t Streptomyces 155.21 c kho ng 21 mg kháng sinh KS2... NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Chủng xạ khuẩn nghiên cứu Ch ng Streptomyces 155.21 q phân lập n chọn có kh g sinh ườ g Đ i học tổng h p KS cao, phổ tác dụng r ng, b môn Vi sinh - Sinh