Nghiên cứu kháng sinh được tạo ra bởi streptomyces 183 23

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC TẠO RA BỞI STREPTOMYCES 183.23 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC TẠO RA BỞI STREPTOMYCES 183.23 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Th.S Nguyễn Liên Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Khoá luận tốt nghiệp là bước cuối cùng đánh dấu sự trưởng thành của một sinh viên ở giảng đường Đại học, chắp cánh ước mơ cho những đứa con của ngôi trường Dược Hà Nội cổ kính trở thành dược sĩ chân chính đưa đất nước phát triển vững mạnh. Trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp, dưới sự hướng dẫn tận tình của cô giáo ThS. Nguyễn Liên Hương và được phía nhà trường tạo điều kiện thuận lợi, tôi đã có một quá trình nghiên cứu, tìm hiểu và học tập nghiêm túc để hoàn thành đề tài. Kết quả thu được không chỉ do nỗ lực của cá nhân tôi mà còn có sự giúp đỡ của quý thầy cô, gia đình và các bạn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:  Ban giám hiệu nhà trường, Bộ môn Vi sinh – Sinh học đã quan tâm, tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  ThS. Nguyễn Liên Hương: Cô đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này.  Gia đình đã tạo điều kiện học tập tốt nhất, là những người luôn bên cạnh tôi và chia sẻ mỗi lúc tôi gặp khó khăn trong cuộc sống.  Tất cả bạn bè đã giúp đỡ, trao đổi thông tin về đề tài trong quá trình thực hiện khóa luận này. Trong quá trình thực hiện và trình bày khóa luận không thể tránh khỏi những sai sót và hạn chế, do vậy tôi rất mong nhận được sự góp ý, nhận xét phê bình của quý thầy cô và các bạn. Kính chúc quý thầy cô và các bạn sức khỏe! Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014. Sinh viên Trần Thị Thu Thủy ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Lịch sử phát triển của kháng sinh 2 1.1.3. Phân loại kháng sinh 3 1.1.4. Sơ đồ tổng quát quy trình lên men sản xuất kháng sinh 4 1.1.5. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới 4 1.1.6. Ứng dụng của kháng sinh 4 1.2. Đại cương về xạ khuẩn 5 1.2.1. Các đặc điểm chung 5 1.2.2. .Xạ khuẩn và các sản phẩm trao đổi thứ cấp 6 1.3. Phương pháp phân lập xạ khuẩn 6 1.4. Tuyển chọn, cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn 7 1.4.1. Chọn chủng có hoạt tính cao nhờ sàng lọc ngẫu nhiên 7 1.4.2. Đột biến nhân tạo 7 1.4.3. Bảo quản giống xạ khuẩn 8 1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8 1.6. Chiết tách và tinh chế sản phẩm 9 1.6.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 9 1.6.2. Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng[3] 9 1.7. Một số phương pháp phổ để xác định cấu trúc kháng sinh 9 1.7.1. Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS) 9 1.7.2. Phổ hồng ngoại (IR) 10 1.7.3. Khối phổ (MS) 10 1.8. Một số nghiên cứu và báo cáo liên quan tới xạ khuẩn chi Streptomyces 10 1.8.1. Đặc tính của Streptomyces padanus JAU4234 sản xuất kháng sinh actinomycin X 2 , Fungichromin và polyene mới hợp chất nhóm macrolid. 10 1.8.2. Xạ khuẩn biển như một nguồn tài nguyên mới nổi lên cho con đường phát triển thuốc mới. Error! Bookmark not defined. 1.8.3. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 – Streptomyces microflavus Error! Bookmark not defined. 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 13 2.1.1. Nguyên vật liệu 13 2.1.2. Máy móc thiết bị 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1. Phân loại Streptomyces 183.23 theo ISP 17 2.2.2. Chọn lọc, cải tạo giống 17 2.2.3. Lên men, chiết tách kháng sinh 18 2.2.4. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 18 2.3. Phương pháp thực nghiệm 18 2.3.1. Phân loại xạ khuẩn theo ISP 18 2.3.2. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 19 2.3.3. Xác định môi trường và vi khuẩn kiểm định 19 2.3.4. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 20 2.3.5. Sàng lọc ngẫu nhiên 21 2.3.6. Đột biến bằng ánh sáng UV 21 2.3.7. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 22 2.3.8. Xác định ảnh hưởng của pH tới độ bền vững của kháng sinh 23 2.3.9. Thử độ bền với nhiệt của kháng sinh 23 2.3.10. Lựa chọn dung môi hữu cơ, pH thích hợp để chiết kháng sinh 23 2.3.11. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 24 2.3.12. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 24 2.3.13. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 25 2.3.14. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 25 2.3.15. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được 26 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1. Kết quả phân loại theo ISP của xạ khuẩn Streptomyces 27 3.2. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy và vi khuẩn kiểm định thích hợp 27 3.3. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 28 3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 30 3.5. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 30 3.6. Kết quả chọn môi trường lên men chìm 31 3.7. Kết quả chọn chủng lên men 32 3.8. Kết quả ảnh hưởng của pH tới độ bền vững của kháng sinh 33 3.9. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng sinh 34 3.10. Kết quả chọn dung môi và pH thích hợp để chiết kháng sinh 34 3.11. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 36 3.12. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh bằng sắc kí cột 36 3.12.1. Chạy cột sắc ký lần 1 36 3.12.2. Chạy cột sắc ký lần 2 38 3.12.3. Chạy cột sắc ký lần 3 39 3.13. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ATCC American type culture collection (Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ) B. subtilis Bacillus subtilis DM Dung môi DMHC Dung môi hữu cơ ĐB1 Đột biến lần 1 ĐB2 Đột biến lần 2 Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MT2dt Môi trường 2 dịch thể P. mirabilis Proteus mirabilis SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên S.pyridomyceficus Streptomyces pyridomyceficus VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định. Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định. Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn. Bảng 2.4: Các MT ISP phân loại xạ khuẩn. Bảng 2.5: Các dung môi đã sử dụng. Bảng 3.1: Đặc trưng phân loại theo ISP của Streptomyces 183.23. Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS chọn môi trường và VK kiểm định. Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên. Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2. Bảng 3.6: Kết quả chọn môi trường lên men chìm. Bảng 3.7: Kết quả chọn chủng lên men. Bảng 3.8: Kết quả thử pH. Bảng 3.9: Kết quả thử ảnh hưởng của nhiệt độ. Bảng 3.10: Kết quả chọn pH chiết. Bảng 3.11: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký. Bảng 3.12: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1. Bảng 3.13: Kết quả sắc ký lớp mỏng phân đoạn các nhóm 1, 2, 3. Bảng 3.14: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột nhóm 2. Bảng 3.15: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột lần 3. Bảng 3.16: Kết quả IR. Bảng PL1: Kết quả thử HTKS các biến chủng đột biến 1. Bảng PL2: Kết quả thử HTKS các biến chủng đột biến 2. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Hình 3.1: Kết quả chọn chủng lên men chìm tốt nhất. Hình P1: Hình ảnh chuỗi bào tử Streptomyces 183.23. Hình P2: Hình ảnh bề mặt và kích thước bào tử Streptomyces 183.23. Hình P3: Hình ảnh sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 183.23. Hình P4: Hình ảnh thử khoanh giấy lọc khi chiết kháng sinh với DMHC. Hình P5: Hình ảnh ống giống xạ khuẩn. Hình P6: Hình ảnh chạy SKLM kháng sinh thô. Hình P7: Phổ UV –VIS. Hình P8: Phổ hồng ngoại. Hình P9: Phổ khối. Hình P10: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngay từ khi được phát hiện bởi bác sỹ người Anh Alexander Fleming (1928), kháng sinh đã được khẳng định là vũ khí quan trọng để chống lại các vi sinh vật gây bệnh, mở ra một kỉ nguyên mới cho nên y dược học trên toàn thế giới. Hàng triệu người đã được cứu sống khỏi các nhiễm trùng nguy hiểm, đặc biệt trong chiến tranh thế giới thứ 2. Cuộc chiến ấy tưởng rằng con người đã giành được phần ưu, nhưng cùng với việc ra đời hàng loạt các kháng sinh mới đa dạng cả về hoạt chất và nhóm thuốc thì các vi sinh vật gây bệnh cũng không ngừng phát triển khả năng đề kháng lại các chất kháng sinh. Và giờ đây, thế kỉ XXI – thế kỉ của khoa học công nghệ với hàng trăm, hàng nghìn loại kháng sinh đã ra đời nhưng con người vẫn rơi vào tình trạng “thiếu kháng sinh” do khả năng đề kháng của vi khuẩn. Do vậy, cuộc chạy đua tìm kiếm các kháng sinh mới với hoạt lực cao luôn diễn ra, một trong những con đường ấy là sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật trong tự nhiên, và đáng chú ý nhất là các xạ khuẩn với khả năng tổng hợp kháng sinh phong phú (khoảng 60%), đặc biệt hơn nửa trong số ấy do chi Streptomyces sinh ra. Đây là chi xạ khuẩn lớn, không những sinh tổng hợp kháng sinh mà còn có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất mới chống lại các bệnh nan y khác như ung thư…Vì vậy, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu kháng sinh được tạo ra bởi Streptomyces 183.23” làm khóa luận tốt nghiệp với mục tiêu sau: — Nghiên cứu phân loại Streptomyces 183.23 theo ISP. — Phân lập chủng xạ khuẩn Streptomyces 183.23 từ mẫu đất, tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, đột biến cải tạo giống nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. — Nghiên cứu điều kiện lên men, tách chiết, tinh chế kháng sinh từ dịch lên men để thu kháng sinh tinh khiết. — Sơ bộ xác định đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được. [...]... CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh Theo định nghĩa chặt chẽ: kháng sinh là những chất kháng khuẩn được sản xuất bởi các loài vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn) ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác [22] Ngày nay, kháng sinh không chỉ tạo ra bởi các vi sinh vật mà còn được tạo ra bằng quá trình bán tổng hợp hoặc... kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin) - Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol) - Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin) - Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin) - Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin) - Các kháng sinh macrolid (erythromycin, azithromycin) - Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B) - Các kháng sinh. .. ứng dụng cao Trong các hợp chất tự nhiên do VSV sinh ra đã được công bố sử dụng trên toàn thế giới thì 45% được sinh ra từ xạ khuẩn, 38% từ nấm và 17% từ vi khuẩn đơn bào Gần hai phần ba KS đã biết được sinh ra bởi xạ khuẩn chủ yếu từ các loài Streptomyces Các hợp chất kháng sinh khác nhau của xạ khuẩn đã được nghiên cứu đặc điểm gồm aminoglycosid, anthracyclin, glycopeptid, β-lactam, macrolides, nucleoside,... 1.1.6 Ứng dụng của kháng sinh Trong y học: — Kháng sinh được sử dụng để làm thuốc điều trị khi nhiễm vi khuẩn — Kháng sinh dùng để dự phòng cho phẫu thuật trong thực tế lâm sàng [2] — Kháng sinh trong trị liệu ung thư và chống nấm Trong chăn nuôi: — Kháng sinh được dùng để điều trị bệnh nhiễm khuẩn cho vật nuôi như viêm phổi cấp ở trâu bò, ỉa chảy ở ong do Protozoa — Kháng sinh còn được sử dụng như chất... 10.000 giống vi sinh vật 1.1.3 Phân loại kháng sinh Có nhiều cách phân loại kháng sinh:  Theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh: - Kháng sinh diệt khuẩn: penicillin, cephalosporin… - Kháng sinh kìm khuẩn: tetracyclin, macrolid… [1]  Theo cơ chế tác dụng của kháng sinh: - Thuốc ức chế tổng hợp vách tế bào: vancomycin… - Thuốc ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: cloramphenicol…... định nghĩa kháng sinh thay đổi như sau: Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, với liều thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh [1] 1.1.2 Lịch sử phát triển của kháng sinh Chất kháng sinh (antibiotics) được phát hiện và ứng dụng sớm nhất là penicilin, cách đây hơn 70 năm Năm 1940, các bác sĩ đã bắt đầu dùng chất kháng sinh mới... tinh, kim mũi mác… 2.2 Nội dung nghiên cứu Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau: 2.2.1 Phân loại Streptomyces 183. 23 theo ISP 2.2.2 Chọn lọc, cải tạo giống — Lựa chọn MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 183. 23 — Chọn 2 chủng vi khuẩn (1 vi khuẩn Gr(-), 1 vi khuẩn Gr(+)) để làm VSV kiểm định cho các nghiên cứu về sau — Tiến hành sàng lọc... các thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh và các chất kháng vi sinh vật khác Tuy nhiên, bằng đột biến hay thay đổi thông tin di truyền, các vi sinh vật đã và đang kháng lại các kháng sinh sẵn có hiện nay Vì vậy cần phải tìm các kháng sinh mới có tác dụng hiệu quả trên cả những vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là các kháng sinh tác dụng trên khối u [14] Đồng thời cũng cần tìm các... kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin) - Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (actinomycin D) [1] 4 1.1.4 Sơ đồ tổng quát quy trình lên men sản xuất kháng sinh Các bước cơ bản trong quá trình lên men từ xạ khuẩn được thể hiện ở hình P10 [4] 1.1.5 Nhu cầu phát triển kháng sinh mới Streptomyces là chi sản xuất kháng sinh lớn nhất trong giới vi sinh vật được phát hiện cho đến... thu kháng sinh tinh khiết 2.3.15 Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, tử ngoại, phổ khối để bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được 27 CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả phân loại theo ISP của xạ khuẩn Streptomyces Chủng xạ khuẩn Streptomyces . tài Nghiên cứu kháng sinh được tạo ra bởi Streptomyces 183. 23 làm khóa luận tốt nghiệp với mục tiêu sau: — Nghiên cứu phân loại Streptomyces 183. 23 theo ISP. — Phân lập chủng xạ khuẩn Streptomyces. THỦY NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC TẠO RA BỞI STREPTOMYCES 183. 23 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Th.S Nguyễn Liên Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học. Ngày nay, kháng sinh không chỉ tạo ra bởi các vi sinh vật mà còn được tạo ra bằng quá trình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, do đó định nghĩa kháng sinh thay đổi như sau: Kháng sinh là những