2.3.1. Phân loại xạ khuẩn theo ISP
— Chuẩn bị ống giống gốc nuôi cấy trong ống thạch nghiêng 6 ngày tuổi.
— Xác định đặc điểm hình thái và sắc tố hòa tan: MT xác định ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 đã được hấp tiệt trùng trong ống nghiệm, mỗi MT làm 4 đĩa.
— Cấy zigzag bào tử của Streptomyces 183.23 lên bề mặt thạch.
— Ủ ở 28-29°C, tiến hành quan sát sau khi nuôi cấy 7, 14, 21 ngày.
+ Màu của khuẩn ty khí sinh: Quan sát trực tiếp trên bề mặt khuẩn lạc, có thể có: màu đỏ (R), màu vàng (Y), xanh lá cây (G), xanh da trời (B), tím (V), xám (Gy), trắng (W). Trường hợp có các màu xen kẽ thì ghi các màu liền nhau.
+ Màu của khuẩn ty cơ chất: Quan sát mặt sau của khuẩn lạc (mặt dưới ống nghiệm), thường có các màu: vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây. Nếu thấy màu ký hiệu là (1), nếu không thấy ký hiệu là (0).
+ Quan sát chuỗi bào tử và bề mặt bào tử dưới kính hiển vi:
Dạng chuỗi bào tử: thẳng (R), uốn cong (Rf), móc câu (RA), lò xo (S). Nếu chuỗi bào tử có nhiều đặc điểm thì ghi đầy đủ các đặc điểm (ví dụ SRf)
Bề mặt bào tử có thể có các dạng sau: phẳng nhẵn (Sm), sần sùi mụn cơm (Wa), có gai (sp), có tóc (ha).
+ Sắc tố hòa tan nằm ngay trong MT có các màu: vàng, xanh, đỏ, tím… Nếu có ký hiệu là (1), nếu không có ký hiệu là (0).
— Xác định sắc tố melanoid (màu đen hoặc nâu đen): Nuôi cấy xạ khuẩn trên các MT ISP6, ISP7 đã hấp tiệt trùng, quan sát ở ngày thứ 2, 4. Nếu có ký hiệu là (1), nếu không có ký hiệu là (0).
— Khả năng tiêu thụ nguồn carbon: Nuôi cấy bào tử trên các MT có chứa các nguồn đường khác nhau (các ISP9), đánh giá ở ngày thứ 12, 14, 16. Nếu bào tử phát triển mạnh hơn hoặc bằng khi nuôi cấy trên MT ISP chứa đường glucose (chứng dương) thì ký hiệu là (+), nếu không phát triển mạnh bằng khi nuôi cấy trên chứng âm (MT ISP9 không có nguồn đường) thì ký hiệu là (-), nếu phát triển không rõ ràng, mạnh hơn chứng âm và kém hơn chứng dương thì ký hiệu là (±).
2.3.2. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn
— Cấy zigzag chủng xạ khuẩn Streptomyces 183.23 trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp, ủ cho phát triển ở 28°C.
— Sau 6 – 7 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2-4°C, định kỳ 3 – 6 tháng cấy truyền.
2.3.3. Xác định môi trường và vi khuẩn kiểm định
Nguyên tắc: Chủng Streptomyces 183.23 được cấy trên 7 MT ở nhiệt độ thích hợp sau đó thử HTKS với 9 loại VK kiểm định để xác định đồng thời MT nuôi cấy thích hợp và lựa chọn VSV kiểm định mà kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra có tác dụng tốt nhất.
Cân pha 7 MT, tiệt trùng ở 120°C/30 phút sau đó đổ ra các đĩa Petri vô trùng, cấy zigzag bào tử chủng Streptomyces 183.23 lên bề mặt các MT, ủ 28°C trong 6 ngày. Rồi đem thử hoạt tính kháng sinh của chủng với 9 loại VK kiểm định bằng phương pháp khối thạch và đánh giá kết quả.
2.3.4. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Tiến hành:
— Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2.5 ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18 – 24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 107 – 108 tế bào/ml.
— Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa.
— Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:
+ Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50°C, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định.
+ Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định.
+ Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT đã cấy VSV kiểm định. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng.
— Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định.
— Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức: 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n Trong đó:
i
D(mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i, s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,
n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n=3)
2.3.5. Sàng lọc ngẫu nhiên
— Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 183.23, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó, pha loãng tương tự đến nồng độ 10-6 bằng nước vô trùng.
— Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT2 trong đĩa Petri. Dùng que chang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử lên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng. Cho các đĩa vào tủ ấm 28°C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.
— Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn các khuẩn lạc phát triển đa dạng, mọc riêng rẽ sau 6 ngày rồi lấy ra cấy thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.
2.3.6. Đột biến bằng ánh sáng UV
— Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 183.23, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó dùng 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6 làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa Petri vô trùng.
— Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-1 đựng trong đĩa Petri được chiếu ánh sáng UV (λ=254nm) với khoảng cách và thời gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian 2-5 phút), sau đó lấy ra, để chỗ tối 2h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5 bằng nước vô trùng.
— Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng 10-6 và 0,1ml hỗn dịch đã đột biến ở các nồng độ 10-3, 10-4 và 10-5 vào các đĩa Petri có chứa MT2, sau đó dùng que chang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch
bào tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song. Các đĩa Petri sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28°C trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:
% độ sống sót = × 10-6+k × 100% Trong đó: Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến,
No: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng,
10-k: Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử.
— Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên. Làm song song mẫu chứng. Phần trăm biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:
% biến đổi hoạt tính = i 100%
o D D
Trong đó:
i
D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến,
o
D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
— Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.7. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh
— Nguyên tắc: Sau khi có kết quả xác định được các môi trường nuôi cấy bề mặt tối ưu cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các môi trường dịch thể tương ứng.
— Tiến hành
+ Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 183.23 sau khi nuôi cấy trên thạch nghiêng (MT2) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2dt bằng 10ml nước vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
+ Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên một số MTdt khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất. Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón
500ml chứa các MT dinh dưỡng với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10. Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h. Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT2dt được lên men trên môi trường tối ưu cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất.
2.3.8. Xác định ảnh hưởng của pH tới độ bền vững của kháng sinh
— Cho dịch lọc MT lên men vào 5 ống nghiệm, mỗi ống 10ml, chỉnh pH các ống về pH khác nhau (3, 5, 7, 9, 11) để vào tủ lạnh. Sau 24h lấy trong mỗi ống nghiệm 5ml dịch chiết đem thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch, lượng dịch còn lại trong ống nghiệm tiếp tục để vào tủ lạnh 5 ngày sau lấy ra thử HTKS.
— Đánh giá kết quả từ đó lựa chọn pH tối ưu cho quá trình cất giữ và chiết xuất KS từ dịch lọc MT.
2.3.9. Thử độ bền với nhiệt của kháng sinh
— Cho dịch lọc MT lên men vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 10ml:
+ Ống 1: Đun sôi trên ngọn lửa đèn cồn 10 phút.
+ Ống 2: Đun cách thủy 30 phút.
+ Ống 3: Giữ nguyên ở nhiệt độ thường.
— Thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch và lựa chọn nhiệt độ tối ưu cho các quá trình nghiên cứu sau.
2.3.10. Lựa chon dung môi hữu cơ, pH thích hợp để chiết kháng sinh
— Mục đích: Tìm DM và pH thích hợp để chiết kiệt KS từ dịch lọc lên men.
— Tiến hành:
+ Dịch lên men sau khi loại bỏ sinh khối, dịch lọc được chỉnh về các pH 3, 5, 7, 9, 11 rồi chiết với DM theo tỉ lệ Vdịch lọc: VDM = 5:1, lắc kĩ trong thời gian 1-2 phút, để phân lớp. Rồi gạn riêng lớp dung môi và dịch lọc.
+ Các DM sử dụng là: Ethyl acetat, butyl acetat, n-Butanol, Dichlomethan, Chloroform.
+ Kiểm tra HTKS của dịch chiết DMHC và dịch nước bằng phương phápkhoanh giấy lọc và giếng thạch.
2.3.11. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ
— Mục đích: Xác định dung môi và pH chiết tối ưu cho dịch lọc.
— Tiến hành: Dùng phương pháp chiết 1 lần.
+ Dịch lọc được chỉnh về các pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dd NaOH 1M và HCl 1M.
+ Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với nhiều một số khác nhau: Dịch lọc và dung môi cho vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi:Vdịch lọc = 1:5. Sau đó lắc kỹ trong 1 phút. Để yên 1h cho phân lớp. Tách riêng lấy lớp dung môi và dịch lọc.
+ Sau mỗi lần chiết, lấy lớp dung môi và lớp dịch lọc thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp khoanh giấy.
2.3.12. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng
Mục đích: Xác định các thành phần kháng sinh trong dịch lọc hoặc xác định kháng sinh đã tinh khiết hay chưa.
Tiến hành:
— Cắt bản mỏng có kích thước thích hợp, hoạt hóa ở 110°C/30 phút.
— Pha hỗn hợp dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để yên bình khoảng 1h để bão hòa dung môi.
— Dùng ống mao quản đường kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc ký lên bản mỏng. Chấm nhiều lần, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 50°C.
— Đặt bản mỏng vào bình sắc ký. Cho dung môi chạy lên khoảng ¾ chiều dài bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy.
— Xác định vết theo các phương pháp sau:
+ Soi đèn tử ngoại: Đặt bản mỏng sắc ký vào đèn tử ngoại, vết chất thử sẽ hiện màu.
+ Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt trùng, đổ một lớp vừa phải MT thạch thường đã cấy VSV kiểm định sao cho bản mỏng chìm
trong thạch. Để vào tủ 37°C, ủ trong 18-24h, vòng vô khuẩn xuất hiện nếu có kháng sinh.
+ Phương pháp hiện màu hóa học: Bản mỏng được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 70°C trong 10 phút để phát hiện vết. Dùng thuốc thử ninhydrin 1% trong cồn để phát hiện các kháng sinh có chứa nhóm amin.
— Tính hệ số Rf (Retardation factor): Rf a b
Trong đó: a: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết hoạt chất, b: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi.
2.3.13. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay
— Pha DMHC thu được sau khi chiết được cất quay bằng máy cất chân không.
— Nhiệt độ cất khoảng 60°C, p= - 0,09 atm. Cắn thu được được hòa tan bằng một lượng nhỏ methanol, đổ vào cốc có mỏ sạch, bốc hơi cách thủy ở 50°C đến khô. Thu lấy bột kháng sinh thô.
2.3.14. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột
— Pha hệ dung môi chạy theo đúng tỷ lệ, để 30 phút cho bão hòa.
— Chuẩn bị cột sắc ký: Cột có đường kính 1cm, dài 50cm được rửa sạch, tráng cồn, sấy khô. Cân khoảng 6g hạt Silicagel nhồi cột, hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút, đem hòa thành hỗn dịch với dung môi chạy và đưa lên cột, ổn định cột trong 30 phút.
— Đưa mẫu thử lên cột: Bột kháng sinh thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol rồi trộn với khoảng 1g Silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50°C cho bay hết methanol rồi cho lên cột.
— Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch, khoảng 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml.
— Phát hiện và xác định các phân đoạn chứa kháng sinh cần tách: Thử HTKS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất. Các phân đoạn
chính là các phân đoạn từ khi xuất hiện vết đến khi không còn vết có Rf tương đương và vẫn có hoạt tính kháng sinh mạnh.
— Các phân đoạn chính sau khi chạy cột được gộp vào cốc có mỏ sạch, bốc hơi cách thủy ở 50°C đến khô. Cạo thu bột tinh thể kháng sinh vào ống nghiệm sạch. Sau đó, bột tinh thể kháng sinh được kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi, lọc, bốc hơi cách thủy ở 50°C để thu kháng sinh tinh khiết.
2.3.15. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được
Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, tử ngoại, phổ khối để bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả phân loại theo ISP của xạ khuẩn Streptomyces
Chủng xạ khuẩn Streptomyces 183.23 được nuôi cấy trên các môi trường ISP, kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Hình ảnh chuỗi bào tử và bề mặt bào tử được trình bày ở Phụ lục hình P1 và hình P2.
Bảng 6: Đặc trưng phân loại theo ISP của Streptomyces 183.23
Các đặc điểm phân loại Streptomyces 183.23 S. pyridomyceficus
Màu khuẩn ty khí sinh Vàng trắng Vàng trắng
Sắc tố melanoid 0 0
Màu khuẩn ty cơ chất 0 0
Sắc tố hòa tan 0 0 Chuỗi bào tử RF RF Bề mặt bào tử Sm Sm Inositol ± — D-Xylose + + D-Mannitol + ± D-Fructose + +