NGHIÊN cứu QUY TRÌNH PHÂN lập tế bào gốc từ MÀNG ối NGƯỜI

Y học thực hành (806) số 2/2012 33 1.3. Phỏt hin serotype ca DENV trờn bnh nhõn st xut huyt ng dng mPCR trờn 80 mu huyt thanh ca bnh nhõn st xut huyt, cú 36 mu (45%) phỏt hin RNA ca virus dengue v c 36 mu u l serotype I (Hỡnh 3). Hỡnh 3: Sn phm PCR ca cỏc mu t bnh nhõn st xut huyt. M: marker DNA 50bp; 1: mu HN-3; 2: mu HN-8; 3: mu HN-15; 4: HN-25; 5:chng õm. 2. Bn lun DENV c cnh bỏo l mt trong nhng Arbovirus quan trng nht gõy nh hng ln n sc khe cng ng trờn ton th gii, c bit l cỏc serotype ca DENV. Bi vy, phỏt hin nhanh cỏc serotype ca DENV trong cng ng l mt ũi hi cp bỏch nhm khng ch, ngn chn v dp tt nhng v dch do chỳng gõy ra. Hin nay, trờn th gii v trong nc s dng nhiu phng phỏp sinh hc phõn t phỏt hin cỏc mm bnh sinh hc. Cỏc phng phỏp ng dng PCR cú th xỏc nh cỏc serotype ca DENV trong mu bnh phm khi tp trung vo nhng on gene c hiu ca virus. Phng phỏp mPCR c s dng trong nghiờn cu ny ó c chng minh tớnh vt tri so vi cỏc phng phỏp khỏc. S dng mPCR trong phỏt hin sm virus DENV m ra hng i mi trong cụng tỏc phũng v chng bnh st xut huyt nc ta. Kt qu cho thy, trong 80 mu bnh phm, t l nhim serotype DENV 1 l 36/80 (45%). T l v serotype ca DENV cng phự hp vi s liu cụng b mi õy ca B Y t v t l nhim DENV v serotype trờn bnh nhõn st xut huyt trong v dch 2009. KT LUN Hin nay, phng phỏp chn oỏn nhanh l cụng c hu hiu nht trong cụng tỏc phũng chng dch bnh. Phng phỏp mPCR c s dng phỏt hin nhanh cỏc serotype ca DENV trong nghiờn cu ny cho thy t l nhim serotype DENV 1 trờn bnh nhõn st xut huyt l 45% (36/80). TI LIU THAM KHO 1.De Paula S. O., de C., (2004) One-step RT-PCR protocols improve diagnosis compared to two-step RT- PCR approaches. J. Clin Virol 30: 297 301. 2.Gubler, D. J. (1997). Dengue and dengue hemorrhagic fever: its history and resurgence as a global public health problem, p. 122. In D. J. Gubler and G. Kuno (ed.), Dengue and dengue hemorrhagic fever. CAB International 3.Guzman, M. G., and G. Kouri. (1996). Advances in dengue diagnosis. Clin.Diagn. Lab. Immunol. 3:621 627. 4.Innis, B. L., A. Nisalak, (1989). An enzyme-linked immunosorbent assay to characterize dengue infections where dengue and Japanese encephalitis co-circulate. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40:418427. 5.Lanciotti RS, Calisher CH, Gubler DJ, Chang GJ, Vorndam AV (1992). Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J. Clin Microbiol, 30:545-51. 6.Nimmannitya, S. 1987. Clinical spectrum and management of dengue hae-morrhagic fever. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 18:392397. Nghiên cứu quy trình phân lập tế bào gốc từ màng ối ngời Phạm Văn Trân, Huỳnh Quang Thuận. Hc vin quõn y B quc phũng; TểM TT T bo gc l t bo cú kh nng t lm mi v bit hoỏ thnh cỏc t bo chuyờn bit cú chc nng mi tng ng. Mc tiờu ca ti l nghiờn cu qui trỡnh phõn lp, nuụi cy tng sinh t bo gc mng i ngi. Phng phỏp nghiờn cu: phõn lp t bo bng trypsin, collagenase B, percoll vi t trng khỏc nhau. Xỏc nh t bo gc bng du n OCT-4. Kt qu: Quy trỡnh tỏch phõn lp t bo gc t mng i t hiu qu cao, t bo thu c cú biu hin du n ca t bo gc. Kt lun: Quy trỡnh phõn lp t bo gc mng i bng trypsin, collagenase B v percoll t hiu qu cao v d ng dng. Cỏc t bo gc mng i biu hin du n OCT-4, du n ca t bo gc. T khúa: Mng i, t bo gc, trypsin, collagenase B, hyaluronidase. Tờn ting anh: Isolation, storage and culture of amniotic membrane stem cells. SUMMARY The amniotic membrane stem cell can differentiate into different mature cells. The aim of study is to examine the process of isolating and culturing of stem cells isolated from amniotic membranes. Method: We isolated stem cell by trypsin, percoll and characterised its by marker OCT-4. Results: Protocol for isolation of stem cells from amniotic membrane has high efficiency. Amniotic membrane stem cells collected express OCT-4. Conclusion: Amniotic stem cells can be isolated from amniotic membrane by trypsin, collagenase B and percoll. Keywords: Amniotic membrane, stem cell, trypsin, collagenase B, hyaluronidase. T VN T bo gc l t bo nn múng ca tt c cỏc t bo, mụ v c quan trong c th, õy l nhng t bo cha bit hoỏ nhng cú kh nng tr thnh cỏc t bo chuyờn bit v cú chc nng mi tng ng. Da vo ngun gc, cỏc t bo gc c phõn chia thnh 4 loi ú l: T bo gc phụi (Embryonic stem cells) v t bo mm phụi (Embryonic germ cells), t bo gc thai (Foetal stem cells), t bo gc trng thnh (Adult stem cells/Somatic stem cells). Da vo c tớnh hay mc bit hoỏ, t bo gc c chia thnh: T bo gc ton nng hay t bo gc thy t (totipotent stem cells), t bo gc vn nng (pluripotent stem cells), t bo gc a nng (multipotent stem cells), t bo gc n nng (mono/unipotential progenitor cells). Mng i l mt sn phm thng b i trong quỏ trỡnh sinh n l mt ngun cung cp t bo gc lý tng. S dng t bo gc mng i khụng gp phi Y häc thùc hµnh (806) – sè 2/2012 34 những vấn đề về đạo đức, xã hội. Các tế bào gốc phân lập từ màng ối có tính sinh miễn dịch thấp, không có khả năng ung thư hóa và có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu nghiên cứu quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc từ màng ối người phục vụ cho nghiên cứu và điều trị. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Quy trình phân lập tế bào gốc từ màng ối Tế bào gốc được phân lập từ màng ối của các sản phụ mổ đẻ bảo đảm tiêu chuẩn xét nghiệm sàng lọc âm tính với HIV, HBV, HCV, HTLV và giang mai. Tiến hành tách tế bào bằng các enzym phân cắt mô trypsin 0,02%, collagenase B 0,1%, hyaluronidase 0,1% có phối hợp với các biện pháp cơ học. Ly tâm với percoll 40,8% và 50,8% (Sigma, Viet Nam) để thu được khối tế bào gốc. Tế bào gốc màng ối được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung thêm penicillin (50 U/ml), streptomycin (50 µg/ml), L-glutamin (2 x 10 -3 M), huyết thanh bào thai bê (10%) đồng thời cấy chuyển tế bào 2 tuần một lần để duy trì trong phòng thí nghiệm. - Bảo quản tế bào gốc màng ối trong điều kiện lạnh âm sâu (-196 0 C) trong môi trường DMEM có 10% DMSO. Hình 1: Quy trình phân lập tế bào gốc từ màng ối 2. Kỹ thuật RT-PCR xác định biểu hiện của ARN thông tin Tách chiết RNA tổng số từ các tế bào (Kit -Qiagen) sau đó tổng hợp cDNA từ RNA tổng số (Kit - Fermentas). Phản ứng PCR định lượng được thực hiện trên máy LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics) sử dụng kít QuantiTect ® SYBR ® Green PCR (Qiagen). Cặp chất mồi đặc hiệu cho từng gen được mô tả trong bảng sau. Bảng 1: Các mồi dùng để chạy RT-PCR. Sens: 5'-TGAGAAACGGCTACCACATC-3' 18S rRNA Anti-sens: 5'-TTACAGGGCCTCGAAAGAGT-3' Sens: 5'-AGGTGTTCAGCCAAACGACC-3' Oct-4 octamer-binding transcription factor 4 Anti-sens: 5'-TGATCGTTTGCCCTTCTGGC-3' Sau khi làm biến tính cDNA 15 phút ở 95°C, từ 40 đến 50 chu kỳ PCR được thực hiện (15 giây: 95°C, 25 giây: 58°C và 20 giây: 72°C). Điện di sản phẩm PCR trên gel arcrylamid Nồng độ ARNtt của dấu ấn OCT-4 được tính toán dựa trên nồng độ ARNtt của gen 18S. 3. Kỹ thuật hóa miễn dịch tế bào Tế bào trên đĩa nuôi cấy được cố định bằng etanol 98% sau đó được ủ với kháng thể thứ nhất kháng OCT-4. Kháng thể thứ hai được gắn với chất huỳnh quang. Quan sát tế bào và chụp hình ảnh trên kính hiển vi huỳnh quang. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc màng ối. Các enzym khác nhau có thời gian tác dụng khác nhau lên quá trình phân rã màng ối, giải phóng tế bào (bảng 2). Bảng 2: Thời gian tác dụng của enzym phân cắt mô. Số thứ tự Tên enzyme Thời gian làm tan rã màng ối (phút) 1 Trypsin 0.2% 45+/-10 2 Collagenase B 0.1% 50+/-10 3 Trypsin 0.2% + Collagenase B 0.1% (tỷ lệ 1:1) 20 +/- 10 Bóc tách và rửa màng ối Phân l ậ p t ế bào Ly tâm thu lấy tế bào Đ ế m t ế bào Nuôi c ấ y t ế bào B ả o qu ả n t ế bào Y häc thùc hµnh (806) – sè 2/2012 35 4 Hyaluronidase 0.6% Không tác dụng - Sau khi được phân lập, tế bào gốc màng ối được nuôi cấy trong đĩa plastic. Sau 24 giờ, các tế bào gốc bám dính vào bề mặt đáy đĩa nuôi cấy, các tế bào gốc màng ối có hình tròn hoặc hình đa diện. Sau mỗi 2-3 ngày thì tiến hành thay môi trường và kiểm tra tình trạng phát triển của các tế bào gốc. Sau khoảng 2 tuần nuôi cấy, mật độ tế bào phát triển bao phủ 50-60% bề mặt đĩa nuôi cấy. Sau đó tiến hành cấy chuyển nhằm tạo không gian cho tế bào gốc phát triển và nuôi cấy sang môi trường đặc biệt để biệt hóa tế bào gốc thành các loại tế bào khác nhau. 2. Biểu hiện dấu ấn OCT-4 của tế bào gốc màng ối Kết quả PCR cho thấy tế bào gốc có biểu hiện dấu ấn OCT-4. Kết quả phù hợp với kết quả nhuộm hóa miễn dịch tế bào với kháng thể kháng OCT-4 của người (hình 2). DAPI OCT-4 MERGE Hình 2. Biểu hiện dấu ấn OCT-4. A, B, C: Hình ảnh tế bào nhuộm hóa miễn dịch với OCT-4, màu xanh lá OCT-4, màu xanh tím nhuộm nhân bằng DAPI. C: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của OCT-4. Ba mẫu tế bào gốc màng ối khác nhau được cho vào 3 giếng điện di đánh số 1, 2, 3. BÀN LUẬN 1. Quy trình phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc màng ối: Để thu được tế bào có khả năng sống tốt trong môi trường nuôi cấy, tế bào cần phải được phân lập trong thời gian 4 giờ kể từ khi mổ lấy thai. Nếu để sau 4h mới bóc tách và phân lập tế bào thì tỷ lệ nuôi cấy tế bào phát triển kém và dễ bị nhiễm khuẩn và nhiễm nấm. Về phân tách tế bào gốc từ màng ối bằng các enzym, nếu chỉ phân cắt màng ối bằng trypsin thì số lượng tế bào thu được thấp và thời gian thường phải kéo dài, có khi phải 60 phút các tế biểu mô màng ối mới bị phân cắt hết. Nếu cho thêm collagenase B vào trypsin thì số lượng tế bào thu được sẽ nhiều hơn và thời gian tan rã màng ối sẽ nhanh hơn. Hyaluronidase hầu như không có tác dụng phân rã màng ối mặc dù đã có một số tác giả trên thế giới dùng enzym này để phân lập tế bào từ các mô liên kết. Tế bào gốc được nuôi cấy trong đĩa plastic đường kính 10cm, với môi trường DMEM high glucose có thêm 10% FBS + 1% Penicilline-Streptomycine + 1% L- glutamate, trong tủ nuôi cấy HEPA-NUAIRE ở 37 O C, không khí có 5% CO 2 , độ ẩm bão hòa. Ngay sau khi nuôi cấy 24 giờ, các tế bào gốc màng ối có xu hướng bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy, phát triển thành những cụm tế bào hình tròn và có kích thước trung bình. Sau 2 tuần nuôi cấy, mật độ tế bào phát triển bao phủ khoảng 50-60% bề mặt đĩa nuôi cấy thì cấy chuyển nhằm cung cấp đủ chất dinh dưỡng và đảm bảo không gian cho các tế bào tăng sinh. Kết quả nuôi cấy và môi trường nuôi cấy cũng tương tự như kết quả của các nghiên cứu khác. Trong nghiên cứu của chúng tôi, với 30 mẫu màng ối, chúng tôi đã tiến hành phân lập thành công tế bào gốc từ màng ối bằng enzym. Các vị trí trên màng ối thu được nhiều tế bào nhất là vị trí gần trung tâm màng ối gần với cuống rốn, còn vị trí vùng dìa càng xa cuống rốn thì thu được ít tế bào hơn. 2. Định danh tế bào gốc màng ối - Các tế bào màng ối biểu hiện nhiều marker tế bào gốc như octamer-binding transcription factor 4 (OCT-4), GATA-4, hepatocyte nuclear factor-3β (HNF-3β)… Những yếu tố này cho thấy không chỉ tế bào gốc biểu mô màng ối mà còn cả tế bào gốc trung mô màng ối cũng là tế bào gốc đa tiềm năng. Chúng tôi định danh tế bào gốc màng ối bằng quan sát trực tiếp trên kính hiển vi đảo ngược sau đó tiến hành các phản ứng RT-PCR, hóa miễn dịch tế bào để phát hiện marker của tế bào gốc. Trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi chỉ xác định sự biểu hiện của marker OCT-4, là marker biểu hiện tính gốc của tế bào. Việc xác định tính gốc của tế bào gốc màng ối bằng OCT-4 đã được nhiều tác giả sử dụng. Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng đã xác định sự thay đổi của marker OCT-4 trong quá trình nuôi cấy. Kết quả chỉ ra rằng marker OCT-4 giảm dần theo thời gian. Trong thời gian nuôi cấy tế bào gốc màng ối, mặc dù đã cố gắng đảm bảo những điều kiện tốt nhất cho nuôi cấy như thời gian phân lập tế bào gốc từ màng ối, phòng nuôi cấy tế bào luôn được vệ sinh tiệt khuẩn, môi trường nuôi cấy 335 bp Y học thực hành (806) số 2/2012 36 thớch hp, t nuụi cy cú nhit 37 0 C, CO 2 5% luụn n nh, bo m vụ trựng, nhng chỳng tụi cng ch nuụi cy t bo gc mng i c trong khong 30-40 ngy. KT LUN Trong quỏ trỡnh nghiờn cu chỳng tụi ó cú c quy trỡnh phõn lp t bo gc t mng i ngi cú hiu qu cao v nuụi cy tng sinh c cỏc t bo gc mng i trong mụi trng DMEM high Glucose cú thờm 10% FBS v Penicilline-Streptomycine thnh cụng. TI LIU THAM KHO 1. Trn Vn Bộ (2006). Tỡnh hỡnh ghộp t bo gc ti TP. H Chớ Minh Vit Nam. Y hc Vit Nam, s 5/2006: 1-4. 2. Nguyn Th Thu H (2004). T bo gc v ng dng trong y sinh hc. TCNCYDH ph bn 32 (6): 13- 26. 3. Phan Kim Ngc v CS (2008). Thu nhn t bo gc trung mụ a nng t mỏu cung rn ngi. Tp chớ y dc hc quõn s. 33(2):119-124. 4. Phan Kim Ngc, Phm Vn Phỳc, Trng nh (2009). Cụng ngh t bo gc. Nh xut bn giỏo dc Vit Nam. 5. Anna M. Wobus et al (2002). Embryonic stem cell as a model to study cardiac, skeletal muscle, and vascular smooth muscle cell differentiation. Method in Molecular Biology, 184: 127 - 155. 6. Ben - Num IF, Benvenisty (2006). Humanembryonic stem cells as cellular model for human disorder. Mol Cell Endocrinol. 7. Ayaka Toda, Motonori Okabe, Toshiko Yoshida, and Toshio Nikaido (2007). The Potential of Amniotic Membrane/Amnion-Derived Cells for Regeneration of Various Tissues. J Pharmacol Sci 105, 215 228. 8. Toshio Miki, Keitaro Mitamura, Mark A. Ross, Donna B. Stolz, Stephen C. Strom (2007). Identication of stem cell marker-positive cells by immunouorescence in term human amnion. Journal of Reproductive Immunology 75 (2007) 9196. 9. Toshio Miki, Thomas Lehmann, Hongbo Cai, Donna B. Stolz, Stephen C. Stroma (2005). Stem Cell Characteristics of Amniotic Epithelial Cells. Stem Cells 2005;23:15491559. NGHIÊN CứU Tỷ Lệ PHÂN LOạI MÔ BệNH HọC CủA UNG THƯ TUYếN GIáP NGUYÊN PHáT Nguyễn Bá Đức, Trần Giang Châu TểM TT: Mc tiờu nghiờn cu: T l Phõn loi mụ bnh hc ca ung th tuyn giỏp nguyờn phỏt. i tng v phng phỏp nghiờn cu: Phõn loi mụ bnh hc da theo UICC v AJCC s dng trong thc hnh lõm sng v nghiờn cu. Chn oỏn mụ bnh hc c tin hnh ti bnh vin K. Phng phỏp c nh bnh phm bng Formaldehyde, vựi nn, ct nhum Hematoxylin Eosin. Kt qu v kt lun: T l ung th th nhỳ v nhỳ nang chim nhiu nht l 82,3%; th nang ng th hai l 9,7%; th ty l 6,4%; gp ớt nht l th khụng bit húa ch cú 1 trng hp chim 1,6%.Mi tng quan gia mụ bnh hc v hch trờn lõm sng th nhỳ v nhỳ nang cú kh nng thy hch lõm sng l cao nht (57%). Th nang l 50%. Th ty l 75% T khúa: mụ bnh hc, ung th tuyn giỏp nguyờn phỏt SUMMARY: RESEARCH HISTOPATHOLOGICAL CLASSIFICATION OF PRIMARY HYROID CANCER Objectives: The rate of histologic classification of primary thyroid cancer. Subjects and Methods: Histologic classification based on the UICC and AJCC used in clinical practice and research. Histopathological diagnosis was conducted at the K hospital. Method of specimens fixed with formaldehyde, burying candles, cut staining Hematoxylin-Eosin. Ket results and conclusions:The rate of papillary cancer and follicular papilla up to a maximum of 82.3%,the capsule is 9.7%, bone marrow 6.4%, not differentiate only one case accounted for 1.6T%. The correlation between histopathological and clinical lymph nodes, papillary and follicular papilla is the highest T(57T%). Marrow is 75%,Cysts is 50%. Keywords: histologic classification, primary thyroid cancer T VN Khong mt th k nay bnh ung th tuyn giỏp trng mi c cp n mt cỏch rừ rng hn. Trc õy ung th tuyn giỏp trng c xem nh mt phn ca hi chng u c ớt c núi ti. Nm 1883 J.Breack u tiờn bỏo cao mt trng hp ung th tuyn giỏp trng, n nm 1904 hai nh lõm sng Thy in l Klink v Winship núi ti ung th tuyn giỏp th n. Nm 1907 Langhans tỏc gi ngi c nhc ti ung th biu mụ tuyn giỏp nhng cha cú phõn loi gii phu bnh lý, 1909 Hedinger ó nờu ra s sp xp mụ bnh hc, tuy nhiờn s hiu bit v ung th tuyn giỏp trng vn cũn rt hn ch. Cho n nm 1940 tr i mi cú nhiu nhng nghiờn cu v ung th tuyn giỏp trong ú Marchant cú cụng ln trong phõn loi mụ bnh hc. cú c s ỏnh giỏ cỏc phng phỏp cn lõm sng trong chun oỏn ung th tuyn giỏp nguyờn phỏp, trong nghiờn cu ny chỳng tụi tp trung vo mc tiờu: Nghiờn c t l Phõn loi mụ bnh hc ca ung th tuyn giỏp nguyờn phỏt. I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU. i tng nghiờn cu: Gm 62 bnh nhõn ung th tuyn giỏp trng nguyờn phỏt ó c xỏc nh sau khi cú kt qu mụ bnh hc chớnh xỏc sau phu thut ti bnh vin K H Ni. Phng phỏp nghiờn cu Phõn loi mụ bnh hc da theo UICC v AJCC s dng trong thc hnh lõm sng v nghiờn cu [44,45]. - Ung th th nhỳ v nhỳ nang. - Ung th th nang. - Ung th th ty. - Ung th th khụng bit húa. Phõn loi mụ hc. - GR xR : Khụng ỏnh giỏ c . - GR 1R : Bit húa. . tiêu nghiên cứu quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc từ màng ối người phục vụ cho nghiên cứu và điều trị. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Quy trình phân lập tế bào gốc từ màng ối Tế bào. yếu tố này cho thấy không chỉ tế bào gốc biểu mô màng ối mà còn cả tế bào gốc trung mô màng ối cũng là tế bào gốc đa tiềm năng. Chúng tôi định danh tế bào gốc màng ối bằng quan sát trực tiếp. OCT-4. Ba mẫu tế bào gốc màng ối khác nhau được cho vào 3 giếng điện di đánh số 1, 2, 3. BÀN LUẬN 1. Quy trình phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc màng ối: Để thu được tế bào có khả