nghiên cứu quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HUỲNH NGHĨA NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XỬ LÝ TẾ BÀO GỐC MÁU CUỐNG RỐN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP HỒ CHÍ MINH - Năm 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HUỲNH NGHĨA NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XỬ LÝ TẾ BÀO GỐC MÁU CUỐNG RỐN CHUYÊN NGÀNH : BỆNH HỌC NỘI KHOA Mã số: 01 31 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1.PGS TRẦN VĂN BÉ 2.PGS TS TRẦN THỊ LIÊN MINH TP HỒ CHÍ MINH - Năm 2007 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tác giả luận án Huỳnh Nghóa MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN MUÏC LUÏC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ DANH MỤC CÁC SƠ ÑOÀ DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIEÄU 1.1 Lược sử phát triển ngân hàng ghép tế bào gốc MCR 1.2 Tế bào gốc tạo máu - hình thành phát triển 1.3 Máu cuoáng roán 10 1.4 Thu thập, xử lý lưu trữ MCR 16 1.5 Kỹ thuật xử lý mẫu MCR 22 1.6 Kỹ thuật tồn trữ lạnh mẫu MCR 27 1.7 Xét nghiệm đánh giá kiểm tra chất lượng sản phẩm MCR 31 1.8 Ứng dụng lâm sàng ghép tế bào gốc từ MCR 40 CHƯƠNG ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48 2.1 Thiết kế nghiên cứu 48 2.2 Đối tượng nghiên cứu 48 2.3 Phương pháp nghiên cứu 50 2.4 Phân tích xử lý số liệu thu thaäp 70 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 71 3.1 Kết tư vấn sàng lọc trước thu thập MCR 71 3.2 Kết thu thaäp MCR 72 3.3 Kết xử lý MCR 84 3.4 Kết nuôi cấy tế bào tạo khúm sau xử lý MCR 86 3.5 Kết sàng lọc tế bào MCR thu thập 98 3.6 Kết MCR dự trữ đông lạnh (- 1960c) sau xử lý 99 3.7 Kết thực nghiệm ghép tế bào MCR 101 CHƯƠNG BÀN LUẬN 104 4.1 Veà sàng lọc người cho trước thu thập MCR 104 4.2 Về quy trình thu thập mẫu MCR 106 4.3 Quy trình kỹ thuật xử lý MCR 121 4.4 Kết nuôi cấy tế bào sau xử lý mẫu MCR 128 4.5 Quy trình dự trữ đông lạnh MCR sau xử lý -1960c 132 4.6 Về kết lây nhiễm virus 136 4.7 Các xét nghiệm đánh giá chất lượng tế bào gốc từ MCR 137 4.8 Kết thực nghiệm ghép tế bào gốc MCR 140 KẾT LUẬN 144 KIẾN NGHỊ 146 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHUÏ LUÏC Phuï luïc Phuï luïc Phuï luïc Phuï luïc Phuï luïc Phuï luïc Phuï luïc 7………………………………………………………………………………………………………………………………………… DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALL : Bệnh bạch cầu cấp dòng lymphô AML : Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy anti HCV : Kháng thể viêm gan virút C BC : Bạch cầu BCHTT : Bạch cầu hạt trung tính BFU-E : Tế bào tạo khúm dòng hồng cầu CFC = CFU : Tế bào tạo khúm = Đơn vị tạo khúm CFU – E : Đơn vị tạo khúm dòng hồng cầu CFU – G : Đơn vị tạo khúm dòng hạt CFU – GEMM : Đơn vị tạo khúm đa tiềm CFU – GM : Đơn vị tạo khúm dòng bạch cầu hạt, đại thực bào CFU – L : Đơn vị tạo khúm dòng lymphô CFU – M : Đơn vị tạo khúm dòng tủy CFU – Meg : Đơn vị tạo khúm dòng mẫu tiểu cầu CFU-Total : Đơn vị tạo khúm toàn CLL : Bệnh bạch cầu mãn dòng lymphô CLP : Tế bào tiền thân chung dòng lymphô CML : Bệnh bạch cầu mãn dòng tủy CMP : Tế bào tiền thân chung dòng tủy CMV : Cytomegalo virus CR1 : Lui bệnh hoàn toàn lần thứ DMSO : Dimethylsulfoxide (chất bảo quản đông lạnh ) FLT3 – Ligand : Một yếu tố phát triển ( danh từ riêng) GMP : Tế bào tiền thân dòng đại thực bào-bạch cầu hạt GVHD : Bệnh mảnh ghép chống ký chủ GVL : phản ứng mảnh ghép chống ung thư HbA : Hemoglobin A HbA2 : Hemoglobin A2 HbF : Hemoglobin F (hemoglobin baøo thai) HbH : Hemoglobin H HC : Hồng cầu HES : Hydroxyethyl starch (chất làm kết tủa hồng cầu) HLA : Kháng nguyên hoà hợp tổ chức HPCs : Các tế bào gốc đa tiềm đầu tạo máu HSXLMCR : Hồ sơ xử lý máu cuống rốn ICBTR : Tổ chức đăng ký ghép máu cuống rốn quốc tế KN : Kháng nguyên LT – HSC : Tế bào gốc tạo máu dài hạn LT-CIC : Tế bào nuôi cấy lâu dài MCR : Máu cuống rốn MEP : Tế bào tiền thân dòng hồng cầu-Mẫu tiểu cầu MMP : Tế bào tiền thân đa tiềm Pro-B : Tiền tế bào Lympho B Pro-DC : Tiền tế bào nhánh Pro-NK : Tiền tế bào giết tự nhiên Pro-T : Tiền tế bào T RLCH : Rối loạn chuyển hóa SL HC : Số lượng hồng cầu SLBC : Số lượng bạch cầu SLTB CD34+ : Số lượng tế bào CD34 dương tính SLTBNTB : Số lượng tế bào nhân toàn SLTC : Số lượng tiểu cầu ST – HSC : Tế bào gốc tạo máu ngắn hạn TBGMNV : Tế bào gốc máu ngoại vi TBGTM : Tế bào gốc tạo máu TBN : Tế bào nhân TBĐN : Tế bào đơn nhân TC : Tiểu cầu TLN : Trọng lượng TMTƯ : Tónh mạch trung ương TPMCR : Thành phần máu cuống rốn TX : Tủy xương YTSK : Yếu tố sản khoa DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần TBG tạo máu MCR tủy xương 12 Bảng 1.2: Các kháng nguyên bộc lộ tế bào CD34+ 14 Bảng 1.3: So sánh kết loại bỏ hồng cầu thu hồi tế bào nhân, 24 Bảng 1.4: Kết so sánh tỉ lệ % thu hồi Sepax HES 25 Bảng 1.5: Tỉ lệ nhiễm trùng sản phẩm tế bào gốc MCR 33 Bảng 1.6 : Thống kê đơn vị MCR lưu trữ , sử dụng Châu Á 40 Bảng 1.7 : Thống kê đơn vị MCR lưu trữ, sử dụng giới 41 Bảng 1.8: Kết ghép MCR trẻ em 44 Bảng 1.9: Kết sau ghép MCR bệnh nhân người lớn 46 Bảng 1.10: So sánh ghép MCR với ghép tế bào gốc khác 47 Bảng 2.11: Trang thiết bị, dụng cụ lưu trữ MCR 68 Bảng 3.12: Các lý loại bỏ trước thu thập MCR 72 Bảng 3.13: Các lý loại bỏ sau thu thập MCR 73 Bảng 3.14: Đặc điểm sản khoa người cho MCR 74 Bảng 3.15: Đặc điểm mẫu MCR thu thập 74 Baûng 3.16: Tương quan YTSK thể tích MCR thu thập 75 Bảng 3.17: Tương quan YTSK với số lượng TBNTB 76 Bảng 3.18: nh hưởng YTSK với phân nhóm TBN 77 Bảng 3.19: Kết thể tích,TBN mẫu MCR thu thập với phân nhóm TBN 79 Bảng 3.20: Tương quan YTSK, thành phần MCR với SLTB CD34 + 80 Bảng 3.21: Kết SLTB CD34+ theo phân nhóm TBN 83 Bảng 3.22: Đặc điểm mẫu MCR sau xử lý 84 Bảng 3.23: Kết giảm thể tích loại bỏ hồng cầu sau xử lý 84 Bảng 3.24: Khả tăng số lượng TBN tế bào CD34 + sau xử lý 85 Bảng 3.25: Kết SLTBN, TBĐN MCR trước sau xử lý 85 Bảng 3.26: Kết tế bào CD34+ toàn trước sau xử lý 85 Bảng 3.27: Kết đếm tế bào sống trước sau xử lý MCR 86 Bảng 3.28: Nguyên nhân mẫu MCR nuôi cấy khúm tế bào không thu hoạch 87 Bảng 3.29: Kết chung nuôi cấy khúm tế bào MCR sau xử lý 88 Bảng 3.30: Kết YTSK, TPMCR liên quan đến khúm BFU – E 89 Bảng 3.31: Kết YTSK TPMCR sau xử lý liên quan 91 Bảng 3.32: Kết YTSK , thành phần MCR liên quan nuôi cấy khúm tế bào 93 Bảng 3.33: Kết yếu tố sản khoa, thành phần MCR thu thập sau xử lý 95 Bảng 3.34: Tương quan SLTB CD34+ nuôi cấy khúm tế bào sau xử lý 97 Bảng 3.35: Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn, nhiễm vi nấm trước sau xử lý MCR 98 Bảng 3.36: Kết sàng lọc bệnh lây lan qua mẫu MCR 98 Bảng 3.37: Kết sàng lọc bệnh hemoglobin (trước xử lý) 99 Bảng 3.38: Kết loại bỏ MCR dự trữ đông lạnh (- 1960C) 99 Bảng 3.39: Kết đếm tế bào sống theo thời gian lưu trữ 100 Bảng 3.40: Kết so sánh thành phần MCR trước sau lưu trữ 100 Bảng 4.41: So sánh thể tích trung bình MCR thu thập 108 Bảng 4.42: Sự tương quan thể tích MCR thu thập yếu tố sản khoa 111 Bảng 4.43: So sánh số lượng TBNTB MCR thu thập 112 Bảng 4.44: So sánh yếu tố sản khoa tác giả Solves P 114 Bảng 4.45: So sánh kết số lượng tế bào CD34+ túi MCR 115 Bảng 4.46: So sánh yếu tố sản khoa với tế bào CD34+ nghiên cứu 116 Bảng 4.47: So sánh tỉ lệ nhiễm trùng, nhiễm nấm sau thu thập MCR 118 Bảng 4.48: So sánh kết xử lý tế bào kỹ thuật HES 123 Bảng 4.49: So sánh thành phần MCR sau xử lý với chất khác 124 Bảng 4.50: So sánh nuôi cấy khúm tế bào sau xử lý MCR 129 - Tube 5ml (đựng mẫu XN) - Cryotube 5ml - Cryotube 2ml - Injection plugs (gắn vào miệng túi máu để rút mẫu XN) - Ống chích 20ml - Ống chích 5ml - Ống chích 3ml - Ống chích 1ml - Kim 18G - Kim 21G - Gòn hấp tiệt trùng - Nhãn barcode - Hồ sơ xử lý máu cuống rốn (HSXLMCR)  Thuốc thử : - HESPAN (6% hetastarch 0,9% NaCl) : 20ml/oáng - 10% DMSO / 1% Dextran 40 (6ml/lọ) - Cồn 75% (sát khuẩn) - Lọ cấy vi trùng (BACTEC) - Lọ cấy vi nấm (BACTEC) TIẾN HÀNH : 2.1) Thu thập tế bào (Giai đoạn PRE): - Lau túi thu thập MCR cồn 75% chuyển vào phòng xử lý - Cân túi MRC trừ bì (65g : gồm túi chất chống đông) ghi vào hồ sơ xử lý MRC (HSXLMCR) - Dán barcode vào HSXLMCR Ghi chi tiết cần thiết vào HSXLMCR - Hàn dây túi thu thập MCR , cắt bỏ đoạn dây không cần thiết Đặt túi máu CR lên máy trộn (orbital mixer), trộn phút - Đưa túi MCR vào clean bench, dùng gòn tẩm cồn 75% lau bên túi máu - Gắn injection plug vào miệng túi máu - Dùng ống chích 1ml, kim 18G rút 0,5ml cho vào lọ cấy vi nấm - Dùng ống chích 1ml, kim 18G rút 0,8ml cho vào lọ cấy vi trùng - Dùng ống chích 5ml, kim 18G rút 4ml máu cho vào :  0,5ml  microtube để thử HLA  0,5ml  tube thử huyết đồ  0,5ml  tube phân loại ABO/Rh  2,5ml  tube thử HBsA g, HCV, CMV… - Cân lại (trừ bì) ghi trọng lượng vào mục Pre HSXLMCR Lấy trọng lượng Pre chia = thể tích HES cần dùng, ghi vào HSXLMCR phần lượng HES (Pre/5) - Dùng ống chích 20ml, kim 21G bơm HES vào túi thu thập MCR Trộn túi máu máy trộn từ 10 đến 15 phút Quay ly tâm lần I theo tiêu chuẩn 150G, phút, 100C (ACC 9, Dec 0) Để tính trọng lượng RBC cần thêm vào, theo bảng : Liều lượng HES < 20ml 20ml – 29ml 30ml – 39ml ≥ 40ml - Lượng RBC cần dùng 17g 18g 19g 20g Đưa dụng cụ ép tay plasma vào clean bench, cân điện tử, chuẩn bị túi xử lý (đóng khoá cần thiết) - Sau ly tâm xong, nhẹ nhàng đưa túi MCR treo vào bàn ép clean bench Gắn nối đầu kim túi xử lý vào túi MCR, đặt túi xử lý vào cân điện tử, ép túi MCR từ từ nhẹ nhàng để lấy toàn phần huyết tương ngăn cách với phần HC lắng(RBC) Ép phần RBC vừa đến miệng túi xử lý, bấm ON cân điện tử để tính trọng lượng RBC cần dùng Khi cân đạt đủ trọng lượng RBC cần thiết Mở bàn ép, trả phần RBC đọng đoạn dây vào lại túi MCR Hàn cắt rời túi MCR khỏi túi xử lý - Cân trọng lượng túi xử lý vừa thu thập tế bào, trừ bì, ghi vào Pre HSXLMCR Lấy trọng lượng Pre trừ 24,9g (trọng lượng cần đạt để lưu trữ túi đông lạnh BioArchive) = trọng lượng plasma lấy (ghi vào mục PLASMA HSXLMCR) - Từ túi thu thập MCR Dùng ống chích 5ml + kim 18G rút 5ml RBC cho vào cryotube, lưu trữ -800C 2.2) Tập trung tế bào (giai đoạn POST) : - Quay ly tâm lần II theo tiêu chuẩn : 400G, 10 phút, 100C (Acc 0, Dec 0) - Sau ly taâm, nhẹ nhàng treo túi xử lý vào dụng cụ ép plasma tự động Đồng thời, đặt túi transfer (chứa plasma) lên cân điện tử Ép từ từ tế bào túi xử lý sang túi transfer, plasma vừa đến miệng túi transfer, bấm ON cân điện tử để mặt theo dõi trọng lượng plasma lấy có yêu cầu không; mặt khác kiểm tra dụng cụ ép tự động có đạt tiêu chuẩn mong muốn hay không - Sau lấy đủ trọng lượng plasma theo tiêu chuẩn, trả lại phần plasma đọng đoạn dây trở lại vào túi xử lý Hàn cắt rời túi transfer Dùng ống chích 5ml , rút 5ml huyết tương cho vào cryotube 5ml, lưu trữ -800C - Cân trừ bì túi xử lý, ghi vào post HSXLMCR Trộn đều, dùng ống chích 1ml, kim 18G rút 0,3ml máu :  0,1ml cho vào microtube, thử Colony Assay  0,2ml cho vào tube thử huyết đồ - - - Cho túi xử lý vào tủ lạnh 40C, 10 phút Dùng ống chích 20ml kim 18G rút DMSO (6ml), cho vào tủ lạnh 40C, 10 phút Sau 10 phút, gắn ống chích DMSO nối vào túi xử lý đặt túi vào gel pack (luôn đặt tủ lạnh 40C) cột dính lại Đặt gel pack có túi xử lý lên orbital mixer trộn đều, ống chích DMSO gắn vào bơm tự động, bật Start cho bơm hoạt động với tốc độ 24ml/giờ Dán barcodes nhãn vào túi đông lạnh canister Sau bơm DMSO vào túi xử lý đủ thể tích cần thiết, lấy túi xử lý khỏi gel pack, hàn cắt rời dây nối ống chích Đưa túi xử lý vào clean bench rút mẫu :  Dùng ống chích 1ml kim 18G rút 0,2ml cho vào lọ cấy vi nấm  Dùng ống chích 1ml kim 18G rút 0,3ml cho vào lọ cấy vi trùng  Dùng ống chích 3ml kim 18G rút 2ml cho vào cryotube 2ml, ống 1ml, lưu trữ tank chứa nitrogen lỏng Chuyển toàn tế bào từ túi xử lývào túi đông lạnh (frozen bag) Tuyệt đối tránh bọt khí thực nhanh vòng phút Hàn cắt rời túi xử lý, hàn đoạn cần thiết túi frozen dụng cụ AOS Cân trừ bì, ghi vào post phần đơn vị lưu trữ đông lạnh HSXLMCR Cho vào túi overwrap, hàn lại máy hàn overwrap Cho vào canister cẩn thận kiểm tra barcode cho phù hợp chuyển đến Bio Archive để lưu trữ Vệ sinh, lau clean bench lại cồn 75%, bật đèn cực tím trước rời khỏi phòng xử lý Quy cách sử dụng Danh mục Số lượng Đơn vị máu cuống rốn thu thập ( đạt tiêu chuẩn) Bộ túi xử lý hệ thống kín (1 túi chiết tách, túi đông lạnh, túi chuyển plasma) Injection plug Canister Túi overwrap chích 20ml Kim 18G Kim 20G Gòn cồn tiệt khuẩn 75% Kéo Cryotube 2ml Cryotube 5ml Microtube 01 túi Dụng cụ thuốc thử (hàng tiêu thụ) Bảng đính kèm 1: 01 02 01 caùi 01 caùi 02 caùi 09 caùi 01 caùi 01 hộp 02 02 02 02 Trang thiết bị ng nghiệm 5ml HESPAN (6% hetastarch 0,9% NaCl) DMSO/Dextran40 (6ml/lọ) 100%DMSO 10% Dextran 40 Lọ cấy vi trùng Lọ cấy vi nấm Clean bench Máy ly tâm lạnh Tủ lạnh 40C Máy trộn orbital Máy ép tự động Bơm tiêm tự động Cân điện tử 04 20ml/ống 01 lọ 3,5 ml/túi 3,5 ml/túi 02 lọ 02 lọ 01 buồng 01 01 01 01 01 Dụng cụ hàn dây Dụng cụ hàn túi overwrap Seal Jig (ThermoGenesis) Dụng cụ ép plasma Dụng cụ mở canister Đồng hồ bấm giây Ice pack 01 caùi 01 caùi 01 caùi 01 caùi 01 caùi 01 02 miếng 02 PHẦN PHỤ LỤC SỐ KỸ THUẬT LƯU TRỬ MÁU CUỐNG RỐN SAU XỬ LÝ ( Bản dịch từ quy trình dự trữ đông lạnh ngân hàng MCR Tokyo, Nhật bản(4-2000) MỤC ĐÍCH : Nhằm đảm bảo trì an toàn liên tục chất lượng túi máu cuống rốn (MCR) đông lạnh Ngân hàng máu cuống rốn PHẠM VI : Phạm vi phương pháp nhằm làm đông lạnh túi MCR sau xử lý, chiết tách đem lưu trữ, bảo quản vào ni tơ lỏng NHÂN VIÊN THỰC HIỆN : Là người huấn luyện thích hợp chấp thuận Giám đốc Ngân hàng Máu cuống rốn thực phương pháp THỜI GIAN THỰC HIỆN : Tiến hành sau hoàn tất xong giai đoạn chiết tách túi MCR ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN : Tại phận Xử lý tế bào thuộc Ngân hàng Máu cuốâng rốn PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH : Cách sử dụng BioArchive system : 1/ Trước khởi động BioArchive System, phải đảm bảo nguồn điện kết nối với hệ thống Tuyệt đối không trực tiếp sờ mó vào trục trặc, hỏng hóc có nguồn điện qua ( xem sách hướng dẫn cách vận hành N2 BioAchive system, trang 37)  Nhắp chuột vào “ BioArchive” nằm bên trái hình máy vi tính Nhắp tiếp vào “Login” Tại mục “User ID” cửa sổ Login, gõ tên người vận hành Tại mục “Password”, gõ mật mã người vận hành 2/ Bắt đầu tiến hành làm lạnh đơn vị MCR sau nhận hồ sơ xử lý nhân viên chiết tách xử lý mẫu ( dựa theo sách hướng dẫn cách vận hành N2 BioArchive System, trang 44 45)  Đặt canister MCR vào CRF  Gắn CRF vào cổng CRF phần BioArchive sau kiểm tra hình máy vi tính, mục “Motion System”, Description tình trạng “Idle”  Đợi hệ thống BioArchive tự động đọc mã số (ID) canister ( khoảng phút)  Cẩn thận kiểm tra lại mã số xuất cửa sổ thông tin cổng nhập mẫu phải phù hợp mã số dán hồ sơ xử lý  Nhắp vào “BioArchive” , chọn mục “Store” phía góc trái hình  Sử dụng scanner để đọc mã số hồ sơ xử lý MCR nhằm kiểm tra xác định xác mẫu phù hợp nằm CRF  Kiểm tra mã số hình thay đổi dãy mã số MCR  Quá trình hoàn tất đông lạnh mẫu ni tơ lỏng biểu thị từ đèn màu đỏ chuyển sang màu xanh CRF hình máy vi tính xuất “ Empty after strore” màu xanh Bấy giờ, kéo CRF khỏi cổng gắn trở vị trí cũ giá có gắn quạt thổi khô 3/ Sau tất đơn vị máu cuống rốn hoàn tất việc lưu trữ BioArchive, in tất biểu đồ đông lạnh gắn vào hồ sơ xử lý phù hợp ( tham khảo tài liệu hướng dẫn cách vận hành BioAchive System , trang 54 55)  Nhắp chuột vào mục “Report” bên trái hình  Nhắp tiếp vào mục “Sample history”, chọn mục “Current Freeze Graphs” bảng “Report Type” Dùng scanner để đọc mã số hồ sơ MCR Nhấn OK để in 4/ Thoát khỏi hệ thống sau hoàn thành xong thao tác cần thiết Tiến hành đông lạnh mẫu -800C : 1/ Nhận mẫu từ nhân viên chịu trách nhiệm xử lý tế bào, gồm mẫu : khối hồng cầu (5ml/tube), huyết tương (5ml/tube), tube LC ( tube 0,5ml, tube 1ml) 2/ Lấy mẫu khối hồng cầu huyết tương đặt vào giá lưu trữ -800C 3/ Các tube LC cho vào hộp nhựa đặc biệt đưa vào lưu trữ đêm 800C 4/ Ghi vào hồ sơ thời gian bắt đầu đông lạnh mẫu 6.3 Bảo quản lạnh mẫu ni tơ lỏng : 1/ Sau đêm đông lạnh , lấy mẫu LC khỏi tủ -800C đưa vào lưu trữ bình ni tơ lỏng Ghi rõ vào hồ sơ vị trí thời gian lưu trữ Các mẫu LC dành cho việc kiểm tra loại xét nghiệm trước ghép 2/ Các mẫu khối hồng cầu huyết tương đặt vào vị trí lưu trữ tủ lạnh -800C Ghi vào hồ sơ vị trí lưu trữ 3/ Chuyển hồ sơ xử lý đến nhân viên chịu trách nhiệm kiểm tra, xem xét lại Bảng đính kèm : trang thiết bị, dụng cụ cần thiết Quy cách sử dụng Lâu dài Tiêu thụ Thứ tự Danh mục Số lượng Hộp nhựa styrene BioArchive System Tủ lạnh -800C Mẫu nghiệm Cryo box cho LC Giá sắt cho khối hồng cầu huyết tương 1 đợt 1 PHẦN PHỤ LỤC SỐ CÁC BIỂU MẪU THU THẬP, XỬ LÝ , LƯU TRỮ VÀ THU THẬP KẾT QUẢ MÁU CUỐNG RỐN PHIẾU THU THẬP DỮ LIỆU ĐƠN VỊ MÁU CUỐNG RỐN I/ Hành chánh: Số thứ tự: Mã số MCR: Họ ,tên mẹ: Năm sinh: Ngày sinh em bé: Số hồ sơ bệnh án mẹ: Số nhà: Đường phố: Phường, xã: 10 Quận, huyện: 11 Tỉnh, thành phố: 12 Trọng lượng: II/ Xử lý MCR: Ngày thu thập: Thể tích mcr, pre : Ngày xử lý: Người xử lý: Mẫu pre test: Thể tích Pre: Thể tích Pre: Post test: Thể tích chất bảo quản DMSO: 10 Thể tích LC: 11 Thể tích thử vi khuẩn: 12 Thể tích post : 13 Thể tích sau cùng(lưu trữ): 14, Giới tính: GHI CHÚ III/ Kết xử lý: WBC (pre): WBC (post): HLA-A: HLA-B: HLA-DRB1: Phaân loại ABO: Phân loại Rhesus: Vi khuẩn pre: Vi khuaån post: 10.HBsAg: 11 HCV Ab: 12 Anti HIV1+2: 13 Anti HTLV1: 14 Điện di Hb: IV/ Kết nuối cấy, CD34+: Số lượng tế bào CD34/ml: CFU-Vol plating: CFU- BFU-e (dish 1): CFU- BFU-e (dish 2): CFU- GM(dish 1): CFU- GM (dish 2): CFU- Mix (dish 1): CFU- Mix (dish 2): CFU total (dish 1): 10 CFU total (dish 2): 11 Tế bào sống(%): TP.Hồ Chí Minh, ngày…….tháng… năm…… Người thu thập kết PHIẾU KIỂM TRA ĐĂNG KÝ CHO MÁU CUỐNG RỐN Số thứ tự 10 11 12 13 14 Mục kiểm tra Đạt yêu cầu Không đạt yêu cầu Xem xét lại Ghi Sự đồng ý khai báo Khảo sát sức khỏe bà mẹ (sản phụ) qua vấn Tiền sử gia đình Tiến trình chuyển sanh nở Máu cuống rốn ( thử nghiệm máu cuống rốn) Máu bà mẹ ( xét nghiệm máu mẹ) Bảo quản máu mẹ Đếm tế bào máu CFU (kết đếm colony) CD34 ( xét nghiệm đánh giá CD34+) Sự vô trùng ( kết xét nghiệm cấy vi khuẩn) Kết công nhận việc kiểm tra Hồ sơ xử lý MCR Hồ sơ trình đông lạnh TP.Hồ Chí Minh, ngày…….tháng… năm…… Người kiểm tra PHIẾU KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM MẪU MÁU CUỐNG RỐN Mã số máu cuống rốn 1) VI TRÙNG, VI NẤM Lô số Nơi sản xuất Ngày cấy Ngày kq Kết Vi trùng PRE POST Vi nấm PRE POST 2) ĐẾM TẾ BÀO PRE Số lượng BC Tỉ lệ HC nhân Tỉ lệ BC sau rã đông % POST x 10 / l % Tổng số tế bào nhân x 103/ l % x 108 3) CFU ASSAY: Thuốc thử Pre Methocult GF H4434V Post Methocult GF H4434V Thể tích/đóa Pre 5 l Coâng ty Loâ Post 1 l / 2 l Ngày thực 3) KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO ( CFU ASSAY) Ngày đếm CFU BFU Pre Post CFU-GM CFU-Mix Đóa Đóa Độ tập trung/ l Đóa Đóa Độ tập trung/ l Tỉ lệ CFU sau rã đông % Tổng số CFU-GM Tổng số PHIẾU THU THẬP TẾ BÀO MÁU CUỐNG RỐN ****** SỐ PHIẾU:……………………./…………./ 200… Mã số bệnh án Thời gian thực ……… g……./…/ 200… Nhân viên thu thập: I TÌNH TRẠNG SẢN PHỤ: - Họ tên sản phụ:……………………………………………………………………………………… Nămsinh……………… - Địa chỉ: số , đường……………………………………………………Phường/xã …… - Quận/huyện , thành phố/thị xã ……………………………….Điện thoại .…… -Tiền thai kỳ :………………………………………………………………………………………………PARA:………………… -Tiền bệnh tật (nếu có) :………………………………………………………………………………………………………… - Các xét nghiệm trước thu thập: * HbsAg  * Anti HBc  * Anti HIV  * Anti HTLV1  * Anti HBs  * Anti HCV * VDRL  - Tình trạng lâm sàng lúc thu thập : * Tuổi thai tuần Nhiệt độ * Tình trạng ối : * Bình thường  - Lấy máu xét nghiệm (…………… C Cân nặng * Vỡ ối ) : * Có  kg * Rỉ ối  * Không  cc II THAI NHI : - Giới tính : * Nam  - Cân nặng thai nhi : - Cân nặng túi thu thập : * Nữ  gram * Cân nặng sau thu thập : gram III THU THẬP LẤY MÁU CUỐNG RỐN SAU XỔ NHAU : - Qua phẫu thuật :  - Qua đường :  gram PHIẾU THEO DÕI QUI TRÌNH XỬ LÝ MÁU CUỐNG RỐN Mã số đơn vị MCR : ID: Ngày lấy Cân lượng MCR : Giờ lấy Nơi lấy Nhân viên lấy Pre (1) ……………gram + 28ml CPD Ngày xử lý Giờ xử lý ( trừ bì …… gram) Nơi xử lý Nhân viên xử lý Ngân hàng MCR TP.HCM Nơi Túi thu thập Túi xử lý sản xuất Túi đông lạnh DMSO Dextran HES Thermogenesis Rút mẫu máu xét nghiệm ban đầu ( Pre) : 4ml + 1ml+0.5ml CD34 H.đồ Đ.Di Hb ABO-Rh HLA Virus Nuôi cấy Vi trùng 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 3ml 0.3ml 0.5ml Cân lượng MCR : Pre (2) ……………gr ( trừ bì …… gr) Lượng HES ( Pre (2)/5):… ml Quay ly tâm lần 1: 100C, 860 rpm(150G), phút, Acc 9, Dec Lượng hồng cầu thêm vào:………….gr Rút mẫu xét nghiệm: Huyết tương lấy ra:……………… gr Lưu trữ -800C ( HC) Lưu trữ -800C ( HT) 5ml 5ml HC: 5ml, HT: 5ml Cân lượng MCR : Pre (3) ……………gr ( trừ bì 59 gr) Quay ly tâm lần 2: 100C, 1410 rpm(400 G), 10 phuùt, Acc 0, Dec Cân lượng MCR : Post (4) ……………gr Rút mẫu xét nghiệm: (post) : 0.7ml ( trừ bì 37 gr) Huyết đồ CD34 Nuôi cấy khúm 0.2ml 0.3ml 0.5ml Bơm DMSO : 6ml ( tốc độ : 24ml/ ) Rút mẫu xét nghiệm: ml Cấy vi trùng 0.5ml Cân lượng MCR Post (5) …………………gr Lưu trữ LC ( -1960C) 1ml 0.5ml ( trừ bì gr ) PHẦN PHỤ LỤC SỐ QUI TRÌNH KỸ THUẬT NUỘI CẤY KHÚM TẾ BÀO (COLONY ASSAY) VỚI METHYLCELLULOSE MEDIUM MỤC ĐÍCH: Nhằm đánh giá tế bào gốc tạo máu để giảm thiểu tối đa sai sót kỹ thuật chuyên môn đếm tế bào xác PHẠM VI: Tiến hành thực đếm colony assay tế bào gốc chiết tách từ máu cuống rốn cách xác ghi kết vào hồ sơ để lưu giữ NHÂN VIÊN THỰC HIỆN: Kỹ thuật viên huấn luyện, đào tạo Ngân hàng Máu Cuống Rốn phân công Giám Đốc Bệnh Viện Truyền Máu Huyết học chịu trách nhiệm thực kỹ thuật THỜI GIAN THỰC HIỆN: Ngay sau mẫu chuyển từ phận chiết tách tế bào bên ngoài, đồng thời nhận kết huyết đồ PRE POST ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN: Tại Bệnh Viện Truyền Máu Huyết học, sở II, Khoa Miễn Dịch, Phòng Máu Cuống TIẾN HÀNH: A.CHUẨN BỊ: 1/ DỤNG CỤ, MÁY MÓC: - Clean bench - Máy ủ CO2 - Kính hiển vi lộn ngược - Máy trộn Vortex - Micro pipet - 02 ống chích 1ml - 02kim 16G 18G - 06 đóa petri d=35mm - 02 đóa petri d=100mm - 40 ốáng nghiệm 10ml có nắp ,tiệt trùng - 01 kim Catheran - 01ống chích 3ml 2/ THUỐC THỬ: - tube 2,5ml Methylcellulose medium ( MethoCult GF H4434V) - Nước cất B.TIẾN HÀNH : Kỹ thuật tiến hành clean bench kỹ thuật viên phải thực thao tác vô trùng tuyệt đối theo bước kỹ thuật 1/ MethoCult GF H4434V đựng lọ 100ml phân phối ống chích 3ml + kim Catheran vào tube nhựa 10ml với thể tích 2,5ml lưu trữ tủ lạnh–200C để sử dụng dần 2/ Mẫu máu cuống rốn giai đoạn Pre: * Chuẩn bị: - 01 tube 2,5ml MethoCult GF H4434V - 01 đóa petri d=100mm - 03 đóa petri d=35mm - Mẫu nghiệm Máu cuống rốn Pre - Bình nước cất plastic có vòi * Thực : - Trộn vortex mẫu nghiệm MCR, dùng micro pipet hút 5l cho vào tube 2,5ml MethoCult GF H4434V Trộn vortex kỹ lưỡng - Dùng ống chích 1ml + kim 18G rút xác 1ml cho vào đóa petri d=35mm Xoay tròn đóa petri để môi trường phủ khắp mặt phẳng - Lập lại động tác tiếp tục cho đóa petri thứ hai - Đặt đóa môi trường vào đóa petri d=100mm , đặt thêm đóa petri (bỏ nắp) thứ ba cho vào khoảng 0,5 ml nước cất (giữ độ ẩm trình ủ) Đậy nắp, ghi cẩn thận mã số mẫu nghiệm ngày thực - Cho đóa môi trường vào tủ CO2 ủ nhiệt độ 370C (0,1), 5% CO2 (0,1) 3/ Mẫu máu cuống rốn giai đoạn Post: Chuẩn bị tiến hành tương tự giai đoạn Pre Nhưng phải tuân thủ điều kiện sau: Số lượng bạch cầu  x 104/l 4 x 104/l Thể tích máu cần dùng cho môi trường 2l 1l 4/ Ghi vào lịch theo dõi colony assay: mã số mẫu nghiệm, thể tích cần dùng, người thực hiện, ngày bắt đầu cấy mẫu, ngày đọc kết (sau 14 ngày , kể từ bắt đầu cấy mẫu) Trong trình cấy mẫu, tuyệt đối hạn chế mở cửa máy CO2 nhằm tránh thay đổi điều kiện cần thiết môi trường Khi cần lấy mẫu từ máy ủ CO2 để đọc kết phải đeo găng xịt cồn 75% sát trùng trước C.ĐỌC KẾT QUẢ: 1/ Xác định phân biệt loại colony: -BFU-e ( Burst Forming Unit-erythocyte) : đơn vị hình thành erythroblast colony từ đến cụm, bao gồm đến 200 erythroblast gọi CFU-E Erythroblast colony 3 cụm , gồm 200 erythroblast gọi BFU-E - CFU-GM (Colony Forming Unit-Granulocyte/Macrophage) : cụm bao gồm 40 granulocyte hoaëc macrophage - CFU-Mix (Colony Forming Unit – Mixed) : cụm bao gồm hồng cầu trưởng thành 20 granulocyte / macrophage/megacaryocyte 2/ Đánh giá colony kính hiển vi quang học lộn ngược: Màu sắc tế bào Số lượng tế bào chứa cụm  tế bào Duy hồng cầu (màu đỏ)  tế bào Duy bạch cầu Bạch cầu + hồng cầu Các loại khác Đánh giá kết 01 BFU-e Không đếm  40 tế bào 01 CFU-GM  40 tế bào Không đếm  20 tế bào bạch cầu CFU-Mix  20 tế bào bạch cầu BFU-E Không đếm D.CẦN GHI NHỚ: 1/ Đọc kết thời gian qui định ( sau 14 ngày) 2/ Trong lúc đọc kết quả, tuyệt đối giữ ổn định bề mặt đóa môi trường vị trí nằm ngang tránh va chạm mạnh gây vữa môi trường 3/ Phải đếm toàn colony cần đánh giá, colony nằm vị trí mặt cong sát rìa đóa 4/ Sử dụng đóa petri d=35mm (loại đóa cấy vi trùng ) Tuyệt đối không sử dụng loại đóa petri dành cho việc cấy tế bào động vật để thay ( nguyên bào sợi dính chặt tăng nhanh số lượng làm ức chế việc hình thành colony tế bào máu) PHẦN PHỤ LỤC SỐ ... Các tế bào gốc đa tiềm đầu tạo máu HSXLMCR : Hồ sơ xử lý máu cuống rốn ICBTR : Tổ chức đăng ký ghép máu cuống rốn quốc tế KN : Kháng nguyên LT – HSC : Tế bào gốc tạo máu dài hạn LT-CIC : Tế bào. .. đây, nhà nghiên cứu đánh giá nguồn tế bào gốc tạo máu để ghép , bao gồm tế bào gốc máu ngoại vi (Pheripheral Blood Stem Cells : PBSCs) tế bào gốc MCR (máu cuống rốn) Cho đến nhiều nghiên cứu chứng... điều chế sản phẩm tế bào gốc từ MCR áp dụng ghép lâm sàng Xuất phát từ điều trình bày trên, tiến hành nghiên cứu ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn Thực nghiên cứu này, mong muốn