Nghiên cứu ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HUỲNH NGHĨA NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XỬ LÝ TẾ BÀO GỐC MÁU CUỐNG RỐN CHUYÊN NGÀNH : BỆNH HỌC NỘI KHOA Mã số: 3 01 31 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP. HỒ CHÍ MINH - Năm 2007 Công trình được hoàn thành tại : Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học : 1. PGS. Trần Văn Bé 2. PGS. TS. Trần Thò Liên Minh Phản biện 1 : PGS.TS. Nguyễn Thò Thu Hà Bệnh viện TW QĐ 108 Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Anh Trí Viện Huyết học Truyền máu Trung ương Phản biện 3: TS. Nguyễn Tấn Bỉnh Bệnh viện Truyền máu – Huyết học TP. Hồ Chí Minh Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước họp tại : Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Vào hồi 8 giờ 30 phút , ngày 02 tháng 12 năm 2007 Có thể tìm luận án tại: - Thư viện quốc gia Việt Nam - Thư viện khoa học tổng hợp TP. Hồ Chí Minh - Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Huỳnh Nghóa (2004) , “Tình hình thu thập, sàng lọc và xử lý máu cuống rốn tại bệnh viện Truyền máu-Huyết học TP. Hồ Chí Minh”, Y học Việt Nam, tập 299(6) , tr. 5-12. 2. Huỳnh Nghóa, Trần Quốc Dũng , Lê Thò Dòu Hiền (2004) , “Bước đầu đánh giá chất lượng sản phẩm tế bào gốc từ máu cuống rốn bằng các kỹ thuật đếm tế bào CD34+ và nuôi cấy khúm tế bào”, Y học Việt Nam, tập 299(6) , tr. 36-40. 3. Tran van Be, Tran van Binh, Nguyen tan Binh, Huynh Nghia, Bao Minh Hien (2006), “Current status bone marrow transplantation at Blood transfusion and Hematology Hospital, HoChiMinh City, VietNam“, The 11 th Congress of the Asia Pacific Bone Marrow Transplantation, Nagoza, Japan. 1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề : Cho đến nay, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh máu cuống rốn (MCR) có thể thay thế tủy xương dùng để ghép cho các bện lý hệ tạo máu do các ưu điểm sau : (1) Dễ tiến hành thu thập, (2) Tỉ lệ nhiễm virus thấp, nhất là CMV, (3) Có nhiều người cho và thời gian tìm phù hợp HLA rút ngắn lại,(4) Dung nạp miễn dòch tốt, ngay cả không phù hợp HLA từ 1-3 kháng nguyên,(5) Tần xuất GVHD thấp và nhẹ, dễ dàng điều trò sau ghép. Từ các lợi điểm trên mà các nước trên thế giới cũng như các nước trong khu vực đã tiến hành tổ chức thu thập, xử lý và lưu trữ tối đa các mẫu MCR bằng các công nghệ tiên tiến để sẵn sàng cho điều trò cho bệnh nhân. Tại Việt Nam, việc tìm hiểu các yếu tố trong MCR ở các sản phụ người Việt Nam đã được Trung tâm Truyền máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh thực hiện và kết quả cho thấy MCR của các sản phụ người Việt Nam đủ tiêu chuẩn của một sản phẩm sử dụng trong ghép để thay thế cho các nguồn tế bào gốc từ tủy xương hoặc máu ngoại biên. Do vậy, để tiến tới xây dựng một ngân hàng MCR tại TP. Hồ Chí Minh đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế và thật sự mang lại lợi ích cho cộng đồng, , chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn . Thực hiện nghiên cứu này, chúng tôi mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây : 1. Xây dựng và hoàn thiện quy trình tuyển mộ, sàng lọc người cho trước thu thập MCR 2. Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình kỹ thuật thu thập MCR sau giai đoạn xổ nhau. 2 3. Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình xử lý MCR bằng kỹ thuật có chất trầm lắng HES (Hydroxy Ethyl-Starch). 4. Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình lưu trữ sản phẩm tế bào máu gốc MCR ở nhiệt độ –196 0 C. 5. Chuẩn hóa và hoàn thiện các xét nghiệm sinh học: đếm số lượng tế bào nhân , số lượng tế bào CD34 (+), nuôi cấy khúm tế bào , đếm tế bào sống và các xét nghiệm sàng lọc vi khuẩn, virus theo các giai đoạn để đánh giá chất lượng sản phẩm tế bào gốc đạt tiêu chuẩn. 6. Đánh giá hiệu quả ứng dụng sản phẩm tế bào gốc MCR được xử lý trong thực hành ghép tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh. 2. Tính cấp thiết của đề tài : Tổng kết 10 năm điều trò bệnh về máu tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh cho kết quả : Các bệnh lý ác tính chiếm: 50,24% trong tổng số bệnh nhân. Trong số này chỉ đònh điều trò bằng ghép khoảng 20% (700 bệnh nhân). Nhưng vì không tìm được người cho phù hợp để ghép, do đó dò ghép tuỷ xương cho 3 bệnh nhân và 18 bệnh nhân tự ghép tế bào gốc máu ngoại vi mới chỉ bằng 3% số bệnh nhân có chỉ đònh điều trò bằng ghép. Các bệnh Hemoglobin và bệnh Thalassemia chiếm 12% tổng số bệnh nhân . Trong loại bệnh này chỉ có dò ghép mà không có tự ghép , trong đó tất cả các bệnh nhân thể nặng của bệnh Thalassemia đều có chỉ đònh ghép, nhưng chỉ mới dò ghép được 2 bệnh nhân. Nguyên do không thể tìm người cho phù hợp là vì anh em đồng huyết thống thì rất ít, mà người cho ngoài huyết thống thì chúng ta chưa thành lập được cơ sở dữ liệu và ngân hàng tuỷ quốc gia, cũng như chưa gia nhập hệ thống truy tìm quốc tế . Do vậy, 3 nếu quan niệm ghép tế bào gốc là phướng pháp điều trò tối ưu thì nhu cầu tìm một nguồn tế bào khác khả thi như MCR để xử lý tạo thành một sản phẩm trò liệu, tồn trử đông lạnh lâu dài trong một ngân hàng, sẵn sàng để truy tìm và ghép cho bệnh nhân là nhu cầu bức thiết hiện nay, phù hợp với đường hướng hiện đại hoá nền y học nước nhà. 3. Những đóng góp mới của luận án : - Xây dựng và hoàn thiện các bước tuyển chọn –sàng lọc người cho MCR trước khi thu thập - Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình thu thập MCR sau giai đoạn xổ nhau, bên cạnh đó đã rút ra nhiều kinh nghiệm trong tổ chức và phối hợp giữa nhân viên chuyên môn và người thu thập MCR. Chọn lựa thể tích MCR ≥ 60ml và điện di Hemoglobin trước xử lý MCR là thích hợp để tránh lãng phí do số lượng tế bào nhân thấp và mang mầm bệnh di truyền. - Đã áp dụng và hoàn thiện quy trình xử lý MCR có chất HES để tạo sản phẩm tế bào gốc ổn đònh - Hoàn thiện quy trình lưu trữ đông lạnh tự động tế bào gốc trong Nitơ lỏng -196 0 C. Đây là các kỹ thuật công nghệ sinh học tiến tiến và có ý nghóa khoa học cao. - Chuẩn hoá và hoàn thiện các xét nghiệm mới để đánh giá số lượng và chất lượng của sản phẩm MCR bao gồm : đếm tế bào CD34+, tế bào sống, nuôi cấy khúm tế bào được lồng ghép vào trong các quy trình thu thập, xử lý và lưu trữ đông lạnh MCR - Hoàn thiện quy trình dò ghép tế bào MCR cho các bệnh nhân được chẩn đoán bệnh máu ác tính và β Thalassemia thể nặng. 4 Đóng góp lớn nhất của đề tài là đã chuẩn hóa và hoàn thiện các quy trình của một ngân hàng MCR đạt tiêu chuẩn quy ước và sản phẫm tế bào gốc MCR đảm bảo an toàn cho cuộc ghép. 4. Bố cục của luận án : Luận án gồm 147 trang, bao gồm phần mở đầu 4 trang, tổng quan tài liệu 43 trang, đối tượng và phng pháp nghiên cứu 23 trang, kết quả nghiên cứu 33 trang, bàn luận 40 trang, kết luận 2 trang và kiến nghò 2 trang. Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử phát triển : Năm 1974, Konedtzon – Ogawa-cs đã chứng minh có sự hiện diện tế bào gốc trong MCR. Năm 1984 – 1985, Bosey Edward, Broxmeyer-cs thực nghiệm ghép MCR trên chuột, năm 1988, Gluckman và cs thực hiện ghép MCR đầu tiên cho em bé mắc bệnh Fanconi thành công . Sau năm này, đã có rất nhiều các nghiên cứu về sinh học, miễn dòch trên thế giới về tế bào gốc của MCR , từ năm 1991-1997, hàng loạt các trường hợp ghép MCR được thực hiện trên trẻ em và người lớn thành công ở các mức độ khác nhau. Từ 1998 cho đế nay, trên thế giới cũng như trong khu vực đã có nhiều ngân hàang MCR của nhà nước và tư nhân được thành lập để thu thập, xử lý và lưu trữ lâu dài MCR để ghép , và cho đến nay MCR được xem là nguồn tế bào gốc thay thế cho tuỷ xương để ghép. 1.2 Tế bào gốc sự hình thành và phát triển : Chúng được hình thành từ trung bì phôi thai ở túi noãng hoàng , từ ngày thứ 18.5 đã có hồng cầu và tế bào CD34+, ngày thứ 24 – 34 tế bào tiền thân dòng lymphô và dòng tủy . Từ tuần lể thứ 7, gan là nơi tạo máu , tháng thứ 3 lách là nơi tạo máu và từ tháng thứ 4- thứ 5, tủy xương là nơi tạo máu cho đến tuổi trưởng thành . Đặc tính tạo dòng 5 của tế bào gốc tạo máu là các tế bào đa năng dần dần tự thay thế để chuyển sang giai đoạn biệt hóa cao hơn và đồng thời mất dần tính đa năng của chúng. Có 2 loại tế bào gốc tạo máu : (1) Tế bào gốc tạo máu dài hạn : số lượng ít , non, chưa biệt hóa mang dấu ấn CD34+, Thy+ và Lin-, chúng có khả năng tự tái tạo và biệt hóa cao. (2) Tế bào gốc tạo máu ngắn hạn : trưởng thành, có khả năng tái tạo trong 8 tuần và sinh ra các dưới nhóm CFU-E, CFU- GEMM, và CFU-L. 1.3 Máu cuống rốn : Đặc điểm sinh học : Chứa nhiều tế bào gốc , gấp 8 lần so với tủy xương . Tần xuất tế bào gốc MCR/ml : BFU – E:8.10 3 , CFU – GM : 13-24. 10 3 , CFU – GEMM: 1-10. 10 3 . Các tế bào đầu tiên trong nuôi cấy lâu dài là CFU ( 5 tuần ) biệt hóa thành 1/13.000 TBĐN và ( 8 tuần ) là 1/34.000 TBĐN. Tế bào gốc MCR mang tế bào CD34+ cao, khoảng 1% TBĐN, tế bào CD34+HLADR- và CD34+38- của MCR cao hơn tủy xương. Đặc điểm miễn dòch học : MCR có khả năng dung nạp miễn dòch cao hơn tủy xương vì tế bào lympho CD3 ít, tế bào NK thấp và đặc biệt là tế bào Lympho T mang hoạt tính thấp ( ít tế bào CD4,CD8; điểm tiếp nhận CCR5 cytokin thấp và IL10 cao) vì vậy phản ứng GVHD thấp nhưng GVL vẩn còn hiện hữu. 1.4 Thu thập, xử lý và lưu trữ tế bào gốc : là các bước chính yếu trong tổ chức và xây dựng các ngân hàng MCR. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu vế các quy trình này, tựu trung lại bao gồm các quy trình sau: (1) quy trình sàng lọc và chọn lựa người cho MCR, (2) quy trình thu thập MCR trước và sau xổ nhau, các tiêu chuẩn quy ước để thu thập,(3) quy trình xừ lý MCR bao gồm : quay ly tâm “ Top and Bottom”, có thêm chất trầm lắng (HES), phương 6 phạp lọc, các quy trình này có các lợi điểm khác nhau .(4) quy trình lưu trữ đông lạnh tế bào gốc MCR, cho đến nay hầu hết các ngân hàng đều chọn hế thống đông lạnh MCR với Nitơ lỏng (- 196 0 C), hệ thống đông lạnh có kiểm soát tốc độ.(5) Đặc biệt các xét nghiệm đánh giá về số lượng và chất lượng máu cuống rốn được lồng ghép vào các quy trình trên để đảm bảo tối ưu sản phẩm MCR cho lưu trử lâu dài. Các xét nghiệm bao gồm: Đếm tế bào nhân, tế bào CD34+, tế bào sống, sàng lọc vi khuẩn, virus, sàng lọc bệnh hemoglobin, và nuôi cấy khúm tế bào. 1.5 Ứng dụng ghép tế bào gốc máu cuống rốn : Cho đến nay đã có nhiều ngân hàng MCR được thành lập, tại Châu Á tính đến 5/2005 đã có trên 90.000 mẫu MCR được lưu trữ và 625 mẫu MCR được ghép cả người lớn và trẻ em. Trên thế giới, cho đến 3/2006 đã có trên 100.000 mẫu được lưu trữ và 2530 trẻ em và 1697 người lớn đã ghép MCR. 70 bệnh lý thuộc bệnh máu ác tính và di truyền bẩm sinh được sử dụng MCR để điều trò . Sau 3 năm theo dõi ghép MCR đối với trẻ em tỉ lệ sống không bệnh từ 48-78%, người lớn 26-53%. Các biến chứng sau ghép như GVHD thấp, tuy nhiên tỉ lệ nhiễm trùng sau ghép cao hơn ghép tủy xương và tế bào gốc máu ngoại vi bởi vì thời gian mọc bạch cầu hạt chậm hơn. Chương 2. ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng : - Máu cuống rốn được thu thập từ những sản phụ theo tiêu chuẩn chọn lựa để xử lý thành các đơn vò tế bào gốc MCR đạt tiêu chuẩn, các mẫu này được lưu trữ lâu dài để sử dụng cho ghép. -Các bệnh nhân bệnh bạch cầu cấp dòng tủy, bạch cầu cấp dòng lymphô nhóm nguy cơ cao đạt lui bệnh sau hoá trò và bệnh 7 βThalassemia thể nặng , tuổi từ 5 đến 15 tuổi , có các chức năng của tim, phổi, gan, thận bình thường. 2 2 Phương pháp nghiên cứu : Chúng tôi áp dụng phương pháp thực nghiệm mô tả và ghép thử nghiệm. Các bước nghiên cứu được thiết kế như sau : 2.2.1 Các sản phụ được sàng lọc và chọn lựa thu thập theo tiêu chuẩn : lâm sàng bình thường và xét nghiệm virus B,C,HIV, VDRL âm tính. 2.2.2 Các mẫu máu cuống (MCR) được thu thập từ các sản phụ trên sau giai đoạn xổ nhau bằng hệ thống kín, vô trùng. 2.2.3 Các mẫu MCR đạt tiêu chuẩn (≥ 60ml + điện di hemoglobin (-) được chọn lựa xử lý . Các mẫu MCR được xử lý bằng kỹ thuật quay ly tâm có chất Hydroxyethyl starch (HES) 2.2.4 Các mẫu MCR được lưu trữ hệ thống đông lạnh tự động với Nitơ lỏng ở nhiệt độ -196 0 C. 2.2.5 Các xét nghiệm để đánh giá số lượng và chất lượng của mẫu MCR bao gồm số lượng tế bào nhân, tế bào CD34+, tế bào sống, nuôi cấy khúm tế bào, xét nghiệm sàng lọc vi khuẩn, vi nấm,virus,bệnh di truyền. Các xét nghiệm này được lồng ghép vào các quy trình trên. 2.2.6 Các bệnh nhân được chọn lựa để thực hiện ghép tế bào gốc từ MCR theo quy trình dò ghép tế bào gốc với các bước sau : Điều kiện hóa trước ghép bằng Busulphan và Endoxan, tế bào gốc MCR sau rã đông 37 0 C và được truyền ( ghép) cho bệnh nhân bằng đường tónh mạch trung ương, phòng ngừa thải ghép bằng Methotrexate và Cyclosporin, theo dõi và chăm sóc vô trùng sau ghép. Chương 3. KẾT QUẢ Từ tháng 10/2002 cho đến 10/2005, chúng tôi đã khảo sát sàng lọc trước thu thập và thu thập MCR với kết quả sau: - Tư vấn và sàng lọc trước thu thập ở 486 sản phụ ở BV Từ Dũ. [...]... 2.36 ± 1.97 Sau xử lý Tỉ lệ % giảm tế bào 4.2 >0.05 Nhận xét: Sau xử lý tỉ lệ mất TB CD34+ là 4.2% với( p >0.05) 13 3.3.6 So sánh kết quả đếm TB sống túi MCR trước và sau xử lý Bảng 3.23: Kết quả đếm tế bào sống trước - sau xử lý MCR Số mẫu Tỉ lệ % Tỉ lệ % giảm tế ( n = 57 ) tế bào sống bào sống Trước xử lý 97.6± 1.5 Sau xử lý 95.5± 2.5 p 2.1 >0.05 Nhận xét: Sau xử lý tỉ lệ mất tế bào sống là 2.1 %... (n=960) Tế bào đơn nhân SLTBN 7 p 7 (x 10 ) (x 10 ) Trước xử lý 81.74± 35.10 36.78± 25.73 Sau xử lý 75.01± 37.04 33.23± 24.75 8.2% 9.6% Tỉ lệ % giảm tế bào >0.05 Nhận xét: Tỉ lệ giảm SLTBN, TBĐN là 8.2%, 9.6% ( p>0.05) 3.3.5 So sánh kết quảTBCD34+ túi MCR trước và sau xử lý Bảng 3.22: Kết quả tế bào CD34+ toàn bộ trước và sau xử lý Tế bào CD34 6 + (x 10 ) Trước xử lý 2.26± 1.85 p CD34+ sau xử lý 2.36... 12.15 Tế bào CD34+ (x 103/ml) 9.94± 6.13 36.86± 7.55 3.21 4.54 3.7 Mẫu MCR (n=960) Tế bào nhân (x 106/ml) Trước xử lý Sau xử lý Số lần tăng p 85% (4) Đã chuẩn hoá và hoàn thiện quy trình lưu trữ sản phẩm tế bào gốc được điều chế từ MCR với chất bảo quản DMSO 10% và dự trữ trong Nitơ lạnh -1960C theo quy trình tự động hóa Số mẫu MCR lưu trữ đạt tiêu chuẩn... (g/dL) 9 ( x 10 ) Trước xử lý 81.71± 18.98 297.28 ± 130.83 18.04±5.4 Sau xử lý 24.73± 7.07 117.72±11.26 9.11± 3.2 69.7% 55.41% 50.54% Tỉ lệ % giảm Nhận xét: tỉ lệ giảm thể tích > 60% và loại bỏ hồng cầu > 50% 0.005) (5) Đã chuẩn hóa hoàn thiện quy trình đánh giá số lượng và chất lượng của sản phẩm tế bào gốc từ MCR bao gồm: Các xét nghiệm về số lượng tế bào gốc: Đếm số lượng tế bào nhân, đếm tế bào CD34+ Các xét nghiệm về chất lượng MCR: đếm tế bào sống, nuôi cấy khúm tế bào (BFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM) Các xét nghiệm về cấy vi khuẩn, nấm và các bệnh lây nhiễm... (6) Đã sử dụng sản phẩm TBG MCR được điều chế để ghép cho 5 BN (2 nam, 3 nữ), tuổi 6 - 15 tuổi và mắc bệnh bạch cầu cấp và bệnh Thalassemia Các sản phẩm MCR trong nghiên cứu này so với sản phẩm MCR Tokyo cung cấp không có sự khác biệt (p>0.05) Dựa trên các kết quả trên, chúng tôi đã nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện các quy trình xử lý tế bào gốc MCR của ngân hàng MCR đầy đủ và chặt chẽ thích ứng với... >0.05 3.4 Kết quả nuôi cấy tế bào tạo khúm sau xử lý MCR 3.4.1 Số lượng và kết quả nuôi cấy khúm tế bào sau xử lý : Số mẫu nuôi cấy: 180 mẫu, số mẫu nuôi cấy thu hoạch được: 171 mẫu , 9 mẫu loại bỏ do nhiễm trùng : 4 , do kỹ thuật : 2, môi trường bò hư : 3 mẫu 3.4.2 Kết quả chung các TP khúm mọc sau nuôi cấy tế bào Bảng 3.24 : Kết quả của nuôi cấy khúm tế bào của MCR sau xử lý Mẫu MCR nuôi cấy Trung . hành nghiên cứu ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn . Thực hiện nghiên cứu này, chúng tôi mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây : 1. Xây dựng và hoàn thiện quy trình tuyển mộ,. TBN và tế bào CD34+ sau xử lý Bảng 3.20: Khả năng tăng số lượng tế bào nhân và tế bào CD34 + sau xử lý Mẫu MCR (n=960) Tế bào nhân (x 10 6 /ml) Tế bào đơn nhân (x 10 6 /ml) Tế bào CD34+. MCR trước và sau xử lý Bảng 3.22 : Kết quả tế bào CD34+ toàn bộ trước và sau xử lý Tế bào CD34 + (x 10 6 ) Tỉ lệ % giảm tế bào CD34+ sau xử lý p Trước xử lý Sau xử lý 2.36 ± 1.97 2.26±