nghiên cứu tách chiết enzyme alginate lyase từ vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thủy phân alginate

Mục đích, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của đề tài Mục đích, nhiệm vụ Đề tài nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp alginate lyase cao..

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VÀ ĐỒ THỊ 5

MỞ ĐẦU 5

1 Tính cấp thiết của đề tài 7

2 Mục đích, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của đề tài 8

3 Điểm mới và ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 8

Chương 1 TỔNG QUAN 9

1.1 Tổng quan về rong Nâu [1] 9

1.2 Tổng quan về Alginate 11

1.2.1 Alginate[1][11] 11

1.2.2 Công thức cấu tạo của axit alginic và muối alginate [1],[11] 12

1.2.2.1 Đặc điểm, cấu tạo của Alginic 12

1.2.2.2 Đặc điểm, cấu tạo của các keo Alginate .14

1.2.3 Tính chất của một số loại keo Alginate 15

1.3 Một số nghiên cứu về alginate lyase 18

1.4 Những nghiên cứu về Oligo alginate (OA) 19

1.4.1 Những nghiên cứu trong nước 19

1.4.2 Những nghiên cứu ngoài nước 21

1.5 Tổng quan sơ lược về các phương pháp nghiên cứu 23

1.5.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật[6],[8] 23

1.5.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 23

1.5.3 Phương pháp nghiên cứu hình thái vi sinh vật.[6] 24

1.5.4 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme và thu nhận chế phẩm enzyme[3][4][5][7] 25

1.5.4.1 Phương pháp nuôi cấy 25

1.5.4.2 Thu hồi chế phẩm enzyme 26

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Nội dung nghiên cứu .28

2.2 Các phương pháp nghiên cứu[3][6][7][8] 29 2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 29 2.3.1 Bố trí nghiệm phân lập chủng vi khuẩn trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp algL 29 2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp algL cao 30 2.3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của chủng vi sinh vật được lựa chọn 32 2.3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu dịch enzyme algL từ môi trường sinh khối 33 2.3.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phân cắt các loại Natri alginate khác nhau bằng dung dịch enzyme thu được 34 2.3.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme 35 2.3.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của vi sinh vật và khả năng phân cắt của algL 36 2.3.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất kim loại đến khả năng phân cắt của algL 38

Sơ đồ 2.3.8: Ảnh hưởng của các hợp chất kim loại đến khả năng phân cắt của algL 38 2.3.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL 39 2.3.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tác nhân kết tủa thích hợp để thu hồi algL từ dịch enzyme 40 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Kết quả nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp enzyme algL 41 3.2 Kết quả thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh algL cao 42 3.3 Kết quả thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật đã chọn 44 3.4 Kết quả thí nghiệm phân cắt các loại natri alginate bằng dung dịch

enzyme thu được 45

3.5 Kết quả định danh vi sinh vật 47

3.5.2 Kết quả nhuộm Gram và sinh hóa định danh bằng hệ thống IDS14GNR 48

3.5.3 Kết quả giải trình tự gene 16S trên máy CEQ 8000 và tra cứu trên BLAST SEARCH 49

3.6 Kết quả thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme 51

3.7 Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của vi sinh vật và khả năng phân cắt của algL do vi sinh vật sinh ra 53

3.8 Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phân cắt của algL 54

3.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL 56

3.10 Kết quả thí nghiệm chọn tác nhân kết tủa thích hợp để tách chiết algL từ dịch enzyme 58

3.11 Đề xuất quy trình thu hồi chế phẩm enzyme algL từ vi khuẩn Klebsiella sp 60

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 63

4.1 Kết luận 63

4.2 Đề xuất ý kiến 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 1 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 70

PHỤ LỤC 2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN 75

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

algL: Alginate lyase

Na-alg: Natri alginate

EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

1 Bảng 1.2.3 Nhiệt độ phân hủy của các loại Alginte khác nhau 16

2 Bảng 1.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ oligo alginate đến khả

3 Bảng 3.4 Mức độ hao tổn độ nhớt của các dung dịch

Na-alginate khác nhau

44

5 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của alginate

lyase

55

TÊN HÌNH

1

Hình 1.2.2.1a :Công thức cổ điển của hai đơn vị monomeric

4 Hình 1.2.2.1d: Cấu tạo axit alginic theo mô hình các công thức

cổ điển (công thức phối cảnh)

13

7 Hình 1.4.2a: Aûnh hưởng của hỗn hợp Oligomanuronate

(Oligo-M) chưa bảo hoà và hỗn hợp Oligoguluronate (Oligo-G) chưa

bảo hoà lên sự dài ra của rể cây cà rốt và cây lúa

20

8 Hình 1.4.2b: Ảnh hưởng của nồng độ hổn hợp oligo-G đến sự

dài ra của rể cây càrốt và lúa

Hình 1.4.2c: Ảnh hưởng của mức độ đồng trùng hợp oligo-G

đến sự dài ra của rể cây càrốt à lúa Độ dài của rể xác định

sau 8 và 15 ngày (nồng độ 0,75mg/ml)

21

11 Hình 3.3a Khuẩn lạc vi sinh vật màu trắng sữa trên môi trường thạch I

43

12 Hình 3.3b Khuẩn lạc vi sinh vật màu trắng sữa trên môi trường thạch chỉ có Na-alginate 1,5% và soi dưới kính hiển vi vật kính 100x

43

13 Hình 3.5.1 Khuẩn lạc vi sinh vật phân lập trên các môi trường khác nhau

46

15 Hình 3.5.3 Sơ đồ giải trình tự gene 16S của chủng vi sinh vật phân lập

49

TÊN ĐỒ THỊ

1

Đồ thị 3.2 Mức độ hao tổn độ nhớt của dung dịch Na-alginate

Đồ thị 3.6a Mức độ hao hụt độ nhớt của dung dịch Na-alginate

4 Đồ thị 3.6b Mức độ hao hụt độ nhớt của dung dịch Na- alginate 1% theo nồng độ Enzyme

51

5

Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển

của Klebsiella sp và hoạt độ enzyme algL

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Rong biển là nguồn lợi biển cung cấp các chất keo quan trọng như Agar, Alginate, Carrageenan dùng trong công nghệ thực phẩm và các ngành công nghiệp khác Trên thế giới từ những năm 1980 rong biển đã được quan tâm nghiên cứu Năm 1930 công nghệ chế biến các chất Alginate, Manitol, Agar phát triển mạnh và ngày càng ứng dụng nhiều trong thực tế, đặc biệt là

ở các nước Nhật Bản, Mỹ và Trung Quốc Theo Luning (1990) tổng sản lượng của Alginate là 35.000 tấn.[1]

Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng của Alginate trong các ngành công nghiệp như: Thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ dệt, nông nghiệp, công nghệ sinh học, nghiên cứu khoa học…

Kết quả của các công trình nghiên cứu ứng dụng alginate trong nông nghiệp cho thấy rằng, mạch alginate sau khi cắt mạch có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển đối với cây trồng [9][10][12][13][14] Với ứng dụng này, thiết nghĩ việc nghiên cứu các phương pháp cắt mạch alginate để sản xuất chế phẩm kích thích tăng trưởng thực vật là rất cần thiết nhằm tăng năng suất cây trồng và tạo ra các sản phẩm có giá trị tốt từ đó nâng cao giá trị kinh tế là một hướng quan trọng đang được các nhà khoa hoc Việt Nam quan

tâm Chính vì lẽ đó, đề tài “ Nghiên cứu tách chiết Enzyme Alginate lyase từ

vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thuỷ phân alginate” là rất cần thiết, góp phần ứng dụng công nghệ sinh học vào nông nghiệp và đời sống sản xuất ở nước ta

2 Mục đích, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của đề tài

Mục đích, nhiệm vụ

Đề tài nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp alginate lyase cao Tiến hành nuôi cấy chủng vi sinh vật đã tuyển chọn trong môi trường thích hợp sau đó lựa chọn phương pháp thích hợp để thu nhận chế phẩm alginate lyase từ môi trường nuôi cấy và bước

đầu nghiên cứu ứng dụng cắt mạch alginate

Xác định hoạt độ của enzyme alginate lyase theo phương pháp đo độ nhớt dung dịch alginate 1% trước và sau khi phân cắt

3 Điểm mới và ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài

Điểm mới của đề tài

Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về phân cắt alginate bằng phương pháp sinh học

Enzyme alginate lyase có thể ứng dụng được vào nông nghiệp để sản xuất ra chế phẩm tăng trưởng thực vật ít độc hại cho con người và góp phần giảm làm giảm ô nhiễm môi trường

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả của đề tài góp phần làm phong phú thêm những hiểu biết về công nghệ sinh học và ứng dụng của nó vào các lĩnh vực của đời sống xã hội đặc biệt là trong công nghệ sản xuất enzyme, nông nghiệp và một số ngành công nghiệp khác

Kết quả của đề tài cũng mở rộng đầu ra cho ngành công nghiệp alginate của Việt Nam Bên cạnh đó các công ty sản xuất thuốc tăng trưởng thực vật cũng có thể ứng dụng để sản xuất ra một chế phẩm tăng trưởng thực vật ít gây độc hại cho con người và môi trường

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về rong Nâu [1]

 Ngành rong Nâu là một trong những ngành có giá trị kinh tế cao Rong Nâu có trên 190 chi, hơn 900 loài, phần lớn sống ở biển, số loài và số chi tìm thấy trong nước ngọt không nhiều lắm Rong có cấu tạo nhiều tế bào dạng màng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn giản, một hàng tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn dạng cây có gốc, rễ, thân, lá Rong sinh trưởng ở đỉnh, ở giữa, ở gốc các lóng Ngoài ra, do các tế bào rong dạng phiến chia cắt sinh trưởng khuếch tán gọi là sinh trưởng bề mặt

 Thành phần hoá học của rong Nâu

+ Sắc tố

Sắc tố rong Nâu là diệp lục tố (Chlorophyl), diệp hoàng tố (Xanthophyl), sắc tố màu nâu (Fucoxanthin), sắc tố đỏ (Caroten) Tuỳ theo tỷ lệ các loại sắc tố mà rong có màu từ nâu – vàng nâu – nâu đậm – vàng lục Nhìn chung sắc tố của rong Nâu khá bền

+ Gluxit

− Monosachride

Monosacharide quan trọng trong rong Nâu là đường Manitol được Stenhouds phát hiện năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm

Manitol có công thức tổng quát là : HOCH2 – (CHOH)4 – CH2OH

Manitol tan được trong ancol, dễ tan trong nước có vị ngọt Hàm lượng từ 14 ÷ 25% trọng lượng khô tuỳ thuộc vào điều kiện sống

− Polysacharide

 Alginic: là một polysacharide tập trung giữa ở vách tế bào, là thành phần chủ yếu tạo thành tầng bên ngoài của màng tế bào rong Nâu

Alginic và muối của nó có nhiều công dụng trong ngành công nghiệp, nông học, y học và thực phẩm

Hàm lượng Alginic trong các loại rong Nâu khoảng 2 ÷ 4% so với rong tươi và 13 ÷ 15% so với rong khô Hàm lượng phụ thuộc vào loại rong, điều kiện địa lý môi trường mà rong sinh sống Theo tài liệu tổng kết của Miyake (1995) cho thấy hàm lượng Alginic trong các loại rong Nâu ở các vùng biển Liên Xô cũ là 13 ÷ 40%

Theo tài liệu phân tích của các chuyên gia Bộ Thuỷ sản cho thấy hàm lượng Alginic trong các loại rong Nâu ở Hải Phòng là 22 ÷ 40%, trong khi đó, rong Nâu ở vùng biển Phú Yên và Khánh Hoà cao hơn hẳn

Hàm lượng Alginic có trong các loài rong ở Miền Trung Việt Nam là khá cao, dao động từ 12,3 ÷ 39,4% so với trọng lượng khô tuyệt đối, tuỳ thuộc

vào loài và vùng địa lý Trong đó, loài rong S mcclurei và Turbinaria ornata

có hàm lượng Alginic cao nhất khoảng 35,9 ÷ 39,4% rong khô tuyệt đối Nếu

so sánh tất các vùng biển thì rong ở vùng biển Khánh Hoà có hàm lượng Alginic cao hơn cả (từ 26,2 ÷ 39,4% rong khô tuyệt đối)

− Axit Fucxinic: có tính chất giống với axit Alginic Axit Fucxinic tác dụng với axit Sunfuric tạo thành hợp chất có màu tuỳ thuộc vào nồng độ axit Sunfuric

− Fuccoidin: là loại muối giữa axit Fuccoidin với các kim loại hoá trị khác nhau như Ca, Cu, Zn Fuccoidin có tính chất gần giống với axit Alginic, nhưng hàm lượng thấp hơn Alginic

− Laminarin: Laminarin là tinh bột của rong Nâu, thường gặp ở dạng bột

không màu, không mùi và có hai loại hoà tan và không hoà tan trong nước

Laminarin có hàm lượng từ 10 ÷ 15% trọng lượng rong khô tuỳ thuộc vào loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của rong Nâu

− Cellulose: là thành phần cấu tạo nên vỏ cây rong Hàm lượng Cellulose

trong rong Nâu nhiều hơn rong Đỏ

+ Prôtêin: Prôtêin trong rong Nâu không cao lắm nhưng khá hoàn hảo

Do vậy rong Nâu có thể làm thực phẩm Prôtêin trong rong Nâu thường ở dạng liên kết với Iod tạo Iod hữu cơ có giá trị cao như: MonoIodInzodizin, DiIodInzodizin

Hàm lượng prôtêin rong Nâu ở vùng biển Nha Trang dao động 8,05 ÷ 21,11% so với trọng lượng khô Hàm lượng axit amin cũng đáng kể và có giá trị cao trong prôtêin của rong biển

+ Chất khoáng

Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong Nâu thường lớn hơn nước biển Chẳng hạn: Iod của rong biển lớn hơn trong nước biển từ 80 ÷90 lần Hàm lượng Ba lớn hơn trong nước biển là 1.800 lần

Hàm lượng khoáng ở vùng biển Nha Trang dao động trong từ 15,51 ÷ 46,30% phụ thuộc vào mùa vụ và thời kỳ sinh trưởng

1.2 Tổng quan về Alginate

1.2.1 Alginate[1][11]

Alginate là thuật ngữ thường dùng cho các loại muối của axit alginic, nhưng cũng có thể xem là tất cả các dẫn xuất của axit alginic hay chính bản thân axit alginic Ở một số nơi thì thuật ngữ “algin” được dùng thay cho alginate Alginate tồn tại trong các thành tế bào của rong Nâu dưới dạng muối canxi, Magiê, natri của axit alginic Alginate được hình thành nhờ phản ứng đồng trùng hợp không phân nhánh của axit α – L – guluronic và axit β – D –

đoạn manuronic (M) và guluronic (G) cũng như sự tồn tại của các block ngẫu

nhiên Cấu trúc của alginate chịu ảnh hưởng của nguồn rong biển cũng như

điều kiện phát triển của rong Người ta rất quan tâm đến tỷ lệ M/G vì nó

quyết định đến tính chất của gel được tạo thành Nếu tỷ lệ này càng nhỏ thì

khả năng tạo gel của alginate càng cao và ngược lại

Alginate cũng có thể được sinh tổng hợp từ một loại vi sinh vật robacter

vinelandii, tuy nhiên sản phẩm alginate do vi sinh vật sản sinh ra có khả năng

tạo gel kém, ít có tính thương mại nên thường chỉ được đề cập đến trong công

tác giảng dạy

1.2.2 Công thức cấu tạo của axit alginic và muối alginate [1],[11]

1.2.2.1 Đặc điểm, cấu tạo của Alginic

Alginic thuộc polysacharide nhưng có chứa nhóm carboxyl (-COOH )

trong phân tử nên thường gọi là axit alginic hay polysacharide có tính axit

yếu

Theo Niwa (1940) cho rằng đơn vị cấu trúc của Alginic là Uronic có công

thức phân tử là (C24H30O23)n, Chapman thì cho rằng Alginic là dạng trùng hợp

thoát nước của D.Mamuronic có công thức (C5H9O5COOH)n và công thức hoá

học tương đương của Alginic là (C6H8O6)n Hai thuyết tương tự nhau,

n = 80 ÷83 do vậy có sự trùng hợp rất lớn

III.1.2.2 Một số tính chất của các alginate

Hình 1.2.2.1a :Công thức cổ điển của hai đơn vị monomeric trong axit Alginic

Theo các tài liệu hoá sinh gần đây mô tả cấu tạo của Alginic gồm các axit D.Manuronic liên kết với L.Lunuronic bằng liên kết 1 – 4 mạch thẳng không phân nhánh

Alginic là polymer gồm nhiều axit Manuronic (M) kết hợp với Guluronic (G) tạo mạch thẳng không phân nhánh và có thể liên kết theo hình phẳng sau:

Trên phân tử Alginic, các phân tử M và G sẽ tổ hợp thành các block theo

Hình 1.2.2.1b: Hình thể dạng ghế của axit Uronic

Hình 1.2.2.1d: Cấu tạo axit alginic theo mô hình các công thức cổ điển

(công thức phối cảnh)

Hình 3: Cấu tạo của Alginic axit Hình 1.2.2.1c: Cấu tạo của axit Alginic

1.2.2.2 Đặc điểm, cấu tạo của các keo Alginate



 Natri Alginate

Công thức phân tử: (C5H7O4COONa)n

Công thức cấu tạo:

Hình 1.2.2.1e: G block

Hình 1.2.2.1f: M block

Hình 1.2.2.1g: MG block

 Canxi Algiante

Công thức phân tử: [(C5H7O4COO)2 Ca)]n.

Công thức cấu tạo:



 Alginate Amonium

1.2.3 Tính chất của một số loại keo Alginate

Muối alginate của kim loại hoá trị I ( Natri alginate ) dễ hòa tan trong nước, tạo dung dịch keo nhớt, có độ dính và độ nhớt cao, khi làm lạnh không đông và khi khô trong suốt có tính đàn hồi

Muối Alginate của kim loại hóa trị II ( Alginate Canxi, Alginate Magiê,…) không hoà tan trong nước, tuỳ theo kim loại mà có màu khác nhau Khi muối ẩm thì dẻo dễ biến hình, khi khô rất cứng, rất khó thấm nước, nhờ có tính chất này mà Alginate có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau

Bột Alginate dễ bị giảm độ nhớt nếu không được bảo quản ở nhiệt độ thấp

Khác với Agar thì khi giảm nhiệt độ thì dung dịch Alginate không bị đông lại, ngay cả khi làm lạnh và tan giá thì độ nhớt và bề ngoài cũng không thay đổi

Hình 1.2.2.2b: Công thức cấu tạo Ca-alginate

Propyleneglycol Alginate ( PGA) với 80 – 85% nhóm -COOH được ester hoá có tác dụng nhỏ nhất với ion Canxi, do đó hợp chất này được ứng dụng trong công nghiệp sữa PGA giảm tính hoà tan khi pH môi trường < 4

pH = 2 thì PGA bị kết tủa

Các loại Alginate khác nhau thì sẽ bị phân huỷ ở các nhiệt độ khác nhau Theo nghiên cứu của Kenfikato – Khoa Thuỷ sản Trường Đại học Hokaido, Nhật Bản cho thấy nhiệt phân hủy của các Alginate trong bảng sau:

196 218,5

Bảng 1.2.3 Nhiệt độ phân hủy của các loại Alginate khác nhau

Độ nhớt và trọng lượng phân tử

Dung dịch Alginate tạo nên độ nhớt cao khi hoà tan trong nước Độ nhớt của nó tăng theo nồng độ Alginate hoà tan và giảm theo chiều tăng của nhiệt độ Trọng lượng phân tử trung bình của Alginate được đo bằng độ nhớt và khả năng thẩm thấu theo phương trình sau đây:

η = K.M γ

Trong đó:

η: độ nhớt

M: khối lượng phân tử trung bình

K, γ : hệ số thực nghiệm

Trọng lượng phân tử trung bình của Alginate được xác định bằng phương pháp độ nhớt (Viscometric method)

1.3 Một số nghiên cứu về alginate lyase

R Scott Doubet và Ralph S Quatrano (1982), thuộc trường Đại học Oregen State Nghiên cứu phân lập các vi khuẩn biển có khả năng sinh Lyase đặc hiệu cắt mạch Alginate Cho thấy các Alginate lyase được chiết rút từ môi trường của một số vi sinh vật đã được phân lập Các lyase này được sinh

ra nhờ môi trường có alginate tự nhiên và có hoạt tính với cả block của axit manuronic và axit guluronic của chuỗi polymer alginate Lyase đặc hiệu đối với axit guluronic được tách chiết từ môi trường, trong khi đó lyase đặc hiệu với axit manuronic được tách chiết từ tế bào vi khuẩn.[20]

Năm 1992, Manabu Kitamikado, Chao-Huang Tseng, Kuniko Yamaguchi và Takashi Nakamura thuộc trường Đại học Fukuoka, Nhật Bản Nghiên cứu hai chủng vi sinh vật sinh enzyme alginate lyase Cho thấy các

algiante lyase ngoại bào được tinh sạch từ Vibrio harveyi Al-128 và V alginolyticus ATCC 17749 Sự hình thành enzyme này đầu tiên cắt đứt liên kết α 1,4 bao gồm các đơn vị L-guluronate và sau đó là cắt đứt các liên kết beta 1,4 bao gồm các đơn vị D-manuronate Phân tử lượng của enzyme này được xác định khoảng từ 47.000 đến 57.000 Da và có điểm đẳng điện lần lượt là 4,3 và 4,6 Enzyme từ chủng AL-128 hầu như hoạt động ở môi trường có nồng độ NaCl từ 0,3 đến 1,0 M Còn môi trường hoạt động tối thích của enzyme từ chủng ATCC 17749 là sự có mặt của CaCl2 có nồng độ từ 5 đến 10 mM.[17]

Năm 2000, Wataru Hashimoto, Osamu Miyake, Keiko Momma, Shigeyuki Kawai và Kousaku Murata thuộc trường Đại học Kyoto, Nhật Bản

Nghiên cứu xác định phân tử lượng của alginate lyase của Sphingomonas sp

Chủng A1 là một trong những enzyme cắt mạch Alginate Kết quả cho thấy alginate bị cắt mạch tạo thành các oligoalginate bởi ba loại enzyme ( A1-I {66

kDa}, A1-2 {25 kDa}, A1-3 {40 kDa}) được sinh ra từ tế bào chất Các enzyme này và gene của chúng được phân lập từ các vi sinh vật phát triển ở vùng có mặt alginate.[19]

Yuan-Hong Wang, Guang-Li Yu, Xin-Min Wang, Zhi-Hua LV, Xia Zhao, Zhi Hong Wu, Wei-Shang Ji (2006) Nghiên cứu sự tinh sạch và đặc

tính của alginate lyase được sinh ra từ Vibrio sp Cho biết các lyase này được

tinh sạch bởi sự kết hợp giữa chất lắng amonium sulfate và diethylaminoethyl trong cột sắc ký Shephacel Kết quả cho thất phân tử lượng của các alginate lyase khoảng 62,5 kDa, với nhiệt độ và pH hoạt động tối ưu lần lượt là 250C và 7,0 Khả năng hoạt động của lyase tăng khi có mặt EDTA và Zn2+, nhưng

bị kìm hãm bởi Ba2+ Lyase này đặc hiệu cắt đứt liên kết beta-D-1,4 manuronic của chuỗi alginate

Xiao Ting Fu, Sang Moo Kim (2007), Khoa Sinh học và Công nghệ Biển Trường Đại học Quốc Gia Kangnung, Hàn Quốc, nghiên cứu tinh sạch

và tính chất của alginate lyase từ vi khuẩn biển Agarivorans albus Kết quả

nghiên cứu cho thấy rằng alginate lyase là một chuỗi polypeptit có khối lượng phân tử 60 Kda và có điểm đẳng điện là 5,5 – 5,7 pH và nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme này lần lượt là 7,0 và 400C Hoạt lực của enzyme

bị mất hoàn toàn bởi sự thẩm tích và phục hồi trở lại khi thêm 0,1 M Na+ hoặc

K+.[21]

1.4 Những nghiên cứu về Oligo alginate (OA)

1.4.1 Những nghiên cứu trong nước

Năm 2002, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt đã sản xuất chế phẩm tăng trưởng thực vật T&D bằng cách chiếu xạ tia gamma lên phân tử alginate để thu nhận OA cĩ khối lượng phân tử thấp hơn

Năm 2002, Trần Thái Hòa và Nguyễn Thị Ái Nhung ở Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế nghiên cứu ảnh hưởng của oligo alginate đến khả năng nảy mầm của hạt thóc giống Oligoalginate dùng để thí nghiệm được tạo

ra bằng 3 phương pháp : chiếu xạ, phân cắt bằng kiềm và axit mạnh Kết quả như sau:[10]

STT Tổ hợp nồng độ tối ưu mầm (%) Sức nảy

Chênh lệch %

so với mẫu đối chứng

Tăng % so với đối chứng

Điểm chất lượng cây mầm

Bảng 1.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ Oligo alginate đến khả năng nảy

mầm của hạt thóc giống

Năm 2005 cũng tại Trường Đại học Khoa học Huế, tác giả Võ Thị Mai Hương cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của OA đến sự phát triển của một số giống cây ngắn ngày và có kết luận như sau:

− Oligoalginate có khả năng kích thích sự sinh trưởng, tăng sự tích lũy chất khô và năng đẻ nhánh của lúa Tại nồng độ OA 80 ppm hàm lượng chất khô đạt cao nhất (tăng 25,40% so với đối chứng), số nhánh/cây cao nhất (tăng 21,10%) và trọng lượng hạt/chậu cao nhất (tăng 32,41)

− OA thể hiện rõ rệt tác dụng kích thích lên sinh trưởng của cây ngò Nồng độ OA tối thích là 60 ppm Tại nồng độ này trọng lượng tươi của ngò tăng 165,145%, năng suất tăng 60,76% Tất cả các lô có xử lý OA đều có năng suất cao hơn so với đối chứng

− OA làm tăng số hoa/cây và tỷ lệ hoa hữu hiệu và năng suất của lạc ở tất cảc các nồng độ nghiên cứu Sản lượng lạc tăng 1,77 – 7,48 tạ/ha và đạt cao nhất (26,83 tạ/ha, tăng 38,66%) ở nồng độ OA tối thích (80 ppm)

1.4.2 Những nghiên cứu ngoài nước

Năm 2003, các nhà nghiên cứu ở Trường Đại học Nagasaki, Nhật Bản đã nghiên cứu khả năng kích thích sự phát triển rể cây cà rốt và lúa của các Oligo uronate chưa bảo hoà từ alginate Các oligo uronate chưa bảo hoà được chuẩn bị nhờ một enzyme alginate lyase tiêu hoá polymannuronate ( PM ) và

polyguluronate ( PG ), được tinh sạch từ Pseudomonas sp Sự phát triển của rể

được xác định bởi sự dài ra của rể cây càrốt và cây lúa được ủ trong môi trường có chứa 0,8% agar trong bóng tối PG và PM không có khả năng kích thích sự phát triển rể nhưng khi ta trộn lẫn các enzyme tiêu hoá PG thì nó lại có khả năng kích thích sự phát triển của rể của hai loại cây này ở nồng độ tối thiểu là 0,5mg/ml, khả năng kích thích sự phát triển rể là cực đại ở nồng độ 0,75 mg/ml

Hình 1.4.2a: Ảnh hưởng của hỗn hợp Oligomanuronate (Oligo-M) chưa bảo hoà và hỗn hợp Oligoguluronate (Oligo-G) chưa bảo hoà lên sự dài ra của rể cây cà rốt (a) và cây lúa (b).

Hạt giống của hai loại cây này được đặt trong môi trường agar ở 250C, trong bóng tối Khi chiều dài của rể đạt từ 1 – 1,5cm sau 5 – 6 ngày thì tiến hành cắt rể và đem ủ trong môi trường có chứa hổn hợp oligo-G và oligo-M ở nồng độ 0,5mg/ml Rể được ủ trong bóng tối và xác định chiều dài sau 4 – 5 ngày ủ.[13]

Hai nhà nghiên cứu Iwasaki và Matsubara, Viện Nghiên cứu Thực phẩm thuộc Quận Kagawa, Takamatsu, Nhật Bản đã nghiên cứu việc tinh chế các oligosacharide alginate với khả năng kích thích phát triển rể của cây rau diếp Kết quả cho thấy, natri alginate được thuỷ phân bởi alginate lyase từ Corynebacterium sp., và sau đó tinh chế sản phẩm nhờ quá trình siêu lọc (UF) Khi xử lý dung dịch oligo natri alginate bằng phương pháp siêu lọc dưới áp suất 0,15 Mpa, tốc độ của dòng chảy khoảng 0,6m/s, hầu hết các alginate không được phân cắt được loại bỏ hoàn toàn Phần alginate được giữ lại là một hỗn hợp của disacharide tới octosacharide và có khả năng kích thích sự phát triển chiều dài rể cây rau diếp ( khoảng 2 lần so với mẫu đối chứng) ở

Hình 1.4.2b: Ảnh hưởng của nồng độ

hỗn hợp oligo-G đến sự dài ra của rể cây

càrốt (□) và lúa (■) Độ dài của rể xác

định sau 8 và 14 ngày

Hình 1.4.2c: Ảnh hưởng của mức độ đồng trùng hợp oligo-G đến sự dài ra của rể cây càrốt (□) và lúa (■) Độ dài của rể xác định sau 8 và 15 ngày (nồng độ 0,75mg/ml)

nồng độ trong khoảng 200 – 300 µg/ml Mức độ ảnh hưởng khác nhau của các oligoalginate được xác định bằng cách thử từng oligoalginate có mức độ phân cắt mạch khác nhau Tri-, tetra-, penta- và hexasacharide đều có khả năng kích thích sự phát triển rể của cây rau diếp [14]

1.5 Tổng quan sơ lược về các phương pháp nghiên cứu

1.5.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật[6],[8]

Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng vi sinh vật đó từ mẫu vật hoặc quần thể vi sinh vật ban đầu để thu giống ở dạng thuần khiết

Các vi sinh sinh vật thuần khiết chỉ bao gồm các tế bào được sinh ra từ tế bào ban đầu Hầu hết các ứng dụng công nghệ sinh học đều liên quan đến việc sử dụng giống thuần

Phần lớn các phương pháp phân lập giống thuần khiết đều dựa trên kỹ thuật pha loãng, thường gồm các bước sau: chuẩn bị mẫu, tăng sinh mẫu ( nếu số lượng vi sinh vật có trong mẫu ít ), pha loãng mẫu, cấy mẫu lên môi trường thạch đặc hiệu, ủ mẫu ở điều kiện thích hợp, kiểm tra và phát hiện khuẩn lạc đặ trưng, chọn khuẩn lạc đặc trưng đem tạo giống thuần và kiểm tra giống thuần

1.5.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

Bảo quản giống vi sinh vật hay còn gọi là giữ giống vi sinh vật Bảo quản nhằm làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất của tế bào vi sinh vật, ngăn cản sự sinh sản của chúng, đồng thời không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống, có nghĩa là giống được bảo quản tốt thì sẽ có các quá trình sinh lý, sinh hóa giống như ban đầu nếu gặp được điều kiện sinh trưởng giống như ban đầu Giống đem đi bảo quản phải ở trạng thái thuần khiết và trong trạng thái sinh, lý tốt

Có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật, như phương cấy chuyền định kỳ lên môi trường mới , phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có phủ lớp dầu khoáng, phương pháp giữ giống trên cát hay hạt, hay phương pháp đông khô

1.5.3 Phương pháp nghiên cứu hình thái vi sinh vật.[6]

Vi sinh vật là những cơ thể sống vô cùng nhỏ bé Phần lớn các vi sinh vật không thể quan sát bằng mắt thường mà phải nhờ đến độ phóng đại của kính hiển vi Chính vì thế, kính hiển vi là một dụng cụ vô cùng quan trọng, không thể thiếu trong việc nghiên cứu đặc tính hình thái của vi sinh vật cũng như hình dáng, kích thước, khả năng di động, sự hình thành bào tử, sinh sản…

Các tiêu bản tạm thời được sử dụng để quan sát hình thái vi sinh vật

Đối với tiêu bản tạm thời có nhuộm màu, thuốc nhuộm vi sinh vật phải không độc hoặc ít độc đối với vi sinh vật cần quan sát và phải pha loãng đến nồng độ nhất định để đảm bảo vi sinh vật vẫn còn sống và di động

Tế bào sống và tế bào chết có thể phân biệt khi nhuộm màu với xanh methylene Methylene có màu xanh khi không có sự hiện diện của hydro và không có màu khi có mặt của hydro Khi các tế bào ở trạng thái nghỉ ( trạng thái ở pha ổn định trên đường cong sinh trưởng ), mặc dù còn sống nhưng không có khả năng khử màu xanh của methylene thành không màu Do đó, nên quan sát tế bào ở giai đoạn đầu của pha tăng trưởng

Cũng có thể nghiên cứu hình thái vi sinh vật bằng phương pháp nhuộm của Christian Gram Nhuộm Gram không những giúp phân biệt vi khuẩn nhờ các đặc điểm của hình thái và sự sắp xếp của tế bào mà còn cung cấp thông tin về lớp vỏ tế bào Khi nhuộm theo phương pháp này tế bào vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ tế bào tạo bởi peptidolycan sẽ có màu tím còn vi khuẩn Gram

âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn ( do có ít peptidolycan ) và được bao bọc bởi lớp màng mỏng sẽ có màu hồng

1.5.4 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme và thu nhận chế phẩm enzyme[3][4][5][7]

1.5.4.1 Phương pháp nuôi cấy

Để thu được enzyme có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật khác nhau về nguyên tắc Phương pháp nuôi cấy bề mặt hay phương pháp nuôi cấy bề sâu hay còn gọi là nuôi cấy chìm, trong nuôi cấy chìm có phương pháp nuôi cấy chìm hai bước

1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Trong phương pháp nuôi bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt của môi trường dinh dưỡng đặc trưng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng Trong môi trường dinh dưỡng người ta thường cho thêm các chất cảm ứng cần thiết cho sự tổng hợp enzyme nào đó hoặc một số chất dinh dưỡng bổ sung nguồn nitơ,photpho như nước chiết ngô, khoai tây, dịch chiết nấm men… Để đảm bảo độ xốp của môi trường cần có các chất tạo độ xốp như trấu tỷ lệ từ 10 – 20% Trước khi gieo cấy vi sinh vật môi trường cần phải được vô trùng để đảm bảo không bị lây nhiểm vi sinh vật lạ trong khi nuôi Để nuôi cấy be mặt người ta thường dùng mành mành hoặc khung đục lỗ để trong phòng kín

Phương pháp nuôi bề mặt thường thích hợp để nuôi cấy các tế bào nấm mốc vì khả năng phát triển mạnh nên ít bị tạp nhiễm

2 Phương pháp nuôi cấy chìm

Phương pháp nuôi cấy chìm vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục Nguồn cung cấp cacbon phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật sinh enzyme Trong thực tế sản xuất người ta còn dùng cả một

hóa Còn nguồn nitơ người ta hay dùng nguồn nitơ hữu cơ như cao ngô, dịch chiết nấm men, khô lạc… Ngoài ra trong thành phần môi trường cũng cần bổ sung thêm các chất khoáng Môi trường nuôi cấy cần được định mức phối chế có trừ hao lượng hơi nước bám vào thành bình và thanh trùng trước khi cấy giống Thường thanh trùng môi trường bằng cách sục hơi nước trực tiếp ở nhiệt độ 1210C trong vòng 60 – 90 phút đối với các môi trường chứa các nguyên liệu bột, đạm thô và 20 – 30 phút đối với các môi trường có chứa đường

Trong quá trình nuôi cấy phải sục khí vô trùng và khuấy đảo liên tục Thời gian kéo dài từ 1 – 4 ngày tùy thuộc vào từng loại vi sinh vật Trong nuôi cấy chìm việc khống chế pH , điều kiện yếm khí và vô trùng là những điều kiện đặc biệt quan trọng và được chú ý nhiều hơn nuôi cấy bề mặt

3 Phương pháp nuôi chìm hai bước

Theo phương pháp này các tế bào vi sinh được nuôi trong thiết bị để phát triển tối đa, sau đó được chuyển tới thiết bị lên men sinh tổng hợp enzyme, trong đó thành phần môi trường khác với điều kiện phát triển của vi sinh vật Phương pháp này có ưu điểm là không có chất kích thích, sản lượng enzyme cao và chỉ cần một lượng nhỏ chất dinh dưỡng Phương pháp này có nhiều thuận lợi trong việc kiểm tra và tạo điều kiện tốt cho các pha riêng biệt đó là pha sinh trưởng và pha chế tạo enzyme, vì vậy hiệu quả cao

1.5.4.2 Thu hồi chế phẩm enzyme

Các chế phẩm enzyme được ứng dụng trong thực tế với nhiều dạng khác nhau Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp không cần tách tạp chất nếu các tạp chất đó không gây tác hại đáng kể đến sản phẩm và kỹ thuật sản xuất sau này ( ví dụ:

sản xuất rượu, da)

Cũng có nhiều trường hợp người ta cần đến chế phẩm enzyme tinh khiết với mức độ khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng ( ví dụ: công nghiệp dệt, công nghiệp đường từ tinh bột, y học, nghiên cứu khoa học …)

Enzyme rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài do đó khi tinh chế enzyme cần tránh sự biến tính prôtêin, gây ảnh hưởng xấu đến hoạt tính của enzyme, cần tiến hành quá trình thu hồi nhanh ở nhiệt độ thấp Nói chung không có một quy trình chung để chiết xuất và tinh chế enzyme Tùy theo từng trường hợp mà người ta áp dụng các phương pháp chiết xuất và tinh chế khác nhau

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu

Những nội dung nghiên chính trong đề tài được trình bày trên sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Những nội dung nghiên cứu chính

Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp alginate

lyase trong tự nhiên

Nuôi cấy chủng vi sinh vật ở 37oC, trong 2 ngày

Sinh khối và tách chiết alginate lyase từ môi trường nuôi cấy

vi khuẩn

Bước đầu phân cắt các alginate khác nhau bằng alginate

lyase

Xác định hoạt độ alginate lyase

Thu thập số liệu và đưa ra kết luận

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phân

cắt alginate của alginate lyase

Nghiên cứu tách chiết alginate lyase từ dịch sinh khối bằng

dung môi thích hợp

Định danh vi sinh vật sinh

2.2 Các phương pháp nghiên cứu[3][6][7][8]

2.2.1 Phân lập vi sinh vật bằng kỹ thuật pha loãng

2.2.2 Kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật bằng phương pháp cấy ria và soi kính hiển vi

2.2.3 Giữ giống vi sinh vật bằng phương pháp cấy truyền định kỳ lên môi trường 2.2.4 Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp đo độ nhớt

2.2.5 Xác định nhiệt độ và pH bằng nhiệt kế và pH kế

2.2.6 Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp cấy gạt

2.2.7 Thu hồi chế phẩm enzyme bằng phương pháp kết tủa

2.2.8 Định danh vi sinh vật bằng phương pháp giải trình tự gene 16S

2.2.9 Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Office Excel

2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.3.1 Bố trí nghiệm phân lập chủng vi khuẩn trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp algL

Alginate 1%

Đổ xuống đất

Lấy mẫu đất hòa vào nước tiệt trùng

Cấy vào môi trường agar chứa 1,5% algiante natri Nuôi cấy ở 37oC trong 02

ngày

Sơ đồ 2.3.1: Bố trí thí nghiệm phân lập chủng vi khuẩn có khả năng

sinh tổng hợp algL

Rong Nâu được ủ trong đất một thời gian cho đến khi bị mũn ra Khi thấy rong đã bị phân hủy, chuẩn bị 100 ml dung dịch alginate 1%, đổ xuống khoảng 30cm2 đất đã ủ rong Nâu, định kỳ 2 ngày một lần, tiến hành liên tục trong 02 tháng Sau đó lấy khoảng 1 g đất ở độ sâu từ 3 -5 cm cho vào 5ml nước tiệt trùng, trộn đều trên máy trộn mẫu, để ổn định rồi lấy 10 µl huyền phù nổi trên bề mặt cấy trang vào 10 ml môi trường thạch agar có chứa 1,5 % alginate natri như nguồn cacbon cơ bản, ủ ở 37oC trong 02 ngày

2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp algL cao

Khuẩn lạc vi sinh vật sau khi phân lập

Thu hồi dịch enzyme

Nuôi cấy và sinh khối

Sơ đồ 2.3.2: Bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng

sinh tổng hợp algL cao Môi trường và điều kiện nuôi cấy

− Thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường I)

Dùng que cấy vô khuẩn lấy một ít các khuẩn lạc này hòa vào 10ml nước cất vô trùng, rồi pha loãng đến 105 lần, sau đó lấy 10µl cấy trang lên môi trường thạch I, nuôi cấy 2 ngày ở 370C trong tủ ấm

Đến khi trên môi trường thạch chỉ có những khuẩn lạc đã chọn phát triển(có thể coi là thuần khiết) thì sinh khối các chủng vi sinh vật này trong

phòng trong 2 ngày trên máy lắc với tốc độ 250v/p, tiếp tục lấy 3ml dịch sinh khối từ 10ml trên đổ vào bình tam giác 500ml chứa 100ml môi trường lỏng II rồi sinh khối trong điều kiện tương tự Từ 100ml dịch sinh khối trên lấy tiếp 90ml đổ vào bình tam giác 1000ml chứa 500ml môi trường lỏng II và sinh khối ở nhiệt độ phòng, 370C, trên máy lắc 250v/p

Lưu ý:

− Que cấy vòng sau khi lấy khuẩn lạc vi sinh vật trên môi trường thạch phải được khử trùng trên ngọn đền cồn trước khi lấy tiếp một khuẩn lạc vi sinh vật khác

− Đối với các khuẩn lạc vi sinh vật khác nhau, tiến hành nuôi cấy và sinh khối trong các hộp lồng và bình tam giác khác nhau

Làm lạnh dịch sinh khối thu được xuống 30C, rồi ly tâm với tốc độ 10.000v/p ở nhiệt độ 100C trong 30’ Thuỷ phân dung dịch natri alginate bằng các dịch enzyme thu được sau ly tâm ở điều kiện nhất định để lựa chọn chủng

vi sinh vật có khả năng sinh tổng enzyme cao

2.3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của chủng vi sinh vật được lựa chọn

Chủng vi sinh vật đã lựa chọn

Pha loãng bằng nước vô trùng

Cấy lên môi trường thạch I

Kiểm tra khuẩn lạc hoặc soi dưới kính hiển vi Pha loãng bằng nước vô trùng

Sơ đồ 2.3.3: Bố trí thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của chủng vi

sinh vật đã lựa chọn

Dùng que cấy vòng lấy một ít khuẩn lạc của vi sinh vật đã lựa chọn hòa trong 1ml nước cất tiệt trùng, tiếp tục pha loãng bằng cách dùng pipet lấy 0,1

ml từ ống nghiệm ban đầu đổ sang ống nghiệm có chứa 0,9ml nước cất tiệt trùng, tiếp tục pha loãng bằng cách lấy 0,1ml từ ống nghiêm thứ 2 đổ sang ống nghiệm thứ 3 có chứa 0,9 ml nước cất tiệt trùng, tiến hành tương tự cho đến ống nghiệm thứ 5, ta thu được dung dịch vi sinh vật được pha loãng 105

lần Lấy 0,1 ml dung dịch vi sinh vật từ ống nghiệm thứ 5 cấy trang lên môi trường thạch I trong hộp lồng petri đã chuẩn bị trước

Để dung dịch vi sinh vật ngấm vào môi trường trong vài phút Lật ngược hộp lồng petri đã cấy vi sinh vật, nuôi trong tủ ấm ở 370C, trong thời gian 2 ngày Sau 2 ngày nuôi cấy kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch, nếu các khuẩn lạc mọc riêng lẻ có hình dạng, màu sắc giống nhau thì có thể kết luận chủng vi sinh vật là thuần khiết, hoặc có thể kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật bằng cách soi dưới kính hiển vi hoặc cấy trang

2.3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu dịch enzyme algL từ môi trường sinh khối

heo

tài

liệu tham khảo thì quá trình thu dịch enzyme phải tiến hành ở nhiệt độ lạnh <

50C Tuy nhiên, do điều kiện thí nghiệm nên dịch sinh khối được làm lạnh xuống 30C rồi ly tâm ở nhiệt độ 100C với tốc độ 10000 v/p trong 30 phút

2.3.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phân cắt các loại Natri alginate khác nhau bằng dung dịch enzyme thu được

Alginate

Thái Lan (A1)

Alginate Trường

ĐH Nha Trang(A3)

Alginate Trung Quốc(A2)

Sản phẩm sau phân cắt

Đo độ nhớt

Sơ đồ 2.3.4: Bố trí thí nghiệm thu dịch enzyme từ dịch sinh khối

Sơ đồ 2.3.5: Thí nghiệm phân cắt các loại natri alginate khác nhau

bằng dung dịch enzyme thu được

Các mẫu natri alginate khác nhau được mã hóa là các mẫu A1, A2, A3 và pha thành 100 ml dung dịch 1%, đựng trong bình tam giác 250 ml, thêm vào mỗi bình 40 ml dung dịch enzyme vừa thu được, điều chỉnh pH = 7,0 – 7,5 rồi tiến hành phân cắt ở nhiệt độ 370C trong thời gian 20’, 40’, 60’

Đo độ nhớt sản phẩm thu được ở 200

C

2.3.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme

Sơ đồ 2.3.6: Bố trí thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme

Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp độ nhớt

Nguyên tắc: theo tài liệu nghiên cứu của các tác giả A Nakagawa, T Ozaki, K Chubachi, T Hosoyama thuộc chuyên ngành Sinh học – Trường Đại học Teikyo và Khoa sinh học ứng dụng – Trường Đại học Utsunomiya Để xác định hoạt độ enzyme algL có 2 phương pháp, phương pháp độ nhớt và

100ml dung dịch natri alginate 1%

Sản phẩm sau phân cắt

Đo độ nhớt

Kết luận

phương pháp so màu với axit uronic Với phương pháp độ nhớt thì một đơn vị hoạt độ của enzyme algL được định nghĩa là lượng enzyme làm giảm 50% độ nhớt của dung dịch natri alginate 1% trong 20 phút

Phân cắt natri alginate với 5 ÷ 40 ml ( bước nhảy 5ml) dung dịch enzyme trong 20’, sau đó tiến hành độ nhớt và xác định một đơn vị hoạt độ tương ứng với bao nhiêu ml dung dịch enzyme

Tiến hành: Chuẩn bị 9 bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml dung dịch

natri alginate 1%, trong đó một bình đối chứng và 8 bình còn lại lần lượt được bổ sung từ 5 ÷ 40 ml (bước nhảy 5 ml) dung dịch enzyme, phân cắt ở nhiệt độ

370C, trên máy lắc tốc độ 250 v/p trong 20 phút

Đo độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế roto ở 200

Sơ đồ 2.3.7 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian

nuôi cấy đến khả năng thuỷ phân alginate

Dùng que cấy vòng vô trùng lấy một ít khuẩn lạc vi sinh vật trên môi trường thạnh I rồi sinh khối lần 1 trong bình tam giác 500ml có chứa 100 ml môi trường II trong 12h ở nhiệt độ phòng trên máy lắc tốc độ 250 v/p

Chuẩn bị 6 bình tam giác 500ml có chứa 100ml môi trường II có đánh số thứ tự từ 1 đến 6 để sinh khối lần 2 bằng cách: lần lượt lấy 10ml dung dịch sinh khối lần 1 đã qua 12h sinh khối cho vào lần lượt 6 bình tam giác nói trên, đặt 6 bình tam giác lên máy lắc tốc độ 250 v/p, ở nhiệt độ phòng và sinh khối

ở các thời gian khác nhau Bình tam giác 1 sinh khối trong 12h, bình tam giác

2 sinh khối trong 24h, lần lượt cho các bình tam giác 3,4,5,6 sinh khối với thời gian lần lượt là 36h, 48h, 60h, 72h

Sau khi đạt thời gian sinh khối, tiến hành ly tâm dịch sinh khối với tốc độ 10.000 v/p ở nhiệt độ 100C trong thời gian 30 phút

Dịch enzyme thu được sau khi ly tâm được dùng để phân cắt dung dịch alginate 1%, từ đó xác định được sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy vi sinh vật đến khả năng phân cắt alginate của enzyme alginte lyase

Sự phát triển của vi sinh vật được xác định bằng cách đếm tế bào bằng phương pháp cấy gạt

2.3.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất kim loại đến khả năng phân cắt của algL

Sơ đồ 2.3.8: Ảnh hưởng của các hợp chất kim loại đến khả năng phân cắt

của algL

Chuẩn bị 12 bình tam giác 250 ml chứa 100 dung dịch alginate 1%, trong đó một bình đối chứng chỉ phân cắt với 40ml dung dịch enzyme, 1 bình phân cắt với 40ml dịch enzyme đã được xử lý với 1mM EDTA, 5 bình tam giác phân cắt với dịch enzyme đã được bổ sung 2mM các muối kim loại, 5 bình còn lại phân cắt bằêng enzyme đã xử lý 1mM EDTA và 2mM các muối kim loại

Các muối kim loại được sử dụng là: CaCl2, MnCl2, MgCl2, CuCl2, FeCl2

Phân cắt trong thời gian 20 phút, sau đó đo độ nhớt và xác định được ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phân cắt của algL

Dung dịch natri alginate 1%

Sản phẩm sau phân cắt

Đo độ nhớt

Kết luận

2.3.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL

Sơ đồ 2.3.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân

cắt của algL

Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL được thí nghiệm từ 10 ÷ 60oC, với bước nhảy là 10

Dung dịch natri alginate 1%

Sản phẩm sau phân cắt

Đo độ nhớt

Kết luận