3. Điểm mới và ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
3.11.xuất quy trình thu hồi chế phẩm enzyme algL từ vi khuẩn Klebsiella
Klebsiella sp
Sơ đồ 3.11. Quy trình thu hồi chế phẩm enzyme algL thô từ dịch sinh khối vi khuẩn Klebsiella sp
Sinh khối Giống vi sinh vật Làm lạnh Ly tâm 1 Dịch enzyme Kết tủa bằng (NH4)2SO4 Ly tâm 2 Chế phẩm enzyme thô Sấy khô Nghiền mịn Bảo quản Xác định hoạt độ Xác định hoạt độ
Giải thích quy trình
1. Sinh khối
Trước khi sinh khối, chủng Klebsiella sp được nuôi cấy trên môi trường thạch I, nuôi ở 370C trong 2 ngày. Khuẩn lạc của Klebsiella sp sẽ phát triển
trên môi trường thạch I, dùng que cấy vô khuẩn lấy một ít khuẩn lạc vi sinh vật trên môi trường thạch I, hòa đều vào 10ml môi trường dinh dưỡng (II) chứa trong bình tam giác 100ml, sinh khối 2 ngày ở nhiệt độ 370C trên máy lắc 250v/p, tiếp tục lấy 3ml từ 10ml dịch sinh khối này đổ vào 100 ml môi trường dinh dưỡng đựng trong bình tam giác 250 ml rồi sinh khối ở điều kiện tượng tự, tiếp tục lấy 9ml từ 100 ml dịch sinh khối đổ vào 500ml môi trường dinh dưỡng chứa trong bình tam giác 1000ml và sinh khối ở điều kiện tương tự.
2. Ly tâm 1
Dịch sinh khối được làm lạnh và ly tâm ở 40C, thời gian 30’ với tốc độ 10.000 v/p
3. Kết tủa bằng (NH4)2SO4
Dịch enzyme được làm lạnh xuống 4oC, thêm trực tiếp muối (NH4)SO4 dạng bột vào dịch enzyme cho đến khi bão hòa, trong quá trình kết tủa phải luôn duy trì nhiệt độ của dịch enzyme ở 40C. Sau đó, dịch enzyme được giữ ở nhiệt độ 40C trong 12h trước khi ly tâm để tách chế phẩm enzyme algL thô.
4. Ly tâm 2
Ly tâm ở tốc độ 12.000 v/p, nhiệt độ 4oC, thời gian 30 phút để tách kết tủa
Khi thu được chế phẩm algL thô, tiến hành xác định hoạt độ của algL theo phương pháp độ nhớt.
6. Sấy khô
Sau khi xác định được hoạt độ enzyme, chế phẩm enzyem algL được sấy khô sau đó nghiền mịn, rồi bảo quản.
Cần lưu ý rằng, algL bị giảm hoat lực ở 500C trở lên, nên khi sấy chế phẩm algL cần sấy ở nhiệt độ thấp, có thể sấy lạnh ở nhiệt độ 30 – 350C. Sau khi sấy khô, algL cần được xác định lại hoạt độ để xác định ảnh hưởng của chế độ sấy đến hoạt độ của algL, chế phẩm enzyme algL khô được nghiền mịn rồi bảo quản.
CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN VAØ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1. Kết luận
Từ những kết quả nghiên cứu ta có thể kết luận một số vấn đề sau: 1. Đã phân lập được chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme algL trên môi trường thạch có chứa 0,5% Na-alginate; 0,5% NaCl; 0,1% pepton và 0,5% dịch chiết nấm men.
2. Đã thu được chế phẩm enzyme algL thô từ môi trường sinh khối vi sinh vật. Môi trường sinh khối vi sinh vật như sau:
- Thành phần môi trường sinh khối (môi trường II) Na-alginate : 0,5% Pepton : 0,5% Dịch chiết nấm men : 0,1% NaCl : 0,5% KH2PO4 : 0,1% MgSO4 : 0,1% pH : 7,0 -7,5
3. Đã xác định được 1 đơn vị hoạt độ enzyme algL theo phương pháp độ nhớt là 12ml/20’ (có nghĩa là với 12ml dung dịch enzyme algL làm cho độ nhớt của dung dịch Na-alginate 1% giảm xuống 50% trong 20 phút).
vi sinh vật này mạnh, đồng thời algL do chúng sinh tổng hợp cũng có hoạt lực cao.
5. Đã định danh được chủng vi sinh vật phân lập được là Klebsiella sp. Đây là trực khuẩn gram âm, không di động, có khả năng lên men, glucoza và lactoza, tế bào có hình que, khuẩn lạc có hình tròn màu trắng sữa trên môi trường phân lập I.
6. Đã nghiên cứu được sự ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt động của AlgL.
7. Khoảng nhiệt độ tối thích cho hoạt động của algL là từ 30 – 40 0C, còn ở nhiệt độ từ 10 – 30 0C hoạt động của algL bị kìm hãm tuy nhiên khi nâng nhiệt thì hoạt động của algL được phục hồi trở lại, khi nhiệt độ tăng lên trên 500C algL bị biến tính giảm khả năng hoạt động, đồng thời không có khả năng phục hồi hoạt động khi hạ xuống nhiệt độ tối thích.
8. Để thu hồi chế phẩm enzyme algL thô, nên sử dụng tác nhân kết tủa là muối trung tính (NH4)2SO4 bão hòa, thời gian kết tủa 12h ở nhiệt độ 4 0C.
4.2. Đề xuất ý kiến
Từ những vấn đề đã nghiên cứu được trong đề tài, xin được đề xuất các ý kiến sau:
1. Đề tài chưa nghiên cứu sự ảnh hưởng của tỷ lệ các thành phần chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và hoạt độ của enzyme algL do vi sinh vật sinh tổng hợp nên, vì vậy cần mở rộng nghiên cứu thêm sự ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và có thể lựa chọn được môi trường nuôi cấy, sinh khối tối ưu cho sự phát triển và hoạt độ algL của vi sinh vật đã phân lập. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Nghiên cứu phương pháp tinh sạch enzyme algL như phương pháp hấp phụ không đặc hiệu hay phương pháp trao đổi ion, để tăng hoạt lực của
algL và xác định hoạt độ của algL theo phương pháp so màu cũng như là xác định được khối lượng phân tử của algL.
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất gây biến tính protein cũng như pH đến hoạt độ của enzyme algL.
4. Nghiên cứu phân cắt Na-alginate bằng kiềm, axit mạnh và so sánh kết quả với phương pháp phân cắt bằng enzyme.
5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các oligo alginate có khối lượng phân tử khác nhau đến khả năng nẩy mầm của hạt giống và khả năng phát triển của thực vật. Bên cạnh đó mở rộng nghiên cứu ứng dụng của các oligo alginate trong lĩnh cực thực phẩm, sinh học và dược học.
TAØI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu trong nước
1. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Ngô Đăng Nghĩa, Nguyễn Anh Tuấn (2000), “Chế biến rong biển”. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
2. Nguyễn Thị Xuyến (1996), “ Đại cương vi sinh vật”. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), “Công nghệ Enzyme”. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
4. Lê Ngọc Tú, Lê Văn Trư và các tác giả. “Enzyme từ vi sinh vật”. Nhà xuất bản Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội.
5. Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978), “ Vi sinh vật tổng hợp”. Nhà
xuất bản Kỹ thuật.
6. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Aùnh Tuyết (2006) “ Thí nghiệm vi sinh vật học “ . Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
7. Lê Ngọc Tú và cộng sự (2002), “ Hóa Sinh Công nghiệp”. Nhà xuất bản Khoa học - Kỹ thuật Hà Nội .
8. Trần Linh Thước (2003), “ Phương pháp phân tích vi sinh vật”. Nhà Xuất bản Giáo dục.
9. Nguyen Quoc Hien, Naotsugu Nagasawa, Le Xuan Tham, Fumio Yoshii, Vo Huy Đang, Hiroshi Mitomo, Keizo Makuuchi và Tamikazu Kume. “Growth – promotion of plant with depolymerized alginates
by irradiation”. Nuclear Research Institute, DaLat, Viet Nam.
10. Nguyễn Thái Hòa, Nguyễn Thị Aùi Nhung (2002),” Nghiên cứu ảnh
hưởng của aligoalginate đến khả năng nảy mầm của hạt thóc giống”. Tạp chí Khoa học, Đại học Huế.
Tài liệu nước ngoài
11. Gacesa P. (1988) Alginates. Carbohydr Polym 8:161–182.
12. Biological effect of radiation-degraded alginate on flower plant in tisue culture. Graduate School of Agricutural Life Sciences, University of
Tokyo.
13. Root – Growth promoting Acivity of Unsaturated oligomer Uronate from Alginate on Carrot and Rice plant. Graduate School Biodemical Sciences,
Nagasaki University, Japan.
14. Iwasaki, Matsubara. “Purification of alginate oligosacharides with
root growth-promoting activity toward lettuce”.
15. Preparation and structure elucidation of alginate oligosaccharides degraded by alginate lyase from Vibro sp. 510. Institute of Marine Drug and
Food, Ocean University of China, China. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
16. A structural basis for depolymerization of alginate by polysaccharide
lyase family-7. Devision of Agronomy and Horticultural Science, Graduate
School of Agriculture, Kyoto University, Japan.
17. Manabu Kitamikado, Chao-Huang Tseng, Kuniko Yamaguchi và Takasi Nakamura. Two Types of Bacterial Alginate Lyases. Depament of fisheries, Faculty Agriculture, Kyushu University, Japan.
18. Thiang Yian Wong, Lori A. Preston and Neal L Schiller. ALGINATE
LYASE: Review of Major Sources and Enzyme Characteristics, Structure- Function Analysis, Biological Roles and Applications. Division of Biomedical
Sciences, University of California.
19. Wataru Hashimoto, Osamu Miyake, Keiko Momma, Shigeyuki Kawai and Kousaku Murata. Molecular Indentification of Olicoalginate Lyase
of Sphingomonas sp. Strain A1 as one of the Enzymes Required for Complete Depolimerization of Alginate.Research Institure for Food Sience, Kyoto
University, Japan.
20. Scott CD. (1982) Immobilized cells: a review of recent literature.
Enzyme Microb Technol 9:66–73.
21. A novel alginate lyase from a marine bacterium Agarivorans Albus Ykw-34: purification and characterization
22. Nakagawa A, Ozaki T, Chubachi K, Hosoyama T, Okubo T, Iyobe S, Suzuki T. (1998) An effective method for isolating alginate lyase-producing Bacillus sp. ATB-1015 strain and purification and characterization of the lyase.
J Appl Microbiol 84:328–335.
23. Sutherland IW. (1995) Polysaccharide lyases. FEMS Microbiol Rev 16:323–347.
24. Scott CD. (1987) Immobilized cells: a review of recent literature.
Enzyme Microb Technol 9:66–73.
25. Yonemoto Y, Tanaka H, Yamashita T, Kitabatake N, Ishida Y, Kimura A, Murata K. (1993) Promotion of germination and shoot elongation of
some plants by alginate oligomers prepared with bacterial alginate lyase. J
Ferment Bioeng 75:68–70.
26. Iwamoto Y, Xu X, Tamura T, Oda T, Muramatsu T. (2003) Enzymatically depolymerized alginate oligomers that cause cytotoxic cytokine production in human mononuclear cells. Biosci Biotechnol Biochem 67:258– 263.
27. Uchida M. (1995) Enzyme activities of marine bacteria involved in
123:639–644.
28. Uchida M, Nakata K, Maeda M. (1997) Introduction of detrital food webs into an aquaculture system by supplying single cell algal detritus produced from Laminaria japonica as a hatchery diet for Artemia nauplii.
Aquaculture 154:125–137.
29. Elyakova LA, Favorov VV. (1974) Isolation and certain properties
of alginate lyase VI from the mollusk Littorina sp. Biochem Biophys Acta
358:341
30. Iwamoto Y, Araki R, Iriyama K, Oda T, Fukuda H, Hayashida S, Muramatsu T. (2001) Purification and characterization of bifunctional alginate (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lyase from Alteromonas sp. strain No. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem 65:133–142.
31. Hu X, Jiang X, Hwang HM. (2006) Purification and characterization
of an alginate lyase from marine bacterium Vibrio sp. mutant strain 510-64.
PHỤ LỤC 1. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng hiệu chuẩn theo độ nhớt của dung dịch Sucrose
0 20 40 60 80 100 120 140 160 2 2.5 3.2 4.4 6.2 9.5 15.5 28.3 58.9
Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu lựa chọn chủng vi sinh vật cĩ khả năng sinh tổng hợp algL cao
Loài vsv Thời gian(phút) C1 C2 mPa.s % mPa.s % 0 26,8 0,0 26,8 0,0 20 9,2 65,7 11,4 57,5 40 6,6 75,4 8,6 67,9 60 5,4 79,9 7,7 71,3
Cách quy đổi độ nhớt đo được thành mức độ hao tổn độ nhớt: Mức độ hao tổn độ nhớt = − 1×100%
η η
η (%)
Trong đó:
- η : độ nhớt ban đầu (mPa.s)
- η1 : Độ nhớt sau khi phân cắt (mPa.s)
Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm phân cắt các loại Na-alginate khác nhau bằng dịch enzyme thu được
Loại Na- alginate
Thời gian(phút)
A1 A2 A3
mPa.s % mPa.s % mPa.s %
0 34.6 0.0 17.2 0.0 26.8 0.0
20 8.4 75.7 6.2 64.0 7.3 64.0
40 5.1 85.3 4.8 72.1 5.1 72.1
A2: Na-alginate do Trung Quốc sản xuất
A3: Na-alginate do Trường ĐH Nha Trang sản xuất
Bảng 3.6. Kết quả xác định hoạt độ Enzyme Bảng 3.6a. Bảng đo độ nhớt (mPa.s)
E/S (/100ml) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Na-alg +dịch E 26,8 20,2 14,8 11,4 9,7 8,7 8,2 7,6 7,3 Na-alg +nước cất 26,8 26,2 25,4 24,4 23,1 21,8 21 20,2 19,5 E/S (/100ml) 0 10 11 12 13 14 15 Na-alg +dịch E 26,8 14,8 14,2 13,2 12,4 11,8 11,4 Na-alg +nước cất 26,8 Coi như thay đổi không đáng kể
Bảng 3.6a. Bảng quy đổi thành mức độ hao tổn độ nhớt (%)
E/S (/100ml) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Na-alg +dịch E 0,0 24,6 44,8 57,5 63,8 67,5 69,4 71,6 72,8 Na-alg +nước cất 0,0 2,2 5,2 9,0 13,8 18,7 21,6 24,6 27,2 E/S (/100ml) 0 10 11 12 13 14 15 Na-alg +dịch E 0,0 44,8 47,0 50,7 53,7 56,0 57,5 Na-alg +nước cất 0,0 Coi như hao tổn không đáng để
Bảng 37. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của
Klebsiella sp và khả năng phân cắt của AlgL
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời gian nuôi cấy (h) Sinh trưởng 105tb/1ml Độ nhớt mPa.s % 0 0 26,8 0,0 12 14 10,2 61,9 24 52 9,7 63,8 36 40 10,8 59,7 48 27 13,6 49,3 60 24 14,1 47,4 72 12 14,1 47,4
Bảng 3.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của ion kim loại đến khả năng phân cắt của algL
Bảng 3.8a. Kết quả đo độ nhớt (mPa.s)
Ion Kim
loại ĐC EDTA CaCl2 MnCl2 MgCl2 CuCl2 FeCl2 EnZyme + Ion kim loại 7,3 22,4 6,2 8,6 14,5 16,2 18.4 EnZyme + EDTA + Ion
kim loại 4,4 5,1 6,6 12,1 9
Bảng 3.8b. Kết quả quy đổi mức độ hao tổn độ nhớt (%)
loại
EnZyme + Ion kim loại 72,8 16,4 76,9 67,9 45,9 39,6 31,3 EnZyme + EDTA + Ion
kim loại 83,6 81,0 75,4 54,9 66,4
Bảng 3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL
T (0C) ĐC 10 20 30 37 40 50 60
Độ nhớt (mPa.s) 26,8 18,2 12,4 8,6 7,3 6,7 8,3 12,8
Mức độ hao tổn
độ nhớt (%) 0 32,1 53,7 67,9 72,8 75,0 69,0 52,2
Bảng 3.10. Kết quả nghiên cứu chọn tác nhân thích hợp để tách chiết algL
Tác nhân kết tủa ĐC (NH4)2SO4 Axetol Cồn 600
Độ nhớt (mPa.s) 26,8 2,3 4,6 5,4
Mức độ hao tổn độ nhớt (%) 0 91,4 82,8 79,9 Lượng E thu được (g/500ml) 0 1,04 1,12 1,36
PHỤ LỤC 2
HÓA CHẤT VAØ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
2.1. Hóa chất sử dụng
Bột Na-alginate, pepton, dịch chiết nấm men, NaCl, MgSO4,KH2PO4, EDTA, CaCl2, CuCl2,MnCl2, MgCl2, FeCl2, (NH4)2SO4, axetol, cồn 600, dung dịch đệm pH=7, dung dịch xanh Methylene, Crystal violet, Lugon, fucsine.
1. Kính hiển vi quang học 2. Tủ cấy vi sinh vật
Tủ được trang bị đèn cực tím để khử trùng và có quạt hút trong suốt quá trình làm việc.
3. Nồi hấp tiệt trùng
7. Máy đếm khuẩn lạc