3. Điểm mới và ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
1.5.4.2. Thu hồi chế phẩm enzyme
Các chế phẩm enzyme được ứng dụng trong thực tế với nhiều dạng khác nhau. Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp không cần tách tạp chất nếu các tạp chất đó không gây tác hại đáng kể đến sản phẩm và kỹ thuật sản xuất sau này ( ví dụ: sản xuất rượu, da)
Cũng có nhiều trường hợp người ta cần đến chế phẩm enzyme tinh khiết với mức độ khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng ( ví dụ: công nghiệp dệt, công nghiệp đường từ tinh bột, y học, nghiên cứu khoa học …).
Enzyme rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài do đó khi tinh chế enzyme cần tránh sự biến tính prôtêin, gây ảnh hưởng xấu đến hoạt tính của enzyme, cần tiến hành quá trình thu hồi nhanh ở nhiệt độ thấp. Nói chung không có một quy trình chung để chiết xuất và tinh chế enzyme. Tùy theo từng trường hợp mà người ta áp dụng các phương pháp chiết xuất và tinh chế khác nhau.
Chương 2
NỘI DUNG VAØ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu.
Những nội dung nghiên chính trong đề tài được trình bày trên sơ đồ sau:
Sơ đồ 2.1: Những nội dung nghiên cứu chính.
Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp alginate lyase trong tự nhiên.
Nuôi cấy chủng vi sinh vật ở 37oC, trong 2 ngày
Sinh khối và tách chiết alginate lyase từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn.
Bước đầu phân cắt các alginate khác nhau bằng alginate lyase
Xác định hoạt độ alginate lyase
Thu thập số liệu và đưa ra kết luận
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phân cắt alginate của alginate lyase
Nghiên cứu tách chiết alginate lyase từ dịch sinh khối bằng dung môi thích hợp
2.2. Các phương pháp nghiên cứu[3][6][7][8]
2.2.1. Phân lập vi sinh vật bằng kỹ thuật pha loãng
2.2.2. Kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật bằng phương pháp cấy ria và soi kính hiển vi
2.2.3. Giữ giống vi sinh vật bằng phương pháp cấy truyền định kỳ lên môi trường. 2.2.4. Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp đo độ nhớt
2.2.5. Xác định nhiệt độ và pH bằng nhiệt kế và pH kế 2.2.6. Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp cấy gạt 2.2.7. Thu hồi chế phẩm enzyme bằng phương pháp kết tủa
2.2.8. Định danh vi sinh vật bằng phương pháp giải trình tự gene 16S 2.2.9. Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Office Excel
2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.3.1. Bố trí nghiệm phân lập chủng vi khuẩn trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp algL
Alginate 1%
Đổ xuống đất
Lấy mẫu đất hòa vào nước tiệt trùng
Cấy vào môi trường agar chứa 1,5% algiante natri
Sơ đồ 2.3.1: Bố trí thí nghiệm phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp algL
Rong Nâu được ủ trong đất một thời gian cho đến khi bị mũn ra. Khi thấy rong đã bị phân hủy, chuẩn bị 100 ml dung dịch alginate 1%, đổ xuống khoảng 30cm2 đất đã ủ rong Nâu, định kỳ 2 ngày một lần, tiến hành liên tục trong 02 tháng. Sau đó lấy khoảng 1 g đất ở độ sâu từ 3 -5 cm cho vào 5ml nước tiệt trùng, trộn đều trên máy trộn mẫu, để ổn định rồi lấy 10 µl huyền phù nổi trên bề mặt cấy trang vào 10 ml môi trường thạch agar có chứa 1,5 % alginate natri như nguồn cacbon cơ bản, ủ ở 37oC trong 02 ngày.
2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp algL cao
Khuẩn lạc vi sinh vật sau khi phân lập
Thu hồi dịch enzyme Nuôi cấy và sinh khối
vi sinh vật Phân cắt dung dịch alginate 1% Lựa chọn chủng vi sinh thích hợp - Nhiệt độ: 370C - pH = 7,0 – 7,5 - tỷ lệ E/S = 4/10
Sơ đồ 2.3.2: Bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp algL cao
Môi trường và điều kiện nuôi cấy
− Thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường I) Na-alginate : 0,5%
Pepton : 0,1%
Dịch chiết nấm men: 0,5% CaCl2 : 0,5%
pH : 7,0 -7,5
− Thành phần môi trường sinh khối (môi trường II) Na-alginate : 0,5% Pepton : 0,5% Dịch chiết nấm men : 0,1% NaCl : 0,5% KH2PO4 : 0,1% MgSO4 : 0,1% pH : 7,0 -7,5
Sau khi phân lập trên môi trường agar có chứa 1,5% alginate ở 370C trong 2 ngày, khuẩn lạc của các vi sinh vật khác nhau có khả năng phân cắt natri alginate sẽ phát triển trên bề mặt của thạch.
Dùng que cấy vô khuẩn lấy một ít các khuẩn lạc này hòa vào 10ml nước cất vô trùng, rồi pha loãng đến 105 lần, sau đó lấy 10µl cấy trang lên môi trường thạch I, nuôi cấy 2 ngày ở 370C trong tủ ấm.
Đến khi trên môi trường thạch chỉ có những khuẩn lạc đã chọn phát triển(có thể coi là thuần khiết) thì sinh khối các chủng vi sinh vật này trong
phòng trong 2 ngày trên máy lắc với tốc độ 250v/p, tiếp tục lấy 3ml dịch sinh khối từ 10ml trên đổ vào bình tam giác 500ml chứa 100ml môi trường lỏng II rồi sinh khối trong điều kiện tương tự. Từ 100ml dịch sinh khối trên lấy tiếp 90ml đổ vào bình tam giác 1000ml chứa 500ml môi trường lỏng II và sinh khối ở nhiệt độ phòng, 370C, trên máy lắc 250v/p.
Lưu ý:
− Que cấy vòng sau khi lấy khuẩn lạc vi sinh vật trên môi trường thạch phải được khử trùng trên ngọn đền cồn trước khi lấy tiếp một khuẩn lạc vi sinh vật khác.
− Đối với các khuẩn lạc vi sinh vật khác nhau, tiến hành nuôi cấy và sinh khối trong các hộp lồng và bình tam giác khác nhau.
Làm lạnh dịch sinh khối thu được xuống 30C, rồi ly tâm với tốc độ 10.000v/p ở nhiệt độ 100C trong 30’. Thuỷ phân dung dịch natri alginate bằng các dịch enzyme thu được sau ly tâm ở điều kiện nhất định để lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng enzyme cao.
2.3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của chủng vi sinh vật được lựa chọn
Chủng vi sinh vật đã lựa chọn
Pha loãng bằng nước vô trùng
Cấy lên môi trường thạch I
Kiểm tra khuẩn lạc hoặc soi dưới kính hiển vi
Pha loãng bằng nước vô trùng
Sơ đồ 2.3.3: Bố trí thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của chủng vi sinh vật đã lựa chọn
Dùng que cấy vòng lấy một ít khuẩn lạc của vi sinh vật đã lựa chọn hòa trong 1ml nước cất tiệt trùng, tiếp tục pha loãng bằng cách dùng pipet lấy 0,1 ml từ ống nghiệm ban đầu đổ sang ống nghiệm có chứa 0,9ml nước cất tiệt trùng, tiếp tục pha loãng bằng cách lấy 0,1ml từ ống nghiêm thứ 2 đổ sang ống nghiệm thứ 3 có chứa 0,9 ml nước cất tiệt trùng, tiến hành tương tự cho đến ống nghiệm thứ 5, ta thu được dung dịch vi sinh vật được pha loãng 105
lần. Lấy 0,1 ml dung dịch vi sinh vật từ ống nghiệm thứ 5 cấy trang lên môi trường thạch I trong hộp lồng petri đã chuẩn bị trước.
Để dung dịch vi sinh vật ngấm vào môi trường trong vài phút. Lật ngược hộp lồng petri đã cấy vi sinh vật, nuôi trong tủ ấm ở 370C, trong thời gian 2 ngày. Sau 2 ngày nuôi cấy kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch, nếu các khuẩn lạc mọc riêng lẻ có hình dạng, màu sắc giống nhau thì có thể kết luận chủng vi sinh vật là thuần khiết, hoặc có thể kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật bằng cách soi dưới kính hiển vi hoặc cấy trang.
2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu dịch enzyme algL từ môi trường sinh khối
0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1ml 0,9ml 0,9ml 0,9ml 0,9ml
Sinh khối
T heo tài
liệu tham khảo thì quá trình thu dịch enzyme phải tiến hành ở nhiệt độ lạnh < 50C. Tuy nhiên, do điều kiện thí nghiệm nên dịch sinh khối được làm lạnh xuống 30C rồi ly tâm ở nhiệt độ 100C với tốc độ 10000 v/p trong 30 phút.
2.3.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phân cắt các loại Natri alginate khác nhau bằng dung dịch enzyme thu được
Alginate Thái Lan (A1)
Alginate Trường ĐH Nha Trang(A3) Alginate Trung Quốc(A2) Sản phẩm sau phân cắt Phân cắt Nhiệt độ: 370C pH = 7,0 ÷ 7,5 Thời gian: 20’, 40’, 60’ 10 / 4 = S E Đo độ nhớt
Sơ đồ 2.3.5: Thí nghiệm phân cắt các loại natri alginate khác nhau bằng dung dịch enzyme thu được
Các mẫu natri alginate khác nhau được mã hóa là các mẫu A1, A2, A3 và pha thành 100 ml dung dịch 1%, đựng trong bình tam giác 250 ml, thêm vào mỗi bình 40 ml dung dịch enzyme vừa thu được, điều chỉnh pH = 7,0 – 7,5 rồi tiến hành phân cắt ở nhiệt độ 370C trong thời gian 20’, 40’, 60’.
Đo độ nhớt sản phẩm thu được ở 200
C.
2.3.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme
Sơ đồ 2.3.6: Bố trí thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme
Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp độ nhớt
Nguyên tắc: theo tài liệu nghiên cứu của các tác giả A. Nakagawa, T. Ozaki, K. Chubachi, T. Hosoyama thuộc chuyên ngành Sinh học – Trường Đại học Teikyo và Khoa sinh học ứng dụng – Trường Đại học Utsunomiya. Để xác định hoạt độ enzyme algL có 2 phương pháp, phương pháp độ nhớt và
100ml dung dịch natri alginate 1% Phân cắt - Dung dịch enzyme 5 ÷ 40 ml - pH = 7,0 ÷ 7.5 - t0 = 37 0C - thời gian: 20’ Sản phẩm sau phân cắt Đo độ nhớt Kết luận
phương pháp so màu với axit uronic. Với phương pháp độ nhớt thì một đơn vị hoạt độ của enzyme algL được định nghĩa là lượng enzyme làm giảm 50% độ nhớt của dung dịch natri alginate 1% trong 20 phút.
Phân cắt natri alginate với 5 ÷ 40 ml ( bước nhảy 5ml) dung dịch enzyme trong 20’, sau đó tiến hành độ nhớt và xác định một đơn vị hoạt độ tương ứng với bao nhiêu ml dung dịch enzyme.
Tiến hành: Chuẩn bị 9 bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml dung dịch
natri alginate 1%, trong đó một bình đối chứng và 8 bình còn lại lần lượt được bổ sung từ 5 ÷ 40 ml (bước nhảy 5 ml) dung dịch enzyme, phân cắt ở nhiệt độ 370C, trên máy lắc tốc độ 250 v/p trong 20 phút.
Đo độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế roto ở 200
C.
2.3.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của vi sinh vật và khả năng phân cắt của algL
Khuẩn lạc vi sinh vật Sinh khối 1 Sinh khối 2 12h 24h 36h 48h 60h 72h Ly tâm Phân cắt alginate - pH = 7,0 – 7,5 - To = 370C - =210 S E thời gian = 20’
Sơ đồ 2.3.7. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng thuỷ phân alginate
Dùng que cấy vòng vô trùng lấy một ít khuẩn lạc vi sinh vật trên môi trường thạnh I rồi sinh khối lần 1 trong bình tam giác 500ml có chứa 100 ml môi trường II trong 12h ở nhiệt độ phòng trên máy lắc tốc độ 250 v/p.
Chuẩn bị 6 bình tam giác 500ml có chứa 100ml môi trường II có đánh số thứ tự từ 1 đến 6 để sinh khối lần 2 bằng cách: lần lượt lấy 10ml dung dịch sinh khối lần 1 đã qua 12h sinh khối cho vào lần lượt 6 bình tam giác nói trên, đặt 6 bình tam giác lên máy lắc tốc độ 250 v/p, ở nhiệt độ phòng và sinh khối ở các thời gian khác nhau. Bình tam giác 1 sinh khối trong 12h, bình tam giác 2 sinh khối trong 24h, lần lượt cho các bình tam giác 3,4,5,6 sinh khối với thời gian lần lượt là 36h, 48h, 60h, 72h.
Sau khi đạt thời gian sinh khối, tiến hành ly tâm dịch sinh khối với tốc độ 10.000 v/p ở nhiệt độ 100C trong thời gian 30 phút.
Dịch enzyme thu được sau khi ly tâm được dùng để phân cắt dung dịch alginate 1%, từ đó xác định được sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy vi sinh vật đến khả năng phân cắt alginate của enzyme alginte lyase.
Sự phát triển của vi sinh vật được xác định bằng cách đếm tế bào bằng phương pháp cấy gạt
2.3.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất kim loại đến khả năng phân cắt của algL
Sơ đồ 2.3.8: Ảnh hưởng của các hợp chất kim loại đến khả năng phân cắt của algL
Chuẩn bị 12 bình tam giác 250 ml chứa 100 dung dịch alginate 1%, trong đó một bình đối chứng chỉ phân cắt với 40ml dung dịch enzyme, 1 bình phân cắt với 40ml dịch enzyme đã được xử lý với 1mM EDTA, 5 bình tam giác phân cắt với dịch enzyme đã được bổ sung 2mM các muối kim loại, 5 bình còn lại phân cắt bằêng enzyme đã xử lý 1mM EDTA và 2mM các muối kim loại.
Các muối kim loại được sử dụng là: CaCl2, MnCl2, MgCl2, CuCl2, FeCl2.
Phân cắt trong thời gian 20 phút, sau đó đo độ nhớt và xác định được ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phân cắt của algL.
Dung dịch natri alginate 1%
Phân cắt pH = 7,0 ÷ 7,5
to = 370C
Các muối kim loại 10 4 = S E thời gian = 20’ Sản phẩm sau phân cắt Đo độ nhớt Kết luận
2.3.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL
Sơ đồ 2.3.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL
Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL được thí nghiệm từ 10 ÷ 60oC, với bước nhảy là 10.
Dung dịch natri alginate 1% Phân cắt pH = 7,0 ÷ 7,5 to = 10 ÷ 60 0C 10 4 = S E thời gian = 20’ Sản phẩm sau phân cắt Đo độ nhớt Kết luận
2.3.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu chọn tác nhân kết tủa thích hợp để thu hồi algL từ dịch enzyme
Sơ đồ 2.3.10. Bố trí thí nghiệm ngiên cứu chọn tác nhân kết tủa thích hợp để tách chiết AlgL
Tiến hành thí nghiệm thu hồi chế phẩm enzyme thô từ dịch sinh khối bằng muối trung tính (NH4)2SO4 (thêm trực tiếp vào dịch enzyme cho tới khi bão hòa, thường là đạt 70%, luôn giữ dịch enzyme ở nhiệt độ 40C).
Cồn 600 và acetol được thêm vào dịch enzyme với tỷ lệ 1:1, giữ ở nhiệt độ 40C trong 12h. Sau đó ly tâm để thu hồi chế phẩm enzyme thô.
Làm lạnh (4 0C) Kết tủa 12h ở 4 0C Ly tâm 1000 v/p Dịch enzyme Enzyme thô - (NH4)2SO4 bão hòa - Dung môi: Cồn 600, acetol -pH = 7,0 – 7,5 - T0 = 4 0C - Tỷ lệ = 1:1 Phân cắt Na-alg 1% Chọn dung môi thích hợp - E/S = 0,5g/100ml - T0 = 370C - pH = 7,0 – 7,5 - thời gian = 20’
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VAØ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp enzyme algL
Nhận xét:
Sau 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 370C, trên cùng một môi trường thạch chỉ có natri alginate1,5% là nguồn cacbon cơ bản thấy có 2 loại khuẩn lạc phát triển, một có màu trắng sữa và một có màu mỡ gà. Tiếp tục phân lập 2 loại vi sinh vật này ở nồng độ pha loãng 10-5 trên môi trường thạch, khuẩn lạc của 2 loại này phát triển như hình 3.1a và 3.1b.
Dựa vào hình 3.1a và 3.1b thấy rằng trên môi trường thạch, khuẩn lạc của 2 chủng vi sinh vật này đều có hình tròn, phát triển riêng lẻ tuy nhiên khuẩn lạc màu trắng sữa có đường kính (1÷2mm) lớn hơn so với khuẩn lạc màu mỡ gà (<1mm), khuẩn lạc màu trắng sữa cũng phát triển với mật độ dày hơn so với khuẩn lạc màu mỡ gà.
Từ kết quả nghiên cứu có thể kết luận rằng cả hai chủng vi sinh vật
Hinh 3.1a: VSV có khuẩn