nghiên cứu ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HUỲNH NGHĨA NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XỬ LÝ TẾ BÀO GỐC MÁU CUỐNG RỐN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP HỒ CHÍ MINH - Năm 2007 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề : Cho đến nay, nhiều nghiên cứu giới chứng minh máu cuống rốn (MCR) thay tủy xương dùng để ghép cho bện lý hệ tạo máu ưu điểm sau : (1) Dễ tiến hành thu thập, (2) Tỉ lệ nhiễm virus thấp, CMV, (3) Có nhiều người cho thời gian tìm phù hợp HLA rút ngắn lại,(4) Dung nạp miễn dịch tốt, không phù hợp HLA từ 1-3 kháng nguyên,(5) Tần xuất GVHD thấp nhẹ, dễ dàng điều trị sau ghép Từ lợi điểm mà nước giới nước khu vực tiến hành tổ chức thu thập, xử lý lưu trữ tối đa mẫu MCR công nghệ tiên tiến để sẵn sàng cho điều trị cho bệnh nhân Tại Việt Nam, việc tìm hiểu yếu tố MCR sản phụ người Việt Nam Trung tâm Truyền máu Huyết học TP Hồ Chí Minh thực kết cho thấy MCR sản phụ người Việt Nam đủ tiêu chuẩn sản phẩm sử dụng ghép để thay cho nguồn tế bào gốc từ tủy xương máu ngoại biên Do vậy, để tiến tới xây dựng ngân hàng MCR TP Hồ Chí Minh đáp ứng tiêu chuẩn quốc tế thật mang lại lợi ích cho cộng đồng, , tiến hành nghiên cứu ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn Thực nghiên cứu này, mong muốn đạt mục tiêu sau : Xây dựng hoàn thiện quy trình tuyển mộ, sàng lọc người cho trước thu thập MCR Chuẩn hóa hoàn thiện quy trình kỹ thuật thu thập MCR sau giai đoạn xổ 2 Chuẩn hóa hoàn thiện quy trình xử lý MCR kỹ thuật có chất trầm lắng HES (Hydroxy Ethyl-Starch) Chuẩn hóa hoàn thiện quy trình lưu trữ sản phẩm tế bào máu gốc MCR nhiệt độ –1960C Chuẩn hóa hoàn thiện xét nghiệm sinh học: đếm số lượng tế bào nhân , số lượng tế bào CD34 (+), nuôi cấy khúm tế bào , đếm tế bào sống xét nghiệm sàng lọc vi khuẩn, virus theo giai đoạn để đánh giá chất lượng sản phẩm tế bào gốc đạt tiêu chuẩn Đánh giá hiệu ứng dụng sản phẩm tế bào gốc MCR xử lý thực hành ghép Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP Hồ Chí Minh Tính cấp thiết đề tài : Tổng kết 10 năm điều trị bệnh máu Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP Hồ Chí Minh cho kết : Các bệnh lý ác tính chiếm: 50,24% tổng số bệnh nhân Trong số định điều trị ghép khoảng 20% (700 bệnh nhân) Nhưng không tìm người cho phù hợp để ghép, dị ghép tuỷ xương cho bệnh nhân 18 bệnh nhân tự ghép tế bào gốc máu ngoại vi 3% số bệnh nhân có định điều trị ghép Các bệnh Hemoglobin bệnh Thalassemia chiếm 12% tổng số bệnh nhân Trong loại bệnh có dị ghép mà tự ghép , tất bệnh nhân thể nặng bệnh Thalassemia có định ghép, dị ghép bệnh nhân Nguyên tìm người cho phù hợp anh em đồng huyết thống ít, mà người cho huyết thống chưa thành lập sở liệu ngân hàng tuỷ quốc gia, chưa gia nhập hệ thống truy tìm quốc tế Do vậy, quan niệm ghép tế bào gốc phướng pháp điều trị tối ưu nhu cầu tìm nguồn tế bào khác khả thi MCR để xử lý tạo thành sản phẩm trị liệu, tồn trử đông lạnh lâu dài ngân hàng, sẵn sàng để truy tìm ghép cho bệnh nhân nhu cầu thiết nay, phù hợp với đường hướng đại hoá y học nước nhà Những đóng góp luận án : - Xây dựng hoàn thiện bước tuyển chọn –sàng lọc người cho MCR trước thu thập - Chuẩn hóa hoàn thiện quy trình thu thập MCR sau giai đoạn xổ nhau, bên cạnh rút nhiều kinh nghiệm tổ chức phối hợp nhân viên chuyên môn người thu thập MCR Chọn lựa thể tích MCR ≥ 60ml điện di Hemoglobin trước xử lý MCR thích hợp để tránh lãng phí số lượng tế bào nhân thấp mang mầm bệnh di truyền - Đã áp dụng hoàn thiện quy trình xử lý MCR có chất HES để tạo sản phẩm tế bào gốc ổn định - Hoàn thiện quy trình lưu trữ đông lạnh tự động tế bào gốc Nitơ lỏng -1960C Đây kỹ thuật công nghệ sinh học tiến tiến có ý nghóa khoa học cao - Chuẩn hoá hoàn thiện xét nghiệm để đánh giá số lượng chất lượng sản phẩm MCR bao gồm : đếm tế bào CD34+, tế bào sống, nuôi cấy khúm tế bào lồng ghép vào quy trình thu thập, xử lý lưu trữ đông lạnh MCR - Hoàn thiện quy trình dị ghép tế bào MCR cho bệnh nhân chẩn đoán bệnh máu ác tính β Thalassemia thể nặng 4 Đóng góp lớn đề tài chuẩn hóa hoàn thiện quy trình ngân hàng MCR đạt tiêu chuẩn quy ước sản phẫm tế bào gốc MCR đảm bảo an toàn cho ghép Bố cục luận án : Luận án gồm 147 trang, bao gồm phần mở đầu trang, tổng quan tài liệu 43 trang, đối tượng phng pháp nghiên cứu 23 trang, kết nghiên cứu 33 trang, bàn luận 40 trang, kết luận trang kiến nghị trang Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử phát triển : Năm 1974, Konedtzon – Ogawa-cs chứng minh có diện tế bào gốc MCR Năm 1984 – 1985, Bosey Edward, Broxmeyer-cs thực nghiệm ghép MCR chuột, năm 1988, Gluckman cs thực ghép MCR cho em bé mắc bệnh Fanconi thành công Sau năm này, có nhiều nghiên cứu sinh học, miễn dịch giới tế bào gốc MCR , từ năm 1991-1997, hàng loạt trường hợp ghép MCR thực trẻ em người lớn thành công mức độ khác Từ 1998 cho đế nay, giới khu vực có nhiều ngân hàang MCR nhà nước tư nhân thành lập để thu thập, xử lý lưu trữ lâu dài MCR để ghép , MCR xem nguồn tế bào gốc thay cho tuỷ xương để ghép 1.2 Tế bào gốc hình thành phát triển : Chúng hình thành từ trung bì phôi thai túi noãng hoàng , từ ngày thứ 18.5 có hồng cầu tế bào CD34+, ngày thứ 24 – 34 tế bào tiền thân dòng lymphô dòng tủy Từ tuần lể thứ 7, gan nơi tạo máu , tháng thứ lách nơi tạo máu từ tháng thứ 4- thứ 5, tủy xương nơi tạo máu tuổi trưởng thành Đặc tính tạo dòng tế bào gốc tạo máu tế bào đa tự thay để chuyển sang giai đoạn biệt hóa cao đồng thời dần tính đa chúng Có loại tế bào gốc tạo máu : (1) Tế bào gốc tạo máu dài hạn : số lượng , non, chưa biệt hóa mang dấu ấn CD34+, Thy+ Lin-, chúng có khả tự tái tạo biệt hóa cao (2) Tế bào gốc tạo máu ngắn hạn : trưởng thành, có khả tái tạo tuần sinh nhóm CFU-E, CFUGEMM, CFU-L 1.3 Máu cuống rốn : Đặc điểm sinh học : Chứa nhiều tế bào gốc , gấp lần so với tủy xương Tần xuất tế bào gốc MCR/ml : BFU – E:8.103, CFU – GM : 13-24 103, CFU – GEMM: 1-10 103 Caùc tế bào nuôi cấy lâu dài CFU ( tuần ) biệt hóa thành 1/13.000 TBĐN ( tuần ) 1/34.000 TBĐN Tế bào gốc MCR mang tế bào CD34+ cao, khoảng 1% TBĐN, tế bào CD34+HLADR- CD34+38- MCR cao tủy xương Đặc điểm miễn dịch học : MCR có khả dung nạp miễn dịch cao tủy xương tế bào lympho CD3 ít, tế bào NK thấp đặc biệt tế bào Lympho T mang hoạt tính thấp ( tế bào CD4,CD8; điểm tiếp nhận CCR5 cytokin thấp IL10 cao) phản ứng GVHD thấp GVL vẩn hữu 1.4 Thu thập, xử lý lưu trữ tế bào gốc : bước yếu tổ chức xây dựng ngân hàng MCR Trên giới có nhiều nghiên cứu vế quy trình này, lại bao gồm quy trình sau: (1) quy trình sàng lọc chọn lựa người cho MCR, (2) quy trình thu thập MCR trước sau xổ nhau, tiêu chuẩn quy ước để thu thập,(3) quy trình xừ lý MCR bao gồm : quay ly tâm “ Top and Bottom”, có thêm chất trầm lắng (HES), phương phạp lọc, quy trình có lợi điểm khác (4) quy trình lưu trữ đông lạnh tế bào gốc MCR, hầu hết ngân hàng chọn hế thống đông lạnh MCR với Nitơ lỏng (1960C), hệ thống đông lạnh có kiểm soát tốc độ.(5) Đặc biệt xét nghiệm đánh giá số lượng chất lượng máu cuống rốn lồng ghép vào quy trình để đảm bảo tối ưu sản phẩm MCR cho lưu trử lâu dài Các xét nghiệm bao gồm: Đếm tế bào nhân, tế bào CD34+, tế bào sống, sàng lọc vi khuẩn, virus, sàng lọc bệnh hemoglobin, nuôi cấy khúm tế bào 1.5 Ứng dụng ghép tế bào gốc máu cuống rốn : Cho đến có nhiều ngân hàng MCR thành lập, Châu Á tính đến 5/2005 có 90.000 mẫu MCR lưu trữ 625 mẫu MCR ghép người lớn trẻ em Trên giới, 3/2006 có 100.000 mẫu lưu trữ 2530 trẻ em 1697 người lớn ghép MCR 70 bệnh lý thuộc bệnh máu ác tính di truyền bẩm sinh sử dụng MCR để điều trị Sau năm theo dõi ghép MCR trẻ em tỉ lệ sống không bệnh từ 48-78%, người lớn 26-53% Các biến chứng sau ghép GVHD thấp, nhiên tỉ lệ nhiễm trùng sau ghép cao ghép tủy xương tế bào gốc máu ngoại vi thời gian mọc bạch cầu hạt chậm Chương ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng : - Máu cuống rốn thu thập từ sản phụ theo tiêu chuẩn chọn lựa để xử lý thành đơn vị tế bào gốc MCR đạt tiêu chuẩn, mẫu lưu trữ lâu dài để sử dụng cho ghép -Các bệnh nhân bệnh bạch cầu cấp dòng tủy, bạch cầu cấp dòng lymphô nhóm nguy cao đạt lui bệnh sau hoá trị bệnh βThalassemia thể nặng , tuổi từ đến 15 tuổi , có chức tim, phổi, gan, thận bình thường 2 Phương pháp nghiên cứu : Chúng áp dụng phương pháp thực nghiệm mô tả ghép thử nghiệm Các bước nghiên cứu thiết kế sau : 2.2.1 Các sản phụ sàng lọc chọn lựa thu thập theo tiêu chuẩn : lâm sàng bình thường xét nghiệm virus B,C,HIV, VDRL âm tính 2.2.2 Các mẫu máu cuống (MCR) thu thập từ sản phụ sau giai đoạn xổ hệ thống kín, vô trùng 2.2.3 Các mẫu MCR đạt tiêu chuẩn (≥ 60ml + điện di hemoglobin (-) chọn lựa xử lý Các mẫu MCR xử lý kỹ thuật quay ly tâm có chất Hydroxyethyl starch (HES) 2.2.4 Các mẫu MCR lưu trữ hệ thống đông lạnh tự động với Nitơ lỏng nhiệt độ -1960C 2.2.5 Các xét nghiệm để đánh giá số lượng chất lượng mẫu MCR bao gồm số lượng tế bào nhân, tế bào CD34+, tế bào sống, nuôi cấy khúm tế bào, xét nghiệm sàng lọc vi khuẩn, vi nấm,virus,bệnh di truyền Các xét nghiệm lồng ghép vào quy trình 2.2.6 Các bệnh nhân chọn lựa để thực ghép tế bào gốc từ MCR theo quy trình dị ghép tế bào gốc với bước sau : Điều kiện hóa trước ghép Busulphan Endoxan, tế bào gốc MCR sau rã đông 370C truyền ( ghép) cho bệnh nhân đường tónh mạch trung ương, phòng ngừa thải ghép Methotrexate Cyclosporin, theo dõi chăm sóc vô trùng sau ghép Chương KẾT QUẢ Từ tháng 10/2002 10/2005, khảo sát sàng lọc trước thu thập thu thập MCR với kết sau: - Tư vấn sàng lọc trước thu thập 486 sản phụ BV Từ Dũ 8 - Tổ chức thu thập 1234 mẫu MCR – có 712 (57.6%) mẫu MCR Bệnh viện Hùng Vương 522 (42.4%) mẫu MCR Bệnh viện Từ Dũ 3.1 Kết tư vấn sàng lọc trước thu thập máu cuống rốn : Chúng tiến hành tư vấn, phát phiếu thăm dò ngẫu nhiên cho 486 sản phụ đến khám thai sanh BV Từ Dũ kết cho thấy gần 50% trường hợp không đạt tiêu chuẩn trước định thu thập MCR.Các lý loại bỏ trước thu thập MCR chủ yếu bệnh lý sản khoa nhiễm trùng (37.2%) 3.2 Kết thu thập máu cuống rốn 3.2.1 Thời gian thu thập mẫu MCR : phút 17 giây 3.2.2 Số lượng mẫu MCR thu thập : 1234 mẫu thu thập, đạt tiêu chuẩn 965 mẫu ( 78,2%), không đạt 269 mẫu(21.8%) 3.2.3 Thể tích MCR thu thập :Thể tích trung bình mẫu MCR thu thập trước xử lý 81.71± 18.98 (60 - 207) ml 3.2.4 Lý loại bỏ MCR sau thu thập : Tỉ lệ loại bỏ trước xử lý chủ yếu không đủ trọng lượng cao 50% trường hợp, bệnh lý hemoglobin (20%) 3.2.5 Đặc điểm sản khoa người cho MCR: Bảng 3.14: Đặc điểm sản khoa người cho MCR (n = 965) Đặc điểm sản khoa Tần suất Trung Độ lệch (%) bình chuẩn - Tuổi mẹ (năm) 27.89 5.36 - Số lần sanh trước (lần) +0 468 (48.5) +1 346 (35.8) +2 127 (13.4) + >3 24 (2.2) - Tuổi thai ( tuần) 39.25 1.07 - Trọng lượng em bé(gram) - Trọng lượng (gram) - Giới tính em bé + Nam + Nữ 3159.61 679.81 369.08 103.08 445 (46.1) 520 (53.9) 3.2.6 Đặc điểm mẫu MCR thu thập Bảng 3.15: Đặc điểm mẫu MCR thu thập (n = 965) Đặc điểm Trung Độ Thấp bình lệch chuẩn - Thể tích MCR (ml) 81.71 18.98 60 - Thời gian thu thập (phút) 4.17 1.5 2.7 - SL hồng cầu/ml ( x 109) 3.4 0.5 2.5 - SL hồng cầu/túi ( x 109) 297.28 130.83 159.39 - Hb (g/dL) 11.36 2.42 9.9 - Hb / tuùi (g/dl) ( x 10 ) 994.88 494.80 434.0 - SL TBN/ml ( x 103) 10.23 3.15 4.63 - SL TBN/tuùi ( x 10 ) 84.36 35.79 30.86 - SLTBCD34+/ túi (x106) 2.36 1.97 0.78 ( n=181) Cao 207 5.8 4.91 849.43 17.4 3010.2 26.7 311.50 7.89 3.2.7 Keát khảo sát tương quan yếu tố sản khoa mẫu MCR thu thập Bảng 3.16 Tương quan TP MCR yếu tố sản khoa : Thành phần Phân tích đa biến MCR Các yếu tố Hệ số tương quan tương quan Thể tích MCR - Trọng lượng 0.442 Số lượng tế bào - Trọng lượng 0.314 nhân MCR - Thể tích MCR 0.645 - Tuổi mẹ -0.164 Tế bào CD34+ - Thể tích MCR 0.332 - Số lượng TBN 0.645 p 0.05) 4.2.2 Thể tích thu thập MCR : Có khác biệt tác giả Trần Văn Bé ( 59.3±16ml) có lẻ loại bỏ mẫu MCR 19 0.05 4.2.3 Khảo sát tương quan yếu tố sản khoa thể tích MCR: Với phân tích đơn biến đa biến, nhận thấy trọng lượng có liên quan với thể tích MCR ( r=0.422, p0.05), trọng lượng thể tích MCR có liên quan (r=0.341) ( r=0.654) Với chọn ngưỡn TBN 80x 107, nhận thấy có khác biệt rõ rệt TBN< 80x 107 TBN≥80x107, kết qủa tương đồng nghiên cứu Solves.P ( p>0.05) 4.2.5 Về thành phần tế bào CD34+ : Có khác biệt kết với tác giả Trần Văn Bé Trần Quôc Dũng ( p 85% sau xử lý ( p>0.05) Duy có điểm bất lợi kỹ thuật (1) thời gian để xử lý mẫu nhiều (>70 phút), (2) khả loại bỏ hồng cầu không đồng tốc độ trầm lắng khác chất HES tùy thuộc vào người cho 4.3.4 Kết nuôi cấy tế bào sau xử lý: So sánh kết qủa nuôi cấy khúm tế bào với tác giả nước ngoài, nhận thấy có khác biệt số lượng khúm tế bào mọc ( p0.05) 4.5 Quy trình dự trữ đông lạnh MCR sau xử lý -1960C: 21 Chúng nhận thấy khác biệt thông số bao gồm : số lượng TBN, TB CD34+, TB sống CFU sản phẩm MCR trước sau lưu trử MCR -1960C vào thời điểm tháng, năm, năm năm ( p>0.05) Kết qủa khác biệt tác giả nước ( nghiên cứu lưu trữ 10 năm) 4.6 Về kết lây nhiễm virus : Tỉ lệ nhiễm vius MCR thấp nhiều tỉ lệ nhiễm dân số Việt Nam (p60ml (78.2%), có liên quan chặt chẽ trọng lượng thai thể tích MCR thu thập (3) Đã chuẩn hoá hoàn thiện quy trình xử lý TBG tạo máu (kỹ thuật HES) với kết sau xử lý sản phẩm TBG tạo máu đạt tiêu chuẩn số lượng chất lượng tế bào gốc > 85% (4) Đã chuẩn hoá hoàn thiện quy trình lưu trữ sản phẩm tế bào gốc điều chế từ MCR với chất bảo quản DMSO 10% dự trữ Nitơ lạnh -1960C theo quy trình tự động hóa Số mẫu MCR lưu trữ đạt tiêu chuẩn 874 mẫu (91.1%) theo thời gian lưu trữ đông lạnh, thành phần MCR thay đổi số lượng chất lượng (p>0.005) (5) Đã chuẩn hóa hoàn thiện quy trình đánh giá số lượng chất lượng sản phẩm tế bào gốc từ MCR bao gồm:  Các xét nghiệm số lượng tế bào gốc: Đếm số lượng tế bào nhân, đếm tế bào CD34+  Các xét nghiệm chất lượng MCR: đếm tế bào sống, nuôi cấy khúm tế bào (BFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM) 23  Các xét nghiệm cấy vi khuẩn, nấm bệnh lây nhiễm mẫu MCR: HBsAg laø 2.86%; anti HBc laø 0.32%; antiHCV laø 1.59%; anti HTLV1 0.32%; nhiễm khuẩn thu thập laø 2.54%; anti CMV laø 0.88%; anti HIV: 0.4%; VDRL 0%  Tổng số MCR bị loại bỏ sau lưu trữ đông lạnh 8.9% (6) Đã sử dụng sản phẩm TBG MCR điều chế để ghép cho BN (2 nam, nữ), tuổi - 15 tuổi mắc bệnh bạch cầu cấp bệnh Thalassemia Các sản phẩm MCR nghiên cứu so với sản phẩm MCR Tokyo cung cấp khác biệt (p>0.05) Dựa kết trên, nghiên cứu ứng dụng hoàn thiện quy trình xử lý tế bào gốc MCR ngân hàng MCR đầy đủ chặt chẽ thích ứng với điều kiện Việt Nam, xét nghiệm sử dụng để sàng lọc, đánh giá chất lượng số lượng tế bào gốc có tính chuyên biệt độ tin cậy cao Vì sản phẩm tế bào gốc từ MCR nghiên cứu đạt tiêu chuẩn đảm bảo an toàn cho mọc mảnh ghép KIẾN NGHỊ Qua kết kết luận nghiên cứu, có số kiến nghị sau: Cần có phối hợp ngân hàng MCR tổ chức truyền thông ngành, phủ để thông tin rộng rãi (báo chí, truyền thanh, truyền hình) vai trò lợi ích MCR Cần có hợp tác ngân hàng MCR với sở điều trị sản khoa địa phương để có phối hợp chặt chẽ việc 24 chuẩn hoá hoàn thiện quy trình thu thập, thông tin sản khoa, thông tin sản phẩm MCR liệu người cho em bé sau sanh Cần có pháp định rõ ràng việc tổ chức thu thập, sàng lọc sử dụng MCR, có có đầu tư phát triển nước lãnh vực phát triển chuyên sâu tế bào gốc MCR nói riêng tế bào gốc nói chung (Stem Cell) Cho đến nay, ngân hàng MCR TP Hồ Chí Minh thành viên Hiệp hội MCR Châu Á (ASIA CORD).Với hội này, nghó cần có đầu tư Chính phủ, nhà nước Ngành Y tế để có ổn định phát triển chuyên ngành tế bào gốc Việt Nam sản phẩm tế bào gốc với thương hiệu “ Made in Viêt Nam” không sử dụng Châu Á mà nước khác giới  ... cho cộng đồng, , tiến hành nghiên cứu ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn Thực nghiên cứu này, mong muốn đạt mục tiêu sau : Xây dựng hoàn thiện quy trình tuyển mộ, sàng lọc người... TBN tế bào CD34+ sau xử lý 12 Bảng 3.20: Khả tăng số lượng tế bào nhân tế bào CD34 + sau xử lý Mẫu MCR (n=960) Tế bào nhân (x 106/ml) Trước xử lý Sau xử lý 10.23 ± 14.06 32.86 ± 3.23 Tế bào đơn... : đếm tế bào CD34+, tế bào sống, nuôi cấy khúm tế bào lồng ghép vào quy trình thu thập, xử lý lưu trữ đông lạnh MCR - Hoàn thiện quy trình dị ghép tế bào MCR cho bệnh nhân chẩn đoán bệnh máu ác