Nghiên cứu quy trình phân lập chất đối chiếu từ cây rau đắng đất (glinus oppositifolius (l ) aug dc)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN HỮU SƠN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ CÂY RAU ĐẮNG ĐẤT (Glinus oppositifolius (L.) Aug DC) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN HỮU SƠN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ CÂY RAU ĐẮNG ĐẤT (Glinus oppositifolius (L.) Aug DC) Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỊ THU CÚC PGS TS NGUYỄN NGỌC VINH Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Nguyễn Hữu Sơn v BẢNG TÓM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG VIỆT Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học – Năm học 2016-2018 “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ CÂY RAU ĐẮNG ĐẤT (Glinus oppositifolius (L.) Aug DC)” NGUYỄN HỮU SƠN Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Thị Thu Cúc PGS.TS Nguyễn Ngọc Vinh Đặt vấn đề Rau đắng đất dược liệu thuộc họ Rau đắng đất, mọc phổ biến miền nam Việt Nam với hai thành phần hóa học flavonoid saponin Cây thường sử dụng để trị bệnh da hay bệnh gan Hiện nay, thị trường có nhiều chế phẩm chứa dược liệu Rau đắng đất chưa có chuẩn đối chiếu để đánh giá chất lượng dược liệu Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết nghiên cứu chiết xuất, phân lập thiết lập vitexin vicenin từ Rau đắng đất để phục vụ công tác kiểm nghiệm nhằm nâng cao chất lượng dược liệu sản phẩm từ dược liệu Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Dược liệu Rau đắng đất công ty BV Pharma cung cấp phơi khô Phương pháp nghiên cứu: (1) Chiết xuất, phân lập tinh chế hai flavonoid từ Rau đắng đất (2) Kiểm tra độ tinh khiết xác định cấu trúc hợp chất thu (3) Xác định độ tinh khiết chất phân lập phương pháp quy phần trăm diện tích pic HPLC với quy trình thẩm định (4) Thiết lập hai hợp chất phân lập để làm chất chuẩn (5) Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời hai chất phân lập dược liệu Kết (1) Từ 3,0 kg rau đắng đất chiết 180 g cao methanol toàn phần, tiến hành sắc ký cột với dung môi rửa giải: n-hexan, cloroform, dicloromethan, ethyl acetat aceton Hai phân đoạn cao ethyl acetat aceton tiếp tục sắc ký tinh chế sắc ký cột điều chế, thu 341 mg GF1 230 mg GF2 (2) Xác định cấu trúc GF1 GF2 vitexin vicenin (3) Độ tinh khiết sắc ký HPLC vitexin vicenin phân lập 99,36% 99,04% (4) Thiết lập đánh giá vitexin vicenin làm chất đối chiếu (5) Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời vitexin vicenin dược liệu Kết luận Phân lập thiết lập thành công hai chất chuẩn flavonoid với độ tinh khiết cao xây dựng quy trình định lượng đồng thời hai flavonoid nhằm phục vụ kiểm nghiệm thành phần flavonoid dược liệu rau đắng đất v BẢNG TÓM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG ANH Final essay for the degree as a Master of Pharmacy – Academy year: 2016-2018 A STUDY OF PROCEDURES FOR ISOLATION OF REFERENCE STANDARDS FROM GLINUS OPPOSITIFOLIUS NGUYEN HUU SON Supervisor: PharmD Le Thi Thu Cuc Assoc Prof PharmD Nguyen Ngoc Vinh Introduction Glinus oppositifolius is a medicinal plant which belongs to family Molluginaceae and widely distributed in the South of Vietnam Its two main constituents which are saponins and flavonoids are used traditionally in the treatment of skin diseases, liver problems… On the market, there are many products containing this herbal from which no marker was established for herbal assessment According to this issue, a study of isolation of flavonoid constituents from Herba Glini oppositifolii is conducted Materials and methods Materials: Glinus oppositifolius was provided by BV Pharma Co and was shadedried Methods: (1) Extract, isolate and purify flavonoids (2) Test the purity and identify the structures of isolated substances (3) Determine the content of isolated substances by calculating percentage of pic area on validated high performance liquid chromatography methods (4) Establish the reference standards from isolated substances (5) Develop the assays of the two isolated substances in herbal Results (1) 180 g methanol extract from 3,0 kg Herba Glini oppositifolii was chromatographed on silica gel using successively n-hexane, chloroform, dichloromethan, ethyl acetate and acetone The ethyl acetat and acetone fractions were chromatographed and purified by preparative HPLC-ODS to give 341 mg of GF1 and 230 mg of GF2 (2) Identify that GF1 and GF2 were vitexin and vicenin respectively (3) The contents of isolated vitexin and vicenin based on the percentages of pic area on validated HPLC method were determined respectively as 99,36% and 99,04% (4) Establish vitexin and vicenin reference standards (5) Establish and validate the simultaneous assays of vitexin and vicenin in herbal Conclusion From Herba Glini oppositifolii, isolate and establish two high purified flavonoid references standards, establish the simultaneous assays of them for evaluating flavonoid contents in Glinus oppositifilius i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xiii DANH MỤC SƠ ĐỒ xvi MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan thực vật học .2 Tổng quan thành phần hóa học Tổng quan tác dụng dược lý - công dụng CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 Nguyên liệu 15 Hóa chất, dung môi 15 Dụng cụ, trang thiết bị 15 Kiểm tra tính dược liệu 16 Chiết xuất, phân lập tinh chế flavonoid .19 Kiểm tra độ tinh khiết xác định cấu trúc chất phân lập .22 Xây dựng thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết chất phân lập phương pháp HPLC quy phần trăm diện tích pic 23 Thiết lập chất đối chiếu 25 ii Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời vicenin vitexin dược liệu Rau đắng đất 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .31 Mơ tả hình thái thực vật 31 Đặc điểm vi học 31 Định tính phản ứng hố học 35 Định danh dược liệu phương pháp DNA 35 Khảo sát dung môi chiết xuất 37 Khảo sát thời gian chiết xuất 38 Khảo sát số lần chiết xuất .38 Chiết xuất cao toàn phần 39 Phân lập flavonoid 39 Hợp chất GF1 44 Hợp chất GF2 49 Quy trình xác định độ tinh khiết vitexin phương pháp HPLC quy phần trăm diện tích pic 55 Thẩm định quy trình phân tích xác định độ tinh khiết vitexin .55 Quy trình xác định độ tinh khiết vicenin phương pháp HPLC quy phần trăm diện tích pic 60 Thẩm định quy trình phân tích xác định độ tinh khiết vicenin 61 Thiết lập chất đối chiếu vitexin 66 Thiết lập chất đối chiếu vicenin 69 ii Xây dựng quy trình định lượng 71 Thẩm định quy trình định lượng 77 CHƯƠNG BÀN LUẬN 88 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 PHỤ LỤC PL.1 x DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt Từ nguyên DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao ICH International Conference on Harmonisation Hiệp hội Quốc tế hài hoà hóa quy định, thủ tục IR Infrared Hồng ngoại MS Mass spectroscopy Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 13 13 1 C-NMR H-NMR Ý nghĩa tiếng Việt C - Nuclear Magnetic Resonance H - Nuclear Magnetic Resonance COSY Correlation Spectroscopy DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single-Quantum Correlation NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy PA Pure analyses Tinh khiết phân tích PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PDA Photodiode Array Dãy diod quang RNA Ribonucleic acid RP-18 Reverse phase - 18 Pha đảo C-18 RT Retention time Thời gian lưu RSD% Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SKLM Sắc ký lớp mỏng S/N Signal/Noise Tỉ lệ tín hiệu/nhiễu UV Ultraviolet Tử ngoại x DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục dung môi – hóa chất sử dụng 15 Bảng 2.2 Danh mục trang thiết bị sử dụng .15 Bảng 3.1 Kết khảo sát dung môi chiết 37 Bảng 3.2 Chương trình gradient pha động khảo sát HPLC phân tích 41 Bảng 3.3 Bảng so sánh số khối lý thuyết phân tử dự đoán số khối hợp chất GF1 48 Bảng 3.4 Bảng so sánh phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6, ppm 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6, ppm) GF1 vitexin 48 Bảng 3.5 Bảng so sánh số khối lý thuyết số khối chất GF2 52 Bảng 3.6 Bảng so sánh phổ 13C-CPD (125MHz, DMSO-d6, ppm 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6, ppm) GF2 với phổ 13C-CPD (125MHz, DMSO-d6, ppm 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6, ppm) vicenin 52 Bảng 3.7 Các thông số sắc ký tương ứng với đỉnh vitexin sau lần tiêm liên tiếp 56 Bảng 3.8 Nồng độ mẫu cho khảo sát khoảng tuyến tính 58 Bảng 3.9 Kết tuyến tính diện tích đỉnh theo nồng độ mẫu thử 58 Bảng 3.10 Nồng độ mẫu thử cho thẩm định độ lặp lại 59 Bảng 3.11 Kết thẩm định độ lặp lại quy trình xác định độ tinh khiết vitexin 59 Bảng 3.12 Kết độ xác trung gian ngày khác .60 Bảng 3.13 Giá trị S/N diện tích lần tiêm giá trị phát 60 Bảng 3.14 Các thông số sắc ký tương ứng với đỉnh vicenin sau lần tiêm liên tiếp .61 Bảng 3.15 Nồng độ mẫu cho khảo sát khoảng tuyến tính 63 Bảng 3.16 Kết tuyến tính diện tích đỉnh theo nồng độ mẫu thử vicenin 63 Bảng 3.17 Chuẩn bị mẫu cho thẩm định độ lặp lại 64 Bảng 3.18 Kết thẩm định độ lặp lại quy trình xác định độ tinh khiết vicenin 65 Bảng 3.19 Kết độ xác trung gian ngày khác .65 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Sắc ký đồ dữ liệu gốc độ xác trung gian – Thẩm định quy trình định lượng hai chất đồng thời 1/2 PL.105 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 2/2 PL.106 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Sắc ký đồ dữ liệu gốc độ – Thẩm định quy trình định lượng hai chất đồng thời 1/3 PL.107 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 2/3 PL.108 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 3/3 PL.109 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Sắc ký đồ dữ liệu gốc mẫu trắng – Thẩm định quy trình định lượng hai chất đồng thời PL.110 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Sắc ký đồ dữ liệu gốc giới hạn phát vitexin – Thẩm định quy trình định lượng hai chất đồng thời 1/2 PL.111 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 2/2 PL.112 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Sắc ký đồ dữ liệu gốc giới hạn phát vicenin – Thẩm định quy trình định lượng hai chất đồng thời 1/2 PL.113 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 2/2 PL.114 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Sắc ký đồ dữ liệu gốc giới hạn định lượng vitexin – Thẩm định quy trình định lượng hai chất đồng thời 1/2 PL.115 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 2/2 PL.116 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Sắc ký đồ dữ liệu gốc giới hạn định lượng vicenin – Thẩm định quy trình định lượng hai chất đồng thời 1/2 PL.117 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 2/2 PL.118 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Khảo sát chương trình gradient pha động PL.119 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... trình phân lập chất đối chiếu từ Rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L. ) Aug DC)? ?? đề xuất với mục tiêu sau: - Phân lập chất đối chiếu vicenin vitexin từ Rau đắng đất - Xây dựng quy trình định... MINH - NGUYỄN HỮU SƠN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ CÂY RAU ĐẮNG ĐẤT (Glinus oppositifolius (L. ) Aug DC) Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc... tốt nghiệp thạc sĩ dược học – Năm học 2016-2018 “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU TỪ CÂY RAU ĐẮNG ĐẤT (Glinus oppositifolius (L. ) Aug DC)? ?? NGUYỄN HỮU SƠN Giảng viên hướng dẫn: TS Lê