Rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) Aug. DC, Molluginaceae) với thành phần flavonoid có khả năng ức chế vi sinh vật được xem như một nguồn nguyên liệu kháng sinh thực vật đầy hứa hẹn để bào chế thuốc kháng khuẩn dùng ngoài.
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 57 ịnh lượng flavonoid toàn phần cao kh Rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) Aug DC.) phương pháp quang phổ UV-Vis Nguy n Thị Kim Liên*, Chế Quang Minh, Nguy n Hương Thư Khoa Dược, i học Nguy n Tất Thành, * ntklien@ntt.edu.vn Tóm tắt Rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) Aug DC, Molluginaceae) với thành phần flavonoid có khả ức chế vi sinh vật xem nguồn nguyên liệu kháng sinh thực vật đầy hứa hẹn để bào chế thuốc kháng khuẩn dùng ể tiến hành tiêu chuẩn hóa chế phẩm bước xây dựng thẩm định qui trình định lượng ho t chất nguyên liệu đầu vào Cao kh Rau đắng đất xác định hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo quercetin phương pháp đo quang phổ UV-Vis với thuốc thử t o phức nhôm nitrat bước sóng 418nm cho kết 621mg quercetin/1g cao kh Phương pháp thẩm định đ t tính tuyến tính độ đặc hiệu độ xác độ ® 2019 Journal of Science and Technology - NTTU ặt vấn đề Rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) Aug DC., Molluginaceae) loài cỏ d i phổ biến vùng nhiệt đới châu Á Theo y học cổ truyền Rau đắng đất (RDD) có tác dụng lợi tiểu, nhuận gan, h nhiệt; dịch chiết từ RDD trị ngứa bệnh da Nhiều cơng trình nghiên cứu ngồi nước chứng minh dược liệu có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm tốt, ngồi có tác dụng chống oxi hóa, kháng viêm kích thích tái sinh mô [1,3] Dược liệu RDD d ng tươi d ng phơi kh có nồng độ ho t chất dao động gi a lần thu ho ch bị ảnh hưởng điều kiện trồng trọt, thu hái xử lí, bảo quản Cao kh điều chế từ dược liệu có chất lượng ổn định nên thích hợp sử dụng làm nguyên liệu điều chế sản phẩm Hiện nay, C ng ty BV Pharma sản xuất thương m i hóa sản phẩm cao kh Rau đắng đất Tuy nhiên, tiêu định lượng mẫu cao BV Pharma cung cấp dựa hàm lượng chất chiết ethyl acetat nên có tính ứng dụng kh ng cao Hơn n a, nghiên cứu có chưa đề cập đến vấn đề chất điểm (marker) đ i diện cho dược liệu RDD Các phép định lượng tiến hành RDD gói gọn hai phương pháp đo quang phổ UV-Vis, định lượng phenol tồn phần tính theo acid gallic pyrocatechol, sử dụng thuốc thử Folin – Ciocalteu, hai định lượng flavonoid tồn phần tính theo quercetin, sử dụng thuốc thử muối nhôm[3,4] Việc định lượng ho t chất Nhận 30.10.2018 ược duyệt 20.02.2019 Công bố 26.03.2019 Từ khóa Glinus oppositifolius, rau đắng đất, flavonoid, quercetin, đo quang UV-Vis ngun liệu đầu vào đóng vai trò quan trọng q trình thiết kế cơng thức chế phẩm Do đó, cần có qui trình định lượng phù hợp để kiểm tra hàm lượng ho t chất cao khơ RDD RDD có chứa lượng đáng kể flavonoid thành phần có tác dụng kháng khuẩn chống oxi hóa[2] Vì đề tài tiến hành xây dựng qui trình định lượng ho t chất cao khơ RDD dựa flavonoid tồn phần phương pháp đo quang phổ UV-Vis với thuốc thử t o màu nhơm nitrat Qui trình khảo sát điều kiện tiến hành thẩm định tiêu tính tuyến tính độ đặc hiệu độ xác độ Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Cao kh Rau đắng đất (Extractum Glini oppositifolii siccum) cung cấp BV Pharma, Việt Nam Chất đối chiếu quercetin Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP Hồ Chí Minh cung cấp độ tinh khiết 91,3% Ethanol, nhôm nitrat, natri acetat, acid acetic Trung Quốc sản xuất Các thuốc thử thuộc lo i tinh khiết phân tích Trang thiết bị nghiên cứu gồm có máy đo quang phổ UVVis Shimadzu, cân phân tích Ohaus PA214 dụng cụ thường qui phòng thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 58 2.2.1 Xây dựng qui trình định lượng flavonoid cao kh Rau đắng đất phương pháp quang phổ UV – Vis sau t o phức với Al(NO3)3 Pha chế dung dịch thử nghiệm: Dung môi A: dung môi ethanol 80% có 5% acid acetic; dùng vòng sau pha Dung dịch đối chiếu: cân xác 10mg quercetin cho vào bình định mức 100ml hòa tan điền đến v ch dung môi A Dung dịch thử: Khảo sát sơ nhiều tỉ lệ mối tương quan với độ hấp thu dung dịch đối chiếu Dung dịch thử pha cách cân xác mẫu cao RDD 0,50g; 1,00g; 1,50g 2,00g cho vào cốc khuấy kĩ với 50ml dung môi A cho vào bình định mức 100ml, tráng kĩ cốc điền đến v ch dung môi A; lắc đều, lọc qua giấy lọc thu dung dịch thử Các thuốc thử: Dung dịch Al(NO3)3 10%, dung dịch natri acetat 10% pha dung môi A Mẫu trắng (khơng có thuốc thử) dung dịch tương ứng với mẫu đo khơng có thuốc thử Al(NO3)3 10% Các mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn mẫu trắng tương ứng pha cách cho dung dịch đối chiếu và/hoặc dung dịch thử, dung dịch natri acetat 10%, thuốc thử Al(NO3)3 10% (đối với mẫu đo) Các mẫu để ổn định 45 phút nhiệt độ phòng t o điều kiện cho q trình t o phức xảy hồn tồn Sau tiến hành đo thăm dò độ hấp thu mẫu bước sóng tham khảo 415nm[3,5], chọn nồng độ thích hợp dung dịch thử cho mẫu thử có độ hấp thu tương ứng với mẫu chuẩn Pha l i mẫu thử, mẫu chuẩn mẫu thử thêm chuẩn theo cách tương tự, tiến hành quét phổ mẫu vùng bước sóng từ 380 – 600nm để chọn bước sóng định lượng phù hợp 2.2.2 Thẩm định qui trình định lượng Qui trình thẩm định tính đặc hiệu, xác định khoảng tuyến tính độ độ lặp l i ứng dụng để xác định hàm lượng flavonoid mẫu cao Khảo sát tính đặc hiệu Dò tìm tỉ lệ thuốc thử phù hợp, sau thêm đầy đủ thành phần, lắc ể yên 45 phút tiến hành quét phổ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn từ khảo sát tính đặc hiệu chọn bước sóng định lượng Khảo sát tính tuyến tính Khảo sát tính tương quan gi a nồng độ độ hấp thu quercetin Pha dãy dung dịch quercetin nồng độ khác 0,100; 0,200; 0,300; 0,400; 0,500mg/ml, phối hợp với thuốc thử Tiến hành đo độ hấp thu bước sóng chọn Thiết lập phương trình hồi qui y = ax + b Tính tương thích phương trình hồi qui y = f(x) đánh giá trắc nghiệm F Ý nghĩa hệ số a b đánh giá trắc nghiệm t Đại học Nguyễn Tất Thành Khảo sát độ xác: Pha mẫu có nồng độ khoảng 0,100mg/ml thực phản ứng t o phức riêng lẻ đo độ hấp thu tính hàm lượng flavonoid tồn phần theo quercetin Xử lí thống kê, xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Phương pháp đ t độ xác RSD ≤ 2% Cơng thức: √ ∑ ̅ với xi giá trị đo thứ i, ̅ giá trị trung bình, n số lần đo ̅ Khảo sát độ đúng: Thêm lượng chất chuẩn tương ứng với 80%, 100%, 120% hàm lượng trung bình quercetin có mẫu thử Tiến hành thử lần mức, ghi nhận độ hấp thu bước sóng chọn Xác định tỉ lệ hồi phục trung bình Phương pháp đ t độ tỉ lệ hồi phục nồng độ riêng biệt có giá trị khoảng 100 ± 2% với RSD ≤ 2% 2.2.3 ịnh lượng flavonoid tồn phần cao khơ Rau đắng đất ịnh lượng cao RDD theo qui trình thẩm định Tiến hành lần lấy kết trung bình Cơng thức tính hàm lượng flavonoid tồn phần cao RDD định lượng phương pháp quang phổ UV – Vis: X K Với X (mg/kg) hàm lượng flavonoid toàn phần cao; a; b hệ số phương trình tuyến tính chuẩn y = ax + b; At độ hấp thu bước sóng định lượng mẫu thử p lượng cân thực tế (g), K hệ số pha loãng Kết bàn luận 3.1 Xây dựng qui trình định lượng Pha mẫu theo tỉ lệ Bảng để ổn định 45 phút đo độ hấp thu 415nm Kết trình bày Bảng cho thấy nồng độ dung dịch thử 1g/100ml phù hợp để pha mẫu thử, nồng độ cho mẫu thử có độ hấp thu nằm vùng 0,2 – 0,8 có giá trị gần với mẫu chuẩn Vậy dung dịch thử pha từ 1g cao khô, thêm dung môi A vừa đủ 100ml, lọc lấy dịch Bảng Chuẩn bị mẫu đo quang Trắng Trắng Thử chuẩn thử 0 5 1 1 Vừa đủ 25ml Mẫu Chuẩn Dung dịch đối chiếu (ml) Dung dịch thử (ml) Al(NO3)3 10% (ml) CH3COONa 1M (ml) Ethanol 80% có 5% acid acetic 1 Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 59 Bảng Kết đo độ hấp thu mẫu thử nghiệm 415nm Mẫu Chuẩn Thử 0,5 g/100 ml Thử 1,0 g/100 ml Thử 1,5 g/100 ml Thử 2,0 g/100 ml Độ hấp thu 0,219 0,138 0,280 0,425 0,547 3.2 Thẩm định qui trình 3.2.1 Tính đặc hiệu Kết kiểm tra tính đặc hiệu qui trình định lượng trình bày Hình Mẫu thử mẫu chuẩn có hình d ng phổ tương tự với đỉnh vùng bước sóng khảo sát Tuy nhiên đỉnh hấp thu mẫu thử mẫu chuẩn không trùng khớp; cụ thể đỉnh mẫu chuẩn bước sóng 423nm mẫu thử 412nm, cách 11nm iều mẫu thử pha từ cao dược liệu có thành phần chất tan phức t p, mẫu chuẩn pha từ chất tinh khiết Khi quét phổ mẫu thử thêm chuẩn xuất đỉnh hấp thu chung 418nm, nằm gi a hai đỉnh chất chuẩn mẫu thử; đồng thời thêm chất chuẩn vào mẫu thử thực phản ứng độ hấp thu mẫu thử tăng lên rõ rệt so với lúc chưa thêm chất chuẩn (Bảng 2) Kết đo độ hấp thu bước sóng 418nm cho thấy có phù hợp gi a giá trị hấp thu mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn Do kết luận phương pháp định lượng flavonoid toàn phần theo quercetin quang phổ UV – Vis đ t u cầu tính đặc hiệu bước sóng 418nm chọn để đo độ hấp thu mẫu Hình Phổ UV – Vis mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn Bảng Kết khảo sát tính đặc hiệu Bước sóng (nm) 418 418 418 Mẫu Mẫu chuẩn Mẫu thử Mẫu thử thêm chuẩn Độ hấp thu 0,230 0,271 0,457 3.1.2 Tính tuyến tính Tương quan gi a nồng độ độ hấp thu dung dịch quercetin chuẩn trình bày Bảng Bảng Kết khảo sát tính tuyến tính Lượng quercetin (mg/ml) ộ hấp thu 418 nm Độ hấp thu 0,100 0,176 0,300 0,557 0,400 0,752 0,500 0,938 Các số liệu cho thấy có tương quan tuyến tính gi a nồng độ độ hấp thu quercetin theo phương trình y = 1,908x – 0,0142 với R2 = 0,9998; khoảng hàm lượng quercetin từ 0,100 – 0,500mg/ml Sử dụng trắc nghiệm t F cho thấy hai hệ số (a=1,908 b = 0,0142) phương trình hồi qui có ý nghĩa phương trình hồi qui tương thích y = 1.908x - 0.0142 R² = 0.9998 0.8 0,200 0,368 0.6 0.4 0.2 0 418 0.2 0.4 0.6 mg/ml Hình Kết khảo sát tính tuyến tính chuẩn quercetin 3.1.3 ộ xác Từ lần cân thực phản ứng t o phức riêng lẻ đo độ hấp thu tính hàm lượng flavonoid tồn phần theo quercetin (mg/g) cao RDD kết Bảng Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 60 Bảng Kết khảo sát độ xác mẫu thử Lần thử Khối lượng Hàm lượng flavonoid toàn phần A 418 Kết mẫu thử (g) tính theo quercetin (mg/g) ̅ 1,0018 0,2363 2,621 1,0014 0,2356 2,615 SD = 0,0052 RSD = 0,20% 1,0021 0,2369 2,623 e = ± 0,0061 1,0015 0,2367 2,626 µ = 2,6196 ± 0,0061 1,0013 0,2358 2,617 1,0008 0,2352 2,612 Kết có RSD < 2% nên qui trình định lượng đ t độ xác 3.1.4 ộ Kết khảo sát độ trình bày Bảng Tỉ lệ hồi phục trung bình mức nằm giới h n cho phép Phương pháp đ t yêu cầu độ Bảng Kết khảo sát độ Tỉ lệ chuẩn thêm vào (%) Thêm chuẩn (mg) Tìm thấy (mg) 2,1 2,1 2,1 2,5 2,5 2,5 3,0 3,0 3,0 80 100 120 4,709 4,719 4,709 5,138 5,138 5,128 5,641 5,652 5,662 Tỉ lệ hồi phục Tỉ lệ hồi phục trung (%) bình (%) RSD (%) 99,55 99,71 100,05 0,29 99,55 100,69 100,55 100,69 0,24 100,28 100,65 101,00 101,00 0,35 101,35 3.2 Ứng dụng Qui trình thẩm định ứng dụng để định lượng flavonoid toàn phần cao kh Rau đắng đất, tiến hành đo lần lấy kết trung bình Hàm lượng flavonoid toàn phần ghi nhận 2,621mg quercetin/1g cao khô RDD Bảng Hàm lượng flavonoid cao kh Rau đắng đất Hàm lượng flavonoid Mẫu Lượng cân (g) Độ hấp thu (mg quercetin/g) 1,0018 0,236 2,618 1,0028 0,237 2,626 1,0012 0,236 2,620 Hàm lượng trung bình 2,621 Tuy nhiên, số liệu thu khơng lặp l i kết Hàm lượng tăng lần so với cao kh ban đầu phù công bố quốc tế thành phần flavonoid hợp với kết nhóm tác giả Mandal cộng RDD báo định lượng mẫu cao (2012) ethanol Kết định lượng cao kh ban đầu cao sau tinh Tiếp tục tinh chế mẫu cao RDD ethanol 90%, thu chế cho thấy qui trình định lượng có tính ứng dụng có cao ethanol RTC (độ ẩm 14,5%) Tiến hành định phù hợp với nghiên cứu công bố lượng cao RTC qui trình x y dựng Kết luận đề xuất Bảng Hàm lượng flavonoid cao RTC Mẫu Lượng cân (g) 0,5011 0,5017 0,5004 Hàm lượng trung bình Độ hấp thu 0,335 0,336 0,334 Đại học Nguyễn Tất Thành Hàm lượng flavonoid (mg quercetin/g) 7,305 7,317 7,294 7,305 Quercetin chọn chất đối chiếu để so sánh kết với qui trình định lượng flavonoid tồn phần Rau đắng đất nghiên cứu trước đ y Việc thiết kế mẫu trắng khác biệt: mẫu thử có thuốc thử nhơm nitrat mẫu trắng kh ng có tác nh n giúp qui trình có tính chọn lọc Qui trình khảo sát nồng độ tỉ lệ sử dụng thuốc thử mẫu thử để t o mẫu đo phù hợp nhất: Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số phức t o thành suốt đ t yêu cầu định lượng quang phổ UV-Vis Qui trình đ t yêu cầu thẩm định, kết nằm giới h n cho phép Hàm lượng flavonoid toàn phần mẫu cao khô 2,621mg quercetin/1g cao ề tài x y dựng thẩm định qui trình định lượng flavonoid tồn phần cao khơ RDD tính theo quercetin quang phổ UV – Vis góp phần vào công tác kiểm tra nhanh hàm lượng nguyên liệu đầu vào, triển khai vào thực tế sản xuất xí nghiệp dược phẩm nước Hơn n a, quercetin chất chuẩn thường dùng phương pháp định lượng flavonoid toàn phần (do thành phần phổ biến nhiều lo i dược liệu) 61 l i khơng có thành phần flavonoid Rau đắng đất Chính thế, kết thẩm định tính đặc hiệu qui trình định lượng flavonoid cao RDD tính theo quercetin chưa có tính thuyết phục cao Do để qui trình có độ đặc hiệu cao cần phải tìm chất điểm khác từ nh ng flavonoid phân lập từ RDD vitexin vicenin-2 y hướng nghiên cứu t i chưa tìm thấy cơng bố chủ đề Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quĩ Phát triển khoa học công nghệ i học Nguy n Tất Thành đề tài mã số 2018.01.35/H -KHCN Tài liệu tham khảo 1.Shi-Yuan Sheu et al (2014) “Recent progress in Glinus oppositifolius research” Pharmaceutical Biology; 52(8): 1079– 1084 2.Juliana Janet R Martin-Puzon et al (2015) “TLC profiles and antibacterial activity of Glinus oppositifolius L Aug DC (Molluginaceae) leaf and stem extracts against bacterial pathogens” Asian Pacific Journal of Tropical Diseases; 5(7): 569574 3.K AsokKumar M UmaMaheswari (2009) “Free radical scavenging and antioxidant activities of Glinus oppositifolius (carpet weed) using different in vitro assay systems” Pharmaceutical Biology, 47(6): 474–482 4.Mandal et al (2012) “Anthelmintic and free-radical scavenging potential of various fractions obtained from foliar parts of Glinus oppositifolius (Linn.) DC” International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4(4): 233-239 5.Nguy n H u L c Thủy cs (2011) “ ịnh lượng flavonoid toàn phần trinh n hoàng cung Crinum latifolium L (Amaryllidaceae) phương pháp quang phổ UV – Vis” Y Học TP Hồ Chí Minh, Tập 15(1): 90-94 Determination of total flavonoids in Glinus oppositifolius (L.) Aug DC dry extract by UV-Vis using spectrophotometry method Nguyen Thi Kim Lien*, Che Quang Minh, Nguyen Huong Thu Faculty of Pharmacy, Nguyen Tat Thanh University *ntklien@ntt.edu.vn Summary Carpet weeds (Glinus oppositifolius (L.) Aug DC, Molluginaceae), which contains flavonoids with the ability to inhibit microorganisms, are considered a promising source of plant-based antibiotics for the production of topical antibacterial formulations In order to standardize the products, the first step is to develop and validate the process of quantifying the active ingredients in the raw materials Carpet weed was determined by quantitating the total flavonoid content of quercetin by UV-Vis spectrophotometry method with complex aluminium nitrate reagent at 418nm, yielding 2.621mg quercetin/g dry extract The method has been validated and achieved linearity, specificity, precision and accuracy Keywords Glinus oppositifolius, carpet weed, flavonoid, quercetin, UV-Vis spectrophotometry Đại học Nguyễn Tất Thành ... ịnh lượng flavonoid toàn phần cao khô Rau đắng đất ịnh lượng cao RDD theo qui trình thẩm định Tiến hành lần lấy kết trung bình Cơng thức tính hàm lượng flavonoid toàn phần cao RDD định lượng phương. .. phương pháp định lượng flavonoid toàn phần (do thành phần phổ biến nhiều lo i dược liệu) 61 l i thành phần flavonoid Rau đắng đất Chính thế, kết thẩm định tính đặc hiệu qui trình định lượng flavonoid. .. thẩm định ứng dụng để định lượng flavonoid toàn phần cao kh Rau đắng đất, tiến hành đo lần lấy kết trung bình Hàm lượng flavonoid tồn phần ghi nhận 2,621mg quercetin/1g cao khô RDD Bảng Hàm lượng