Xây dựng quy trình định lượng saponin toàn phần trong giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang. Từ quy trình đã xây dựng tiến hành định lượng và so sánh hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu Giảo cổ lam 5 lá và 7 lá thu hái tại Thái Nguyên.
ISSN: 1859-2171 e-ISSN: 2615-9562 TNU Journal of Science and Technology 207(14): 187 - 194 ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG DƯỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM (GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM) LÁ VÀ LÁ THU HÁI TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG Bùi Thị Luyến*, Phạm Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Thu Quỳnh, Nguyễn Duy Thư, Nguyễn Thị Cải Trường Đại học Y Dược - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng saponin tồn phần giảo cổ lam phương pháp đo quang Từ quy trình xây dựng tiến hành định lượng so sánh hàm lượng saponin toàn phần dược liệu Giảo cổ lam thu hái Thái Nguyên Phương pháp: Định lượng saponin toàn phần giảo cổ lam phương pháp đo quang.Chiết xuất saponin dược liệu phương pháp siêu âm với dung môi ethanol 70% Tinh chế n – buthanol Saponin toàn phần thu thực tiến hành phản ứng Rosenthaler, sử dụng dung dịch màu tạo thành sau phản ứng để đo quang Lượng saponin toàn phần tính theo đường chuẩn Gypenoside XVII chuẩn Kết luận: Đã ứng dụng phương pháp đo quang để định lượng saponin toàn phần giảo cổ lam, hàm lượng saponin toàn phần loài lá: 5,76% loài lá: 4,69% Từ khóa: định lượng, giảo cổ lam, saponin toàn phần, độ hấp thụ tử ngoại UV-vis Ngày nhận bài: 19/9/2019; Ngày hoàn thiện: 16/10/2019; Ngày đăng: 17/10/2019 QUANTIFICATION OF TOTAL SAPONIN IN GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM WITH LEAVES AND LEAVES COLLECTED IN THAI NGUYEN BY PHOTOMETRIC METHOD Bui Thi Luyen*, Pham Thi Tuyet Nhung, Nguyen Thu Quynh, Nguyen Duy Thu, Nguyen Thi Cai University of Medicine and Pharmacy - TNU ABSTRACT Objective: Developing a procedure to quantify total saponins in gynostemma pentaphyllum therefore, quantitative and comparative the content of total saponin in gynostemma pentaphyllum with leaves and leaves which were collected in Thai Nguyen by photometric method Method: Quantify total saponin in gynostemma pentaphyllum by photometric method Extract saponins in medicinal herbs by ultrasonic method with 70% ethanol solvent Refined with n buthanol The total saponin obtained was performed by Rosenthaler reaction, using color solution formed after the reaction to measure photometer The total saponin content was calculated using the Gypenoside XVII calibration curve Conclusion: Applied photometric method to quantify total saponin in gynostemma pentaphyllum, there was more content of total saponin in gynostemma pentaphyllum with leaves (5.76%) than leaves (4.69%) Key words: quantification, wholves, total saponins, UV-vis spectrophotometric, gynostemma pentaphyllum Received: 19/9/2019; Revised: 16/10/2019; Published: 17/10/2019 * Corresponding author Email: builuyentn@gmail.com http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 187 Bùi Thị Luyến Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN Đặt vấn đề Giảo cổ lam vị thuốc sử dụng từ lâu đời nhiều nước châu Á với công dụng tăng cường sức khỏe tuổi thọ Nhiều báo cáo khoa học chứng minh thành phần giảo cổ lam flavonoid saponin, với tác dụng: hạ đường huyết, chống oxi hóa bảo vệ tế bào gan, giảm cholesterol triglycerol máu…, saponin cho thành phần có tác dụng sinh học chủ yếu Do tác dụng tốt cho sức khỏe nên sản phẩm Giảo cổ lam tiêu thụ mạnh thị trường nhiều nước Châu Á, Châu Âu Hoa Kỳ Tuy nhiên gần đây, số kết nghiên cứu đưa có khác thành phần hóa học sản phẩm Giảo cổ lam lưu hành thị trường [1], [2], [3] Sự khác thành phần hóa học liên quan đến loài Giảo cổ lam Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tơi tiến hành đề tài:’’ Định lượng saponin tồn phần dược liệu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) thu hái Thái Nguyên phương pháp đo quang” Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị Nguyên liệu - Các mẫu Giảo cổ lam thu hái Thái nguyên, phơi khô, độ ẩm 10%, nghiền nhỏ rây qua rây có cỡ mắt 0,25 mm bảo quản nơi khô - Chất chuẩn: Chất chuẩn Gypenoside XVII cung cấp Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương -Hóa chất , thuốc thử: vanillin, acid acetic băng, acid perchloric, methanol, ethyl acetat n-butanol Các hóa chất, thuốc thử đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích - Dụng cụ, thiết bị: Tủ sấy, cân phân tích; máy đo hàm ẩm XM 60, Thụy Sỹ;bể điều nhiệt Sartorius, Đức; Máy cất chân không; Máy quang phổ UV-VIS Hitachi U-1900; bếp điện; bếp đun cách thủy 2.2 Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm 2.2.1 Xây dựng phương pháp 188 207(14): 187 - 194 Kỹ thuật lựa chọn để phân tích: phương pháp đo quang cần phải tiến hành tạo màu phản ứng Rosenthaler dung dịch mẫu dung dịch thử với thuốc thử vanillin/acid acetic băng, acid percloric Điều kiện phân tích khảo sát: Quét phổ hấp thụ khoảng bước sóng 420-700nm mẫu chuẩn mẫu trắng sau thực phản ứng tạo màu Sử dụng bước sóng cực đại thu để tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng Khảo sát trình sử lý mẫu: phương pháp chiết (Soxhlet siêu âm); dung môi chiết gồm methanol, ethanol 70%, ethanol 90% ; tỷ lệ dung môi : dược liệu khác nhau; thời gian chiết khác 2.2.2 Thẩm định phương pháp Thẩm định tiêu chí theo hướng dẫn AOAC: tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác (độ lặp lại) 2.2.3 Ứng dụng Định lượng saponin toàn phần dược liệu Giảo cổ lam Giảo cổ lam thu hái Thái Nguyên 2.2.4 Xử lý số liệu Các số liệu thực nghiêm xử lý thống kê phần mềm Microsoft Office Excel Tính kết Dựa vào đường chuẩn tính nồng độ saponin C (µg/ml) Gọi M khối lượng dược liệu ban đầu sử dụng a hàm ẩm dược liệu; V thể tích dung dịch chiết; k hệ số pha lỗng msaponin tồn phần = k x V x C (µg) = k x 10-6 x V x C Hàm lượng saponin tồn phần có giảo cổ lam X% = (*) Kết nghiên cứu 3.1 Chuẩn bị mẫu Dung dịch chuẩn gốc gypenoside XVII 0,2 mg/ml: cân xác 10,0 mg chất chuẩn http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Bùi Thị Luyến Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN gypenoside XVII pha methanol vừa đủ 50 ml Dung dịch chuẩn: Hút xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc gypenoside XVII vào bình định mức 10ml, pha lỗng vừa đủ 10,0 ml methanol Dung dịch thử: Cân xác khoảng 1,0 g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ 100 ml, thêm 20 ml dung môi chiết mẫu, lắc nhẹ, chiết mẫu theo cách thích hợp Lọc dịch chiết giấy lọc (Bỏ 10 ml dịch lọc đầu) Lấy 25 ml dịch lọc cho vào bình cất quay, cất thu hồi dung mơi áp suất giảm đến 1-2 ml Tráng bình cất quay lần, lần với khoảng ml nước cất, chuyển dịch vào bình gạn Tráng tiếp bình cất với 10 ml n-butanol bão hòa nước (5 ml ×2 lần), tập trung vào bình gạn Lắc phút Tách lấy phần nbutanol vào bình cầu Chiết n-butanol lần nữa, 10 ml ml Tập trung dịch chiết n-butanol vào bình cầu Cất thu hồi dung mơi áp suất giảm tới cắn, hòa tan cắn 10 ml x ml x ml EtOH 70% chuyển vào bình định mức 25 ml thêm EtOH 70% vừa đủ 25 ml Hút xác ml dung dịch cho vào bình định mức 50 ml thêm EtOH 70% vừa đủ đến vạch Lấy 207(14): 187 - 194 xác 2,0 ml dung dịch thử tiến hành phản ứng màu Rosenthaler Dung dịch placebo: lấy xác 2,0 ml dung mơi mẫu placebo cho vào ống nghiệm, cô cách thủy đến cắn tiếp tục tiến hành tương tự cách chuẩn bị dung dịch thử Thuốc thử vanilin /acid acetic băng 5%: Cân 0,5 g vanilin pha acid acetic băng vừa đủ 10 ml 3.2 Xây dựng phương pháp Khảo sát điều kiện đo quang Quét hấp thụ khoảng 420-700 nm dung dịch chuẩn tiến hành phản ứng tạo màu rosenthaler với mẫu trắng MeOH (được làm phản ứng màu tương tự mẫu thử) Phổ hấp thụ gypenoside XVII đạt cực đại bước sóng 555 nm Do chúng tơi lựa chọn bước sóng 555 nm bước sóng khảo sát 3.3 Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu Phương pháp chiết Tiến hành chiết hai phương pháp Soxhlet (thời gian chiết 4giờ) siêu âm (thời gian chiết giờ), cố định thơng số lại (dung mơi chiết: ethanol 70%, nhiệt độ chiết: 80°C, tỉ lệ dược liệu: dung môi = 1: 20) Kết khảo sát trình bày Bảng Bảng Ảnh hưởng phương pháp chiết đến mật độ quang Pp chiết Mẫu 0,400 A/m Trung bình Chiết soxhlet Mẫu Mẫu 0,364 0,362 0,375 ± 0,002 Mẫu 0,369 Chiết siêu âm Mẫu Mẫu 0,400 0,365 0,378 ± 0,0019 Nhận xét: kết cho thấy tỉ số A/m hai phương pháp xấp xỉ Phương pháp siêu âm có ưu điểm: thời gian chiết ngắn hơn, phương pháp đơn giản Do lựa chọn phương pháp siêu âm để chiết xuất Dung môi chiết Tiến hành chiết dung môi khác nhau: methanol (MeOH), ethanol (EtOH) 70%, ethanol 90%, cố định thơng số lại (chiết phương pháp siêu âm, thời gian chiết giờ, nhiệt độ chiết 80°C, tỉ lệ dược liệu: dung môi = 1: 20) Kết bảng Bảng Ảnh hưởng dung môi chiết đến mật độ quang Dung môi A/m Trung bình Mẫu 0,361 MeOH Mẫu Mẫu 0,364 0,356 0,360 ± 0,004 Mẫu 0,359 EtOH 70% Mẫu Mẫu 0,360 0,357 0,358 ± 0,0017 Mẫu 0,310 EtOH 90% Mẫu Mẫu 0,316 0,317 0,314 ± 0,0054 Nhận xét bảng 2: Căn vào bảng cho thấy tỷ số A/m tương đương chiết dung môi MeOH (0,360), EtOH 70% (0,358)còn chiết EtOH 90% thấp (0,314) MeOH dung môi độc giá thành cao EtOH, EtOH 70% lựa chọn làm dung mơi chiết http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 189 Bùi Thị Luyến Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN 207(14): 187 - 194 Bảng Ảnh hưởng thời gian chiết đến mật độ quang Thời gian A/m Trung bình 30 phút Mẫu Mẫu Mẫu 0,261 0,254 0,256 0,257 ± 0,004 45 phút Mẫu Mẫu Mẫu 0,339 0,340 0,337 0,339 ± 0,0015 60 phút Mẫu Mẫu Mẫu 0,340 0,336 0,343 0,340 ± 0,0035 75 phút Mẫu Mẫu Mẫu 0,338 0,338 0,339 0,339 ± 0,0007 Bảng Ảnh hưởng tỉ lệ dược liệu : dung môi chiết đến mật độ quang Dược liệu: Dung môi 1:20 1:30 1:40 1:50 1:60 Mẫu 0,366 0,372 0,390 0,444 0,410 Thời gian chiết Tiến hành chiết mẫu phương pháp siêu âm với dung môi EtOH 70%, thời gian chiết thay đổi: 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút Cố định thơng số lại (phương pháp chiết siêu âm, dung môi chiết EtOH 70%, nhiệt độ chiết 80°C, tỉ lệ dược liệu: dung môi = 1: 20) Kết mô tả Bảng Nhận xét bảng 3: kết cho tỷ số A/m cho thấy thời gian chiết 45 phút cho hiệu suất tương đương với 60 phút 75 phút (0,339; 0,340; 0,339) Thời gian chiết 30 phút cho tỷ số A/m thấp (0,257) Do vậy, lựa chọn thời gian chiết xuất 45 phút Khảo sát tỷ lệ dược liệu: dung môi Tiến hành chiết mẫu dung môi EtOH 70% với tỷ lệ 1:20, 1: 30, 1: 40, 1:50; 1:60 Cố định thơng số lại (phương pháp chiết siêu âm, dung môi chiết EtOH 70%, nhiệt độ chiết 80°C, thời gian chiết 45 phút) Kết trình bày bảng Nhận xét bảng 4: kết cho thấy mật độ quang đo tỷ lệ dược liệu:dung môi 1:50 cao (0,449), mật độ quang đo tỷ lệ dược liệu:dung môi 1:20 thấp (0,363) Vì lựa chọn tỷ lệ dung môi: dược liệu 1:50 Tinh chế saponin n-butanol dung mơi có khả hòa tan chọn lọc saponin, dùng dung mơi để tinh chế saponin Từ kết khảo sát thu trên, điều kiện phân tích saponin tồn phần Giảo cổ lam lựa chọn sau: 190 Mẫu 0,362 0,368 0,395 0,450 0,416 A/m Mẫu 0,362 0,368 0,387 0,453 0,418 Trung bình 0,363 ± 0,002 0,369 ± 0,002 0,391 ± 0,004 0,449 ± 0,003 0,415 ± 0,003 Quy trình chiết mẫu tinh chế saponin tồn phần Cân xác khoảng 1,00 g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ 100 ml, thêm 20 ml dung mơi EtOH 70%, lắc nhẹ, siêu âm 20 phút nhiệt độ 80°C Gạn dịch lọc Chiết lần với 20 ml dung môi 10 phút Chiết tiếp lần với 10 ml dung mơi 10 phút Gộp tồn dịch chiết, lọc lấy dịch lọc (Bỏ 10ml dịch lọc đầu) Lấy 25 ml dịch lọc cho vào bình cất quay, cất thu hồi dung môi áp suất giảm đến 1-2 ml Tráng bình cất quay lần, lần với khoảng ml nước cất, chuyển dịch vào bình gạn Tráng tiếp bình cất với 10 ml n-butanol bão hòa nước (5 ml ×2 lần), tập trung vào bình gạn Lắc phút Tách lấy phần n-butanol vào bình cầu Chiết n-butanol lần nữa, 10 ml ml Tập trung dịch chiết n-butanol vào bình cầu Cất thu hồi dung mơi áp suất giảm tới cắn, hòa tan cắn 10 ml x ml x ml EtOH 70% chuyển vào bình định mức 25 ml thêm EtOH 70% vừa đủ 25 ml Hút xác ml dung dịch cho vào bình định mức 50 ml thêm EtOH 70% vừa đủ đến vạch Phản ứng màu đo quang: lấy xác 2,0 ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cô cách thủy đến cắn Thêm 0,6 ml dung dịch vanillin 5% acid acetic băng 2,0 ml acid perchloric 72% Đậy kín ống nghiệm, ủ nồi cách thủy 80°C 30 phút Ngâm ống nghiệm nước đá, sau chuyển vào bình định mức 10 ml, tráng ống nghiệm ethyl acetat, tập trung vào bình http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Bùi Thị Luyến Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN định mức bổ sung ethyl acetat vừa đủ đến vạch Lắc Đo độ hấp thụ bước sóng 555 nm; mẫu trắng EtOH 70% làm song song điều kiện Tính kết quả: Hàm lượng saponin tồn phần mẫu thử (%) tính theo gypenoside XVII tính theo công thức (*) 3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 207(14): 187 - 194 Tính chọn lọc Tính chọn lọc đánh giá qua phân tích mẫu placebo (dung môi chiết) mẫu chuẩn (nồng độ gypenosideXVII 0,1 mg/ml) Tiến hành phản ứng đo độ hấp thụ dung dịch mẫu chuẩn mẫu placebo với mẫu trắng EtOH 70% làm phản ứng tương tự Kết trình bày bảng Bảng Kết đánh giá ảnh hưởng dung môi chiết Mẫu chuẩn Mẫu placebo Ảnh hưởng mẫu placebo 0,682 0,003 0,76% Độ hấp thụ 0,679 0,005 Trung bình 0,682 0,0037 0,685 0,003 Tại bước sóng định lượng (555 nm), mẫu placebo có đáp ứng, nhiên độ hấp thụ mẫu placebo không đáng kể (0,0037< 1,0 %) so với đáp ứng độ hấp thụ mẫu chuẩn Do đó, kết luận phương pháp có độ chọn lọc đạt yêu cầu Độ tuyến tính Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch chuẩn gốc gypenoside XVII nồng độ khác (50150μg/ml) Kết khảo sát tương quan độ hấp thụ nồng độ gypenoside XVII trình bày bảng hình Bảng Kết khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng Nồng độ chất chuẩn (µg/ml) Mật độ quang (abs) Phương trình hồi quy tuyến tính Hệ số tương quan 50 75 0,257 0,364 Y= 0,0049x + 0,004 R2 = 0,9967 100 0,676 125 0,625 150 0,736 Hình Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính nồng độ saponin gypenoside XVII độ hấp thụ Nhận xét: Với hệ số tương quan R2 = 0,9967, có tương quan tuyến tính nồng độ gypenoside XVII độ hấp thụ Độ lặp lại Tiến hành định lượng mẫu thử, làm lần độc lập song song điều kiện thí nghiệm Hàm lượng saponin toàn phần theo gypenoside XVII mẫu thử tính theo dược liệu khơ trình bày bảng http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 191 Bùi Thị Luyến Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN 207(14): 187 - 194 Bảng Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp STT Lượng cân Độ hấp thụ Độ ẩm 1,0026 0,695 6,55% 1,0285 0,503 1,0047 0,691 1,0109 0,688 1,0300 0,500 1,0008 0,684 Hàm lượng trung bình (%) RSD (%) = 1,47% Chuẩn gypenoside XVII: nồng độ 100µg/ml Độ hấp thụ: 0,680 Nồng độ saponin tìm lại theo đường chuẩn (µg/ml) 100,20 101,84 99,39 98,78 101,22 97,96 99,898 Nhận xét: độ lặp lại phương pháp với RSD = 1,47% đạt yêu cầu AOAC Bảng Kết khảo sát độ phương pháp STT Lượng mẫu thử 0,5023 0,5053 0,5175 0,5090 0,5075 0,5055 0,5201 0,5035 0,5001 Lượng chuẩn thêm 80 80 80 100 100 100 120 120 120 Độ hấp thụ 0,893 0,895 0,889 0,980 1,008 0,986 1,086 1,099 1,084 Lượng chuẩn thu hổi 80,61 81,02 79,80 98,37 100,61 99,59 119,18 122,65 119,59 Độ thu hồi 100,76 101,28 99,75 98,37 100,61 99,59 99,32 102,21 99,66 Kết TB= 100,60 RSD= 0,77% TB= 99,52 RSD= 1,13% TB= 100,39 RSD= 1,57% Bảng 10 Kết xác định hàm lượng saponin toàn phần giảo cổ lam (GCL) giảo cổ lam STT STT Lượng mẫu thử trung bình (g) 1,0023 1,1053 1,0175 1,0090 1,0075 1,0020 1,0003 Độ ẩm (%) Lượng mẫu thử trung bình (g) 1,0043 1,1103 1,0075 1,1050 1,0275 1,1000 1,0275 Độ ẩm (%) 6,2 6,8 6,8 6,5 6,3 6,2 6,7 6,8 6,8 6,8 6,8 6,6 6,8 6,6 GCL Độ hấp thụ Nồng độ trung bình saponin tồn (abs) phần (µg/ml) 0.436 88,16 0,532 100,76 0,436 88,16 0,445 90,00 0,462 93,50 0,422 85,32 0,418 84,50 GCL Độ hấp thụ Nồng độ trung bình saponin tồn (abs) phần (µg/ml) 0,504 0,598 0,608 0,531 0,500 0,537 0,615 102,04 121,22 123,27 107,55 101,22 108,78 124,69 Hàm lượng saponin toàn phần (%) 4,7 4,9 4,6 4,7 4,95 4,5 4,5 Hàm lượng saponin tồn phần trung bình 4,69 ± 0,16 % Hàm lượng saponin toàn phần (%) Hàm lượng saponin toàn phần trung bình 5,76 ± 0,58 % 5,5 5,9 6,6 5,2 5,3 5,3 6,5 Độ Độ xác định phương pháp thêm lượng xác saponin gypenoside XVII chuẩn vào mẫu thử xác định hàm lượng cho tổng nồng độ nằm khoảng tuyến tính 192 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Bùi Thị Luyến Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN khảo sát Tiến hành chiết định lượng quy trình phân tích đưa ra, từ kết thu xác định độ thu hồi phương pháp Thực lượng thêm vào tương ứng 80%, 100%, 120% so với nồng độ phân tích dung dịch thử Kết thu bảng Nhận xét: Kết thu với độ thu hồi saponin toàn phần (tính theo gypenoside XVII) từ 98,37 đến 102,21%, số đa số nằm đạt yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích mẫu theo AOAC (nằm khoảng 97-103% với hàm lượng 1-10%)[7] Từ kết thẩm định thu cho thấy phương pháp phân tích có tính đặc hiệu cao, độ lặp lại độ thu hồi đạt yêu cầu tốt theo AOAC, áp dụng định lượng mẫu nghiên cứu 3.5 Định lượng saponin toàn phần giảo cổ lam (GCL) giảo cổ lam Tiến hành phân tích mẫu giảo cổ lam Xử lý mẫu tiến hành đo quang mẫu thử làm lần riêng biệt Tính hàm lượng saponin tồn phần mẫu theo cơng thức (*) Kết trình bày bảng 10 Nhận xét bảng 10: hàm lượng saponin tồn phần trung bình giảo cổ lam 4,69 ± 0,16% thấp giảo cổ lam lá: 5,76 ± 0,58 % Bàn luận 4.1 Về phương pháp chiết xuất tinh chế mẫu Kết nghiên cứu lựa chọn thông số tối ưu để sử lý mẫu: phương pháp chiết siêu âm, dung môi chiết ethanol 70%, tỉ lệ dung môi: dược liệu = 1: 50 Đây phương pháp chiết đơn giản, dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, không độc hại dễ thực điều kiện phòng thí nghiệm, Phương pháp tinh chế: Có hai phương pháp tinh chế saponin chiết lỏng - lỏng nbutanol chiết pha rắn với cột nhồi Diaion HP – 20, nhiên chiết pha rắn yêu cầu kỹ thuật phức tạp, cột chiết đắt tiền, người phân tích cần có kinh nghiệm [9], [10] nên nghiên cứu phương pháp chiết lỏng – lỏng với dung mơi n-butanol có khả hòa tan chọn lọc saponin phù hợp có tính kinh tế cao Sự lựa chọn dung môi tinh chế nghiên cứu phù hợp theo Chuyên luận giảo cổ lam Dược điển Việt Nam V [8] http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 207(14): 187 - 194 4.2 Khảo sát điều kiện đo quang Nhóm chất Giảo cổ lam saponin với khoảng 100 saponin khác có tên gọi chung gypenoside Theo kinh nghiêm sử dụng dân gian dùng dạng nước hãm toàn cây, lựa chọn đối tượng định lượng nhóm chất saponin tồn phần hợp lý Các nghiên cứu trước sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, sắc ký lỏng kết nối với khối phổ xác định gần 34 gypenoside Rb1, Rb3, malonyl Rb1, malonyl Rd, Rf, gylongiposid, gypenoside XVII, XLIX [5]… Căn vào thành phần gypenoside Giảo cổ lam tính sẵn có chất chuẩn, nghiên cứu lựa chọn gypenoside XVII làm chất đối chiếu để định lượng saponin toàn phần phù hợp Nguyên tắc phương pháp đo quang đòi hỏi dung dịch đo độ hấp thụ phải có màu Các saponin có đặc điểm thường khơng màu hấp thụ ánh sáng, cần phải dung dịch có màu để thực phép phân tích Nghiên cứu tiến hành tạo màu phản ứng Rosenthaler saponin toàn phần dịch chiết dược liệu với thuốc thử vanillin/acid acetic băng acid percloric [5] Dựa tài liệu tham khảo tiến hành thực nghiệm: khảo sát điều kiện đo quang: xác định bước sóng cực đại 555 nm, xây dựng hệ thống điều kiện thời gian, nhiệt độ nồng độ thuốc thử tiến hành phản ứng tạo màu [ ] 4.3 Thẩm định phương pháp định lượng Sau xây dựng quy trình phân tích, điều kiện làm phản ứng đo quang Kết thẩm định phương pháp định lượng có tính đặc hiệu cao, độ lặp lại độ thu hồi tương đối tốt đa số số nằm khoảng yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích mẫu AOAC Việc đánh giá cho thấy phương pháp xây dựng phù hợp, ứng dụng để định lượng saponin toàn phần giảo cổ lam 4.4 Kết định lượng mẫu giảo cổ lam Kết định lượng saponin toàn phần giảo cổ lam thu hái Thái Nguyên có khác nhau, giảo cổ lam saponin toàn phần đạt 5,76% cao so với loại (4,69%) So với kết nghiên 193 Bùi Thị Luyến Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN cứu nhóm tác giả Phạm Thanh Kỳ hàm lượng saponin toàn phần giảo cổ lam trồng Hòa bình Tam đảo Vĩnh Phúc giảo cổ lam thu hái Thái Nguyên có hàm lượng saponin tồn phần cao loại trồng Tam Đảo (4,12%) So với loại trồng Hòa Bình (5,1%) loại trồng Thái Nguyên có hàm lượng saponin tồn phần thấp hơn, loại có hàm lượng cao [10] Hiện theo kinh nghiệm dân gian thường sử dụng giảo cổ lam Tuy nhiên với kết nghiên cứu giảo cổ lam thu hái Thái Nguyên loại có hàm lượng saponin thấp so với loại lá; bên cạnh nhóm chất saponin giảo cổ lam thành phần có lien quan đến tác dụng dược liệu Vì cần có nghiên cứu so sánh tác dụng sinh học hai loại giảo cổ lam Kết luận Chúng triển khai thực nghiệm thu kết sau: - Đã khảo sát phương pháp chiết xuất tinh chế để thu saponin toàn phần giảo cổ lam - Đã xây dựng thẩm định phương pháp định lượng saponin toàn phần phương pháp quang phổ dùng saponin gypenoside XVII chất đối chiếu Phương pháp định lượng saponin toàn phần thẩm định đáp ứng yêu cầu AOAC mẫu thử dược liệu Kết qảu thu cho thấy tiêu chí thẩm định tính chọn lọc ảnh hưởng mẫu placebo khơng đáng kể, khoảng tuyến tính gypenoside 50-150 μg/ml cho thấy mối tương quan chặt chẽ nồng độ hoạt chất độ hấp thụ với r=0,9967 , độ lặp lại cao với RSD= 1,47% đạt yêu cầu AOAC (≤2,7%), độ thu hồi từ 98,37 đến 102,21%, đa số nằm khoảng yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích mẫu AOAC [7] - Đã ứng dụng phương pháp phân tích để định lượng saponin tồn phần Giảo cổ lam thu hái Thái nguyên Hàm lượng saponin toàn phần GCL đạt 4,69% thấp so với GCL (5,76%) Đề xuất Nghiên cứu thực mẫu thu hái Thái Ngun Vì chúng tơi xin đưa đề xuất sau: 194 207(14): 187 - 194 - Cần thu nhập thêm mẫu GCL loài từ vùng khác nước mùa khác từ khẳng định thêm kết so sánh hàm lượng saponin toàn phần GCL Ngoài ra, đánh giá vùng cho điều kiện tốt để phục vụ nhu cầu canh tác - Tiến hành thử tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan nhằm so sánh tác dụng GCl để khẳng định xem loại GCL tốt hơn, phục vụ cho nhu cầu sử dụng dược liệu sản phẩm chế biến từ dược liệu không ngừng tăng lên TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Hoằng Bộ, Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, 1, tr.563-575, 1999 [2] Phạm Thanh Kỳ đồng sự, “Nghiên cứu tác dụng tăng đáp ứng miễn dịch dược liệu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thumb.)”, Tạp chí thơng tin Y dược số 5, tr.35-38, 2007 [3] Phạm Thanh Hương, Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum (Thumb.)makido Cucurbitaceae, Luận văn Thạc sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, 2003 [4] Zhuohong Xie, Margaret Slavin, Huiping Zhou, et al, (2010), “Chemical composition of five commercial Gynostemma pentaphyllum samples and their radical scavenging, antiproliferative, and anti – inflammatory properties”, J Agric Food chemistry, 58, pp 11243-11249 [5] Ngô Văn Thu, Trần Hùng, Dược liệu học tập I, Nxb Y học, 2011 [6] Ngơ Văn Thu, Hóa học saponin, khoa DượcTrường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, trang 109-114, 1990 [7] AOAC International, Validation and Qualification in Analytical Laboratories, Second Edition, 2007 [8] Bộ Y tế, Dược điển Việt Nam V, chuyên luận Giảo cổ lam, 2018 [9] Kao, T H., et al , “Determination of flavonoids and saponins in gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino by liquid chromatoghraphy – mass spectrometry”, Analytica Chimica Acta, 626, (2), pp 237-241, 2008 [10] Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Trịnh Thị Diệp Thanh, “Định lượng saponin toàn phần giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino trồng vùng phương pháp đo quang”, Tạp chí Dược học, số 2, tr 54, 2014 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn ... cho thấy phương pháp xây dựng phù hợp, ứng dụng để định lượng saponin toàn phần giảo cổ lam 4.4 Kết định lượng mẫu giảo cổ lam Kết định lượng saponin toàn phần giảo cổ lam thu hái Thái Nguyên có... lượng saponin toàn phần dược liệu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) thu hái Thái Nguyên phương pháp đo quang Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị Nguyên liệu. .. 0 ,53 1 0 ,50 0 0 ,53 7 0,6 15 102,04 121,22 123, 27 1 07 ,55 101,22 108 ,78 124,69 Hàm lượng saponin toàn phần (%) 4 ,7 4,9 4,6 4 ,7 4, 95 4 ,5 4 ,5 Hàm lượng saponin toàn phần trung bình 4,69 ± 0,16 % Hàm lượng