Định lương Aavonoid toàn phẩn hạt cần tây phương pháp đo quang Nguyễn Thu Hằng\ Nguyễn Ngọc Cấu\ Hoàng Phương Thảo\ Phạm Thùy Linh^ ^Trường Đại học Dược Hà Nội ^Trường Đại học YDược Thái Nguyên SUMMARY A spectrophotometric method was developed for the determination o f the totol flavonoid content o f celery seeds It wos based on complex formation between polyphenol and triethylơmine as photometric reaction Apigenin was used as calibration standard For photometric measurement, a wavelength o f 380.5 nm was recommended The method was validated showing good linearity (A = 0.0338x C -ị- 0.0033, R^= 0.9998), repeatibility (RSD = 4.7%) and accuracy (9.8-101,9%) The total flavonoid content was found to be 0.65% in dried materials These results could be used for the standardization o f celery seeds in the future Từkhóa:Apium graveolens L , cân tây, đo quang, định lượng, fiovonoid toàn phần, hạt Đặt vấn để Cây cần tây có tên khoa học Apium grơveolens L, loại rau án phổ biến giới di thực vể trổng Việt Nam [4], [6 ] Bên cạnh việc sử dụng phận mặt đất làm rau ăn, hạt cần tây biết đến dược thảo số quốc gia để chữa bệnh khớp, bệnh gút an thần, lợi tiểu [9] hạ huyết áp chống viêm [8 ] Gần đây, số tác dụng sinh học hạt cẩn tây chứng minh thực nghiệm khoa họQ đáng ý tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase enzym chìa khóa bệnh gút [2 ] tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu [3] tác dụng có liên quan đến thành phần flavonoid dược liệu [7], [11] Do đó, flavonoid nhóm hoạt chất quan trọng hạt cẩn tây việc xác định hàm lượng flavonoid dược liệu cẩn thiết Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng phương pháp định lượng fiavonoid toàn phần hạt cẩn tây tiến hành định lượng flavonoid hạt cần tây để nâng cao hiệu quản lý chất lượng bước tiêu chuẩn hóa dược liệu Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên vật liệu Mẫu cần tây có hoa thu hái xã Hải Nam, huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định vào tháng năm 2012, ép tiêu bản, lưu trữ Phòng Tiêu bản, Bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu tiêu HNIP/17860/13 xác định tên khoa học Apium graveolens L, họ Cẩn (Apiaceae) Hạt cần tây thu hái vào tháng 1 năm 2012 Hạt phơi khô bóng râm, sau bảo quản túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát Hóa chất + Chất chuẩn apigenin (98,03%) cung cấp Shanghai Tauto Biotech + Các hóa chất: Methanol, triethylamia ether dầu hỏa đạt tiêu chuẩn phân tích Thiết bị + Cân phân tích MettlerToledo AB204-S9 (Thụy Sĩ) độ xác 0,01 mg + Cân phân tích Precisa (Thụy Sì) độ xác 0,1 mg + Máy đo độ ẩm Precisa XM 60 + Bộ dụng cụ chiết Soxhlet + Máy đo quang Hitachi U-1900 (Nhật Bản) Phương pháp nghiên cứu Flavonoid toàn phẩn hạt cẩn tây định lượng phương pháp đo quang - Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan apigenin chuẩn methanol để thu dung dịch có nồng độ khoảng 15,3 ng/ml - Dung dịch thử: Càn xác khoảng gam bột dược liệu cho vào túi giấy lọc chuẩn bị sẵn, tiến hành chiết soxhlet với 10 ml ether dầu hỏa đến hết chất béo (thử quan sát vết giấy lọc) Lấy túi bã dược liệu ra, để bay hết dung môi, chiết tiếp soxhlet với 80 ml methanol đến kiệt flavonoid (kiểm tra cách lấy dịch chiết bình soxhlet cho vào ống nghiệm, thêm bột Mg vài giọt HCI đặc không thấy xuất màu hổng đỏ) Lấy dịch chiết methanol cho vào bình định mức 10 ml, bổ sung methanol vừa đủ tới vạch (dung dịch T^) Lấy xác ml dung dịch cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung methanol đến vạch, lắc (dung dịch T^) - Phản ứng tạo màu: Nhóm -OH phenol phân tử hợp chất flavonoid phản ứng với kiềm tạo thành phenolat làm tăng màu dung dịch môi trường kiểm Nghiên cứu chọn phản ứng với dung dịch trlethylamin % methanol với thông số tham khảo theo tài liệu [ ] làm phản ứng tạo màu để định lượng flavonoid toàn phần hạt cắn tây phương pháp đo quang - Thẩm định phương pháp + Xác định khoảng nồng độ tuyến tính: Khảo sát dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên Xác định phụ thuộc tuyến tính nồng độ độ hấp thụ phương trình hổi quy tuyến tính + Độ phương pháp: Sử dụng phương pháp thêm chuẩn, sau tính toán độ thu hổi + Độ lặp lại phương pháp: Phân tích mẫu lần song song Xác định kết định lượng theo phương trình đường chuẩn Sau xác định độ lặp iại cách tính độ lệch chuẩn tương đối lần định lượng + Tính toán kết quả: Từ độ hấp thụ mẫu thử, tính nồng độ flavonoid toàn phẩn dung dịch thử (C) tương ứng theo phương trình hổi quy tuyến tính Hàm lượng flavonoid toàn phẩn hạt cắn tây tính theo công thức: • k: Hệ số pha loãng dung dịch đo quang so với dung dịchT^ • H: Độ ẩm mẫu thử hạt cần tây (%) • m: Khối lượng hạt cắn tây cân để chuẩn bị dung dịch thử(g) Kết nghiên cứu Khảo sát cực đại hấp thụ Lấy xác ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10 ml, thêm ml triethylamin ^%, bổ sung methanol vừa đủ 10 ml Tiến hành quét phổ từ bước sóng 190 - 500 nm với mẫu trắng dung dịch trỉethylamin 0,5% methanol (v/v) Kết quét phổ trình bày hình cho thấy dung dịch có cực đại hấp thụ 380,5 nm; 275,0 nm 231,5 nm Chọn bước sóng 380,5 nm làm bước sóng đo quang Thẩm định phương pháp - Xác định khoảng tuyến tính Lấy xác ,2, 3,4, ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 ml thực phản ứng tạo màu Đo độ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn bước sóng 380,5 nm với mẫu trắng dung dịch trỉethylamin 0,5% methanol (v/v) Đổ thị biểu diễn tương quan tuyến tính nồng độ dãy dung dịch chuẩn độ hấp thụ trình bày hình Kết cho thấy khoảng nồng độ khảo sát bước sóng 380,5 nm, độ hấp thụ nồng độ apigenin có tương quan tuyến tính chặt chẽ với hệ so xác định R2 = 0,998 Cxk Phương trình hổi quy tuyến tính: % Flavonoid toàn phẩn = — 7 ^^^^ mxio x ( l - / / ) A = 0,0338xC + 0,0033 Trong đó: Trong đó: • C: Nồng độ flavonoid toàn phần dung dịch thử • A: Độ hấp thụ dung dịch • C: Nồng độ dung dịch (|jg/ml) tính phương trình hổi quy (Mg/nnl) 0 ABS Ũ 000 C 1 -— r"""”' Hình Hình ỏnìi phổ opigenin chuấn có tợo phức với tríethỵlơmin 0.300 0250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 Hình Đổ thị biếu diễn phụ thuộc củơ độ hâp thụ vào nống độ opìgenin Khảo sát độ phương pháp Độ phương pháp xác định phương pháp thêm chuẩn Do trình chuẩn bị dung dịch thử, Aavonoid chiết kiệt nên yếu tổ có ảnh hưởng chủ yếu đến độ phản ứng tạo màu Vì vậy, chất chuẩn cho vào trước làm phản ứng tạo màu với triethylamỉn Chuẩn bị bình định mức 10 ml, đánh sổ từ đến + Bình : Cho xác ml dung dịch thửT^ + Bình - : Cho xác ml dung dịch thửT^ 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 ml dung dịch chuẩn Thực phản ứng tạo màu đo độ hấp thụ bước sóng 380,5 nm với mẫu trắng dung dịch trỉethylamin 0,5% methanol (v/v) Tính tỷ lệ tìm lại theo công thức: ^chuẩn tìm lại ^mẫu thử thêm chuẩn ^m ẳuthử Tỷ lệ phần trăm chuẩn tìm lại (%) = - mức 10 ml, thêm xác ml trỉethylamin 1%, bổ sung methanol vừa đủ 10 ml, lắc đểu Đo độ hấp thụ mẫu thử bước sóng 380,5 nm với mẫu trắng dung dịch triethylamin 0,5% methanol (v/v).Từ độ hấp thụ dung dịch đo đưỢQ tính nồng độ c dung dịch phương trình hổi quỵ tuyến tính Hàm lượng flavonoid toàn phần hạt cẩn tây tính theo công thức (*) với hệ số pha loãng k = 62,5 Tiến hành định lượng flavonoid toàn phán hạt cẩn tây lẩn điểu kiện Kết định lượng flavonoid toàn phẩn hạt cán tây trình bày bảng Kết bảng cho thấy phương pháp có độ lặp lại chấp nhận với RSD = 4,70% Hàm lượng flavonoid toàn phẩn hạt cẩn tây 0,65% tính theo apigenin dược liệu khô tuyệt đối " chuẩn tìm lại ^ chuẩn thêm vào Bàn luận Flavonoid nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh với nhiểu tác dụng quan trọng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, kháng virus, Bỏng Kết M o sớt độ phương pháp chống ung thư, chống viêm, chống dị ứng, chống loét ^ chuẩn thêm vào ^diuẩn tìm lai [7] Gần đây, hợp chất flavonoid đặc TT %tìm lại (Ha/mi) (iio/mi) biệt quan tâm chúng ức chế hoạt tính nhiều 0,77 0,76 99,39 enzym cyclooxỵgenase, Ca^^-ATPase, xanthin 1,53 1,56 101,91 oxidase, acethyl Cholinesterase, phosphodiesterase, 2,30 2,27 98,88 lipooxygenase, aldose reductase tyrosin kinase enzym có liên quan đến chế bệnh sinh 3,06 3,04 99,30 nhiểu loại bệnh tật [7] Các nghiên cứu trước 3,83 3,78 98,77 cho thấy số tác dụng sinh học hạt cần tây có % tìm lại = 99,65 %,RSD = 1,29% Thống kê liên quan đến thành phần flavonoid dược liệu N h ậ n x é tĩù kết bảng cho thấy phương [7], [1 ] Do đó, hàm lượng flavonoid toàn phần pháp định lượng có độ cao với % chất chuẩn tìm hạt cán tây tiêu quan trọng việc đánh giá lại từ 98,77 -101,91 %; RSD = 1,29% chất lượng dược liệu Đo độ hấp thụ mẫu thử khảo sát độ lặp lợi Hàm lượng flavonoid toàn phẩn dược liệu phương pháp thường xác định phương pháp đo quang Lấy xác ml dung dịch T2 cho vào bình định phương pháp cân [5] Phương pháp cân thường Kết khảo sát độ phương pháp trình bày bảng Sổ /2014 1Nghiên cứu dượcThông tln thuỗc Ị1 Bỏng Kẽt quở định lượng ílovonoid toàn phân hạt cân tây Mẫu Khối lương Đô ẩm (%) Lẩnl ĐỘMbtiIHI(A) Lần Lần 0,162 0,163 0,163 0,173 0,174 0,170 0,156 0,154 0,165 0,166 I C(|ig/ml) Hàm lượng flavonoid toàn phần (%) 0,163 4,71 0,65 0,172 5,00 0,68 0,153 0,154 4,47 0,61 0,165 0,165 4,79 0,66 TB (g)' 5,0597 5,0788 5,0770 5,0612 5,0683 0,154 0,155 0,155 0,155 4,48 0,61 5,0734 0,171 0,169 0,170 0,170 4,93 0,67 9,95 Giá trị trung bình X Thống kê Độ lệch chuẩn s Độ lệch chuẩn tương đối RSD có sai số lớn so với phương pháp đo quang khó loại bỏ tuyệt đối tạp chất dịch chiết dược liệu phẩn flavonoid bị hư hao trình loại tạp Do đó, nghiên cứu flavonoid toàn phẩn hạt cán tây tiến hành định lượng phương pháp đo quang, thực phản ứng tạo màu với triethylamin, kết định lượng tính theo apigenin Dung môi dùng để đo phổ UV-VIS có bước sóng giới hạn (Â ^ khác mà bước sóng đó, dung môi hấp thụ đa phần xạ chiếu qua [1] Kết quét phổ apigenỉn tạo phức với triethylamin cho thấy dung dịch có cực đại hấp thụ 380,5 nm, 275,0 nm 231,5 nm Vì vậy, để giảm thiểu sai số ảnh hưởng dung môi, chất tham gia phản ứng dụng cụ đo, nghiên cứu chọn bước sóng 380,5 nm để tiến hành đo quang Kết thẩm định cho thấy phương pháp xây dựng có độ cao (99,65%) độ lặp lại chấp nhận 0,65 0,030 4,70% (RSD = 4,70%) Đây phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có độ tin cậy cao, tốn Kết sở bước đẩu để xây dựng tiêu định lượng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu hạt cần tây Kết luận Flavonoid toàn phẩn hạt cẩn tây định lượng phương pháp đo quang, sử dụng phản ứng tạo màu với triethylamin Kết định lượng tính toán theo apigenin Phương pháp định lượng có tương quan tuyến tính chặt chẽ độ hấp thụ nồng độ dung dịch chuẩn khoảng khảo sát với = 0,9998 Phương pháp có độ lặp lại RSD = 4,70% độ cao với tỷ lệ chất chuẩn thu hổi từ 98,77 -101,91% (RSD = 1,29%) Hàm lượng flavonoid toàn phẩn hạt cẩn tây 0,65% tính theo apigenin dược liệu khô tuyệt đối TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, Tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr 50 Nguyễn Thu Hằng, Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Thanh Tùng (2014), "Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro cần tây {Apịum graveolens D", Tạp chí Dược học, (6), tr 67-71 Nguyễn Thu Hằng, Nguyễn Thị Hồng Vân (2013), "Nghiên cứu ảnh hưởng in vitro dịch chiết hạt cần tây ngưng tập tiểu cẩu trình đông máu'; Nghiên cứu Dược Thông tin thuốc, (5), tr 25-28 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr 314-315 Ngô Văn Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu họQĨập I, NXB Y học, Hà Nội, tr 378-379 Viện Dược Liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật,Hà Nội, tr 566-568 Agrawal AD (2011), "Pharmacological activities of flavonoids: a review" International Journal of Pharmaceutical Sciences and Nanotechnology, (2), pp 1394-1398 Asif HM, Akram M, Usmanghani KH, Akhtar Naveed et al (2011), "Monograph of Apium graveolens Linn'; J Medicin Plan Res, 5, pp 1494-1496 Barnes Joanne, Anderson Linda A, Phillipson J David (2007), Herbal Medicines, Third edition, Pharmaceutical Press, London, UK, pp 145-148 10 Chinese Pharmacopoeia Commision (2010), "Pharmacopoeia of the People's Republic of China" People's Medical Publishing House, Volum I, pp 46 11 Lin Chun-Mao, Chen Chien-Shu, Chen Chien-Tsu, Liang Yu-Chih et al (2002),"Molecular modeling of flavonoids that inhibits xanthine oxidase" Biochemical and Biophysical Research Communications, 294 (1), pp 167-172 13 Nghiên cứu duợcThông tin thuöc Số 4/2014 ... lượng flavonoid toàn phẩn dược liệu phương pháp thường xác định phương pháp đo quang Lấy xác ml dung dịch T2 cho vào bình định phương pháp cân [5] Phương pháp cân thường Kết khảo sát độ phương pháp. .. màu để định lượng flavonoid toàn phần hạt cắn tây phương pháp đo quang - Thẩm định phương pháp + Xác định khoảng nồng độ tuyến tính: Khảo sát dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên Xác định phụ... dựng tiêu định lượng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu hạt cần tây Kết luận Flavonoid toàn phẩn hạt cẩn tây định lượng phương pháp đo quang, sử dụng phản ứng tạo màu với triethylamin Kết định lượng