Nghiên cứu quy trình phân lập bào tử đơn của nấm cordyceps militaris

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP BÀO TỬ ĐƠN CỦA NẤM CORDYCEPS MILITARIS LÊ THỊ TÚ ANH Đà Nẵng, năm 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP BÀO TỬ ĐƠN CỦA NẤM CORDYCEPS MILITARIS Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa: 2016-2020 Sinh viên: Lê Thị Tú Anh Người hướng dẫn: TS Trịnh Đăng Mậu Đà Nẵng, năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu chưa cơng bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Sinh viên thực Lê Thị Tú Anh i LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Trịnh Đăng Mậu- giảng viên hướng dẫn, người đóng góp ý kiến, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô giảng dạy khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng trang bị cho em tảng kiến thức vững để vận dụng kiến thức q trình thực đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình giúp đỡ động viên em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn ! Đà Nẵng, tháng năm 2020 Sinh viên thực Lê Thị Tú Anh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU NẤM CORDYCEPS MILITARIS 1.1.1 Đặc điểm sinh học, sinh thái, phân bố nấm Cordyceps militaris 1.1.2 Chu trình sống nấm Cordyceps militaris 1.1.3 Giá trị dược liệu nấm Cordyceps militaris 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT CORDYCEPS MILITARIS HIỆN NAY 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Việt Nam 1.3 GIỚI THIỆU VỀ BÀO TỬ 1.4 CƠ CHẾ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI DUNG DỊCH KHỬ TRÙNG TỚI KHẢ NĂNG XỬ LÝ HỆ SỢI VÀ BÀO TỬ NẤM CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 10 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.2.1 Phương pháp chuẩn bị dịch bào tử 10 2.2.2 Phương pháp xác định dịch khử trùng 10 2.2.3 Phương pháp xác định nồng độ dịch khử trùng thời gian khử trùng lên thời gian xử lý mẫu 11 iii 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi tới khả phát triển sợi nấm phát sinh từ bào tử đơn 11 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13 3.1 HÌNH THÁI BÀO TỬ 13 3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI DỊCH KHỬ TRÙNG LÊN KHẢ NĂNG KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HỆ SỢI VÀ BÀO TỬ 14 3.2.1 Ảnh hưởng loại dung dịch khử trùng lên khả phát triển hệ sợi 14 3.2.2 Ảnh hưởng loại dung dịch khử trùng lên khả nảy mầm bào tử 14 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ HCL VÀ THỜI GIAN XỬ LÝ TỚI KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HỆ SỢI VÀ BÀO TỬ NẤM 15 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG TỚI TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG CỦA SỢI NẤM PHÁT TRIỂN TỪ BÀO TỬ ĐƠN 17 3.5 QUY TRÌNH PHÂN LẬP BÀO TỬ NẤM CORDYCEPS MILITARIS 21 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23 KẾT LUẬN 23 KIẾN NGHỊ 23 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT CDA Czapek – Dox Agar CS Cộng PDA Potato Dextro Agar SDAY1 Abouraud’s dextrose agar with yeast extract TH Tổng hợp WA Water Agar v DANH MỤC BẢNG Số hiệu Bảng 2.1 Tên bảng Bảng thành phần dinh dưỡng môi trường PDA, CDA, SDAY1 TH (trong lít mơi trường) vi Trang 11 DANH MỤC HÌNH Số hiệu Hình 1.1 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Tên hình Nấm Cordyceps militaris ni phịng thí nghiệm cơng nghệ sinh học nấm- khoa Sinh-mơi trường Hình thái bào tử (A), sử nảy mầm bảo tử (B) Ảnh hưởng dung dịch khử trùng lên khả nảy mầm của hệ sợi Ảnh hưởng loại dung dịch khử trùng lên khả nảy mầm bào tử Ảnh hưởng nồng độ dung dịch khử trùng lên khả nảy mầm hệ sợi Ảnh hưởng nồng độ dung dịch khử trùng lên khả nảy mầm bào tử Diện tích khuẩn lạc quan sát từ ngày đến ngày 21 bốn mơi trường khác Diện tích hệ sợi bốn môi trường (a) PDA, (b) CDA, (c) TH, (d) SDAY1 ngày quan sát thứ 21 Tốc độ sinh trưởng khuẩn lạc bào tử nấm bốn môi trưởng khác 21 ngày khảo sát (tính từ ngày thứ quan sát) Trang 13 14 15 16 17 18 19 19 Sắc tố kết cấu hệ sợi nấm khuẩn lạc sau đưa ánh sáng Hình 3.9 14 ngày bốn loại môi trường (a) PDA, (b) CDA, (c) TH, 20 (d)SDAY1 Hình 3.10 Quy trình phân lập bào tử đơn từ thể Cordyceps militaris dung dịch HCl vii 21 TÓM TẮT Đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng quy trình phân lập bào tử đơn nấm Cordyceps militaris” thực nhằm mục tiêu tìm hóa chất thời gian khử trùng thích hợp cho tỉ lệ nảy mầm hệ sợi nấm Cordyceps militaris thấp tỉ lệ nảy mầm bào tử nấm Cordyceps militaris cao nhất, xác định môi trường dinh dưỡng phù hợp cho tốc độ sinh trưởng sợi nấm gốc phát triển từ bào tử Đề tài bố bao gồm thí nghiệm sau: Thí nghiệm chuẩn bị dịch bào tử Thí nghiệm đưa tổng quan quy trình chuẩn bị dịch bào tử Thí nghiệm ảnh hưởng dịch khử trùng Hai loại dịch khử trùng xử dụng HCl Javel, nước cất làm mẫu đối chứng Thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ dịch khử trùng thời gian khử trùng lên tỉ lệ nảy mầm hệ sợi bào tử Sau tìm dịch khử trùng thích hợp, tiến hành chia dịch khử trùng thành nhiều nồng độ thời gian khử trùng khác 5, 10, 15, 20 phút Thí nghiệm ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng lên tốc độ sinh trưởng sợi nấm cấy chuyển từ bào tử qua đĩa Petri Bốn nghiệm thức bố trí gồm bốn môi trường dinh dưỡng khác gồm: PDA (Potato dextrose agar), CDA (Czapek-dox agar), TH (tổng hợp), SDAY1(Sabouraud dextrose agar plus yeast extract) Kết cho thấy, ta chủ động thu bào tử không lẫn hệ sợi nồng độ HCl 0,3N với thời thời gian xử lý 15 phút (3,328 ± 1,23%) Môi trường PDA đánh giá thích hợp cho phát triển khuẩn lạc (đường kính hệ sợi đạt 67,52 ± 11,48mm vào ngày quan sát thứ 21) Kết cấu sắc tố hệ sợi Cordyceps militaris biểu tốt hai môi trường giàu dinh dưỡng SDAY1 PDA Việc tạo quy trình phân lập bào tử tạo điều kiện cho q trình tuyển chọn giống nấm có suất chất lượng viii CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 HÌNH THÁI BÀO TỬ Bào tử nấm C militaris có dạng hình oval với đường kính 3,122 ± 0,45µm (Hình 1A) Các bào tử bắt đầu nảy mầm sau 24 môi trường WA, agar thêm vào môi trường để giữ cá thể bào tử vị trí cố định Thời gian bào tử đính mơi trường thạch tồn lâu bào tử tự nước (Stringer cs, 2005) Kết tương tự kết nghiên cứu Nguyễn Thị Thanh Lan & cs quan sát hình thái bào tử nấm từ chủng B6 phân lập từ mẫu nấm Cordyceps.spp tự nhiên thu Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An (Nguyễn Thị Thanh Lan cs, 2016) Hình ảnh bào tử nảy mầm mô tả hình 1B Sợi nấm hình thành đơn hướng bào tử phát triển chiều dài sau khoảng 36 nuôi cấy Kết quan sát tương tự với kết Bhushan cs quan sát đặc điểm hình thái bào tử qua giai đoạn trưởng thành nấm Cordyceps militaris Bhushan đưa hình ảnh nhận xét cho thấy sợi nấm hình thành từ bào tử dài từ 2-8um xuất khoảng thời gian từ 36 đến 48 giờ, bào tử nảy mầm nảy mầm nhiều hệ sợi phát triển (Bhushan cs, 2005) Hình 3.1: Hình thái bào tử (A), sử nảy mầm bảo tử (B) 13 3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI DỊCH KHỬ TRÙNG LÊN KHẢ NĂNG KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HỆ SỢI VÀ BÀO TỬ 3.2.1 Ảnh hưởng loại dung dịch khử trùng lên khả phát triển hệ sợi Kết nghiên cứu cho thấy, loại dung dịch khử trùng có ảnh hưởng khác đến khả nảy mầm bào tử phát triển hệ sợi nấm Hệ sợi nấm bị bất hoạt hoàn toàn dung dịch Javel ( tỷ lệ nảy mầm 0%) 99,77 % dung dịch HCl 0,1N (tỷ lệ nảy mầm đạt 0,23 ± 0,1%) Trong đó, mơi trường nước cất, tỷ lệ phát triển hệ sợi ghi nhận lên đến 2,01 ± 0,96% Hình 3.2 Ảnh hưởng dung dịch khử trùng lên khả phát triển hệ sợi 3.2.2 Ảnh hưởng loại dung dịch khử trùng lên khả nảy mầm bào tử Đối với bào tử nấm, tỷ lệ nảy mầm cao 18,54 ± 10,68% môi trường đối chứng sử dụng nước cất (Hình 3.2) Khi tăng nồng độ HCl tỉ lệ nảy mầm bào tử giảm Ở nồng độ HCl 0.3N, khả nảy mầm bào tử đạt 0,64 ± 0,34% ức chế phát triển hệ sợi Bào tử bị bất hoạt hoàn toàn nồng độ dung dịch Javen Kết tương tự với nghiên cứu sử dụng Javen xử lý mẫu Nguyễn Đình Sỹ cộng (2008) Mẫu có tỷ lệ nhiễm thấp (27%) sử dụng Javen nồng độ cao (30%) Năm 2014, Khi thực thí nghiệm ni cấy mơ đinh lăng 14 Nguyễn Trung Hậu cs nghiên cứu nồng độ chất khử trùng javel thời gian khử trùng mẫu lên đinh lăng Kết thu với nồng độ javel 50% thời gian khử trùng mẫu 10 phút có tỉ lệ mẫu chết 4,7% tỷ lệ mẫu sống vô trùng 96,3% đạt hiệu tốt trình khử trùng mẫu so với công thức khác Nồng độ javen 50%, khử trùng mẫu 10 phút thích hợp cho khử trùng mẫu đinh lăng nồng độ Javel 100% mẫu chết bất hoạt hoàn tồn Như vậy, kết luận Javen có tính chất tẩy rửa cao, dù nồng độ nhỏ javel có khả ức chế nảy mầm hệ sợi lẫn bào tử nấm Từ kết ảnh hưởng dung dịch khử trùng lên phát triển hệ sợi nấm nảy mầm bào tử nấm, nhận định việc sử dụng HCl với nồng độ phù hợp cho phép thu dịch bào tử khơng cịn lẫn hệ sợi Hình 3.3: Ảnh hưởng loại dung dịch khử trùng đến khả nảy mầm bào tử 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ HCL VÀ THỜI GIAN XỬ LÝ TỚI KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA HỆ SỢI VÀ NẢY MẦM BÀO TỬ NẤM Tỷ lệ nảy mầm hệ sợi tỉ lệ nghịch với nồng độ dung dịch HCl thời gian khử trùng mẫu (Hình 4) Đối với nồng độ HCl 0.1N HCl 0.2N, tỷ lệ nảy mầm hệ sợi cao nghiệm thức phút khử trùng mẫu (đạt 5,79 ± 0,735% 4,16 ± 2,432%), thấp thời gian 20 phút khử trùng mẫu (đạt 0,475 ± 0,219 0,415 ± 0,148%) Tuy nhiên nồng độ HCl 0,3N hệ sợi nảy mầm khoảng thời gian 10 phút xử lý ban đầu (tỷ lệ đạt 7,585 ± 0,87% 0,378 ± 0,382%) Khi tăng dung dịch khử trùng lên nồng độ 0,4N, hệ sợi nấm phát triển xử lý khoảng thời gian lớn 15 10 phút Với thời gian khử trùng ngắn phút, tỷ lệ nảy mầm quan sát 3,375 ± 1,34% Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch khử trùng đến khả phát triển hệ sợi Tương tự, tỷ lệ nảy mầm bào tử có xu hướng giảm nồng độ dung dịch khử trùng HCl thời gian xử lý mẫu tăng lên (Hình 3.4) Ở nồng độ HCl 0,1N HCl 0,2N bào tử nảy mầm tất khoảng thời gian khử trùng mẫu Khi tăng nồng độ HCl lên 0,3N, sau phút khử trùng, tỷ lệ nảy mầm bào tử đạt 14,34 ± 2,913% Tỷ lệ giảm xuống 3,032 ± 0,714% nghiệm thức 10 phút Cũng nồng độ với thời gian khử trùng 15 phút, tỷ lệ nảy mầm bào tử 3,328 ± 1,23% sợi nấm hồn tồn khơng nảy mầm Nếu tiến hành ngâm mẫu HCl 0,3N lâu (20 phút), khả nảy mầm bào tử nấm hoàn toàn bị ức chế Sự ức chế khả nảy mầm hệ sợi nấm ghi nhận xử lý mẫu HCl 0,4N thời gian lớn phút Ngoài ra, nồng độ HCl 0,4N với 10 phút khử trùng mẫu tỉ lệ nảy mầm bào tử 0,88 ± 1,23% Ở nồng độ thời gian khử trùng mẫu cao hồn tồn khơng có phát triển hệ sợi nảy mầm bào tử 16 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch khử trùng đến khả nảy mầm bào tử nấm Dung dịch HCl biết có khả phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi tảo R.Sarada cs (2006) sử dụng dung dịch HCl để phá vỡ thành tế bào nhằm tách chiết astaxanthin từ vi tảo Haematococcus pluvialis, cho hiệu suất chiết xuất lên đến 86 - 94% (Sarada and D.Usha, 2006) Trong nghiên cứu này, HCl cho thấy khả tương tự gây ức chế đến nảy mầm hệ sợi bào tử, nhiên, mức độ ảnh hưởng khác Điều giải thích bào tử có thành tế bào dày hệ sợi có trắng xốp mịn (Nguyễn Thị Thanh Lan cs, 2016), nên với nồng độ HCl, tỷ lệ nảy mầm hệ sợi so với bào tử Với nồng độ HCl 0,3N, ta chủ động thu bào tử không lẫn hệ sợi nấm 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG TỚI TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG CỦA SỢI NẤM PHÁT TRIỂN TỪ BÀO TỬ ĐƠN Để tìm mơi trường nhân giống thích hợp, tiến hành khảo sát sinh trưởng bào tử nấm loại môi trường dinh dưỡng PDA, CDA, SDAY1 TH Kết thí nghiệm cho thấy, với điều kiện mơi trường dinh dưỡng khác phát triển hệ sợi bào tử nấm khác Vào ngày thứ quan sát, hệ sợi nấm bào tử mơi trường dinh dưỡng PDA đạt đường kính lớn với 30,55 ± 6,3mm Cịn mơi trường CDA, tổng hợp SDAY1 hệ sợi có đường kính giảm dần với giá trị 17 tương ứng 27,69 ± 6,3mm, 25,20 ± 4,95mm 15,29 ± 4,57mm Tại ngày khảo sát thứ 21, hệ sợi nấm bào tử nuôi môi trường dinh dưỡng PDA đạt giá trị đường kính hệ sợi lớn 67,52 ± 11,48mm Trong đó, hệ sợi nấm bào tử môi trường dinh dưỡng CDA, TH SDAY1 đạt giá trị đường kính giảm dần tương ứng 66,68 ± 6,57mm, 53,62 ± 10,1mm 45,27 ± 13,47mm Hình 3.6 Đường kính hệ sợi khuẩn lạc quan sát từ ngày thứ đến ngày thứ 21 môi trường khác Kết tương tự kết nghiên cứu Shrestha (2006), với đường kính hệ sợi nuôi điều kiện thiếu sáng môi trường PDA (77,5 ± 2,2 mm) cao so với CDA (65,6 ± 3,4mm) giá trị thấp đo 62,0 ± 3,6mm môi trường SDAY1 (Shrestha cs, 2006) Có thể nhận định rằng, mơi trường dinh dưỡng PDA có đủ nguồn dinh dưỡng cần thiết cho phát triển hệ sợi nấm Đối với mơi trường CDA, diện tích hệ sợi phát triển lớn so với hệ sợi môi trường cịn lại, hệ sợi lại có độ xốp cao Điều giải thích CDA chứa nguồn khoáng chất, thiếu nguồn nitơ hữu nên phát triển hệ sợi nhiều (Sung cs, 2010) 18 Hình 3.7 Diện tích hệ sợi mơi trường (a) PDA, (b) CDA, (c) TH (d) SDAY1 ngày quan sát thứ 21 Hình 3.8 Tốc độ sinh trưởng khuẩn lạc bào tử nấm môi trường khác 21 ngày khảo sát (tính từ ngày thứ quan sát) Tương tự, tốc độ sinh trưởng khuẩn lạc bào tử nấm Cordyceps militaris chịu ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng có mơi trường khảo sát Trong đó, hệ sợi nấm khuẩn lạc ni mơi trường PDA có tốc độ sinh trưởng nhanh 3,253 ± 0,76 mm/ngày, Đối với môi trường CDA, SDAY1 môi trường TH, 19 tốc độ sinh trưởng hệ sợi khuẩn lạc đạt thấp PDA với giá trị tương ứng 3,249 ± 0,39mm/ngày, 2,499 ± 0,853 mm/ngày 2,369 ± 0,704 mm/ngày Để đánh giá sắc tố sợi nấm, đĩa hệ sợi đưa ánh sáng có cường độ 800 lux với chu kỳ chiếu sáng 24h/ngày thời gian 14 ngày Theo Shrestha, ánh sáng yếu tố quan trọng việc xác định mật độ, kết cấu sắc tố hệ sợi nấm Thực vậy, có sai khác hệ sợi yếu tố môi trường khác (Hình 3.9) Hệ sợi nấm chuyển màu vàng cam rõ môi trường PDA SDAY1 Môi trường dinh dưỡng tổng hợp có màu vàng nhạt Cịn khác biệt mơi trường CDA, hệ sợi không tạo sắc tố nào, điều môi trường thiếu nguồn nitơ hữu (Sung cs 2010) Đồng thời, khuẩn lạc môi trường CDA có kết cấu hệ sợi mỏng phồng xốp mơi trường cịn lại diện tích hệ sợi lớn Bởi đưa điều kiện chiếu sáng 14 ngày, hệ sợi nấm co lại cịn lớp mỏng Trong đó, hệ sợi nấm khuẩn lạc môi trường PDA SDAY1 lại dày săn Điều giải thích nghiên cứu G.H.Sung cộng (2010) nguồn cacbon thành phần giúp tăng mật độ hệ sợi nấm dẫn đến trọng lượng hệ sợi cao (Sung cs 2010) Hình Sắc tố kết cấu hệ sợi nấm khuẩn lạc sau đưa ánh sáng 14 ngày loại môi trường (a) PDA, (b) CDA, (c) TH (d) SDAY1 20 3.5 QUY TRÌNH PHÂN LẬP BÀO TỬ NẤM CORDYCEPS MILITARIS Từ kết thu tơi đưa quy trình phân lập bào tử nấm cordyceps militris sau: Hình 3.10 Quy trình phân lập bào tử đơn từ thể Cordyceps militaris dung dịch HCl Bước Lấy phần đầu thể nấm Cordyceps militaris cho vào tube có dung tích 1.5ml Thêm vào 1ml nước cất nghiền nát mẫu Đem mẫu ly tâm 12000 vòng 15 phút loại bỏ phần dịch 21 Bước Xử lý mẫu với 1ml dung dịch HCl 0,3N 15 phút Sau đó, ly tâm mẫu để loại bỏ dịch Thêm vào tube 1ml nước cất, lắc ly tâm Quá trình rửa mẫu thực lần với nước cất Bước Cấy trang 20 ul dịch bào tử thu vào đĩa môi trường WA Tiến hành theo dõi liên tục từ - ngày kính hiển với độ phóng đại 40x - 100x Bước Khi bào tử bắt đầu nảy mầm, thực cấy chuyển bào tử sang đĩa môi trường PDA Các đĩa bào tử giữ điều kiện nhiệt độ 200C khơng có tác động ánh sáng 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đề tài, đưa số kết luận sau: - Các loại dung dịch khử trùng khác có ảnh hưởng tới khả nảy mầm sợi nấm bào tử nấm Trong đó, dịch khử trùng HCl đánh giá có tiềm việc bất hoạt sợi nấm dịch bào tử - Nồng độ dịch khử trùng HCl có ảnh hưởng tới khả phát triển sợi nấm nảy mầm bào tử Trong đó, dung dịch khử trùng HCl nồng độ 0.3N 15 phút xử lý có hiệu cao tốt việc bất hoạt 100% phát triển hệ sợi nấm tỷ lệ nảy mầm bào tử đạt 3,328 ± 1,23% - Xây dựng quy trình phân lập bào tử nấm Cordyceps militaris ứng dụng nuôi cấy - Mơi trường PDA đánh giá thích hợp cho phát triển khuẩn lạc (đường kính hệ sợi đạt 67,52 ± 11,48mm vào ngày quan sát thứ 21) KIẾN NGHỊ Từ số kết thu q trình nghiên cứu tơi đưa kiến nghị cho số định hướng nghiên cứu tương lai sau: - Tiếp tục khảo sát so sánh trình thối hóa giống nấm thu từ hệ sợi giống nấm thu từ bào tử - So sánh trình sinh trưởng phát triển thể để chứng minh nguồn giống phân lập từ bào tử thích hợp - Tiếp tục nghiên cứu quy trình phân lập bào tử để thu tỉ lệ bào tử khơng lẫn hệ sợi thích hợp 23 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Đình Sỹ, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Vân Thùy, Huỳnh Hữu Đức (2008), Nghiên cứu phương pháp khử trùng mầm chồi từ trưởng thành số giống điều (Anacardium occidentale L.) cao sản." Science & Technology11 Nguyễn Thị Thanh Lan, Đinh Thị Ngọc Thúy, Nguyễn Thị Thanh Bình (2016), Phân lập nấm ký sinh trùng Cordyceps SPP giàu hoạt chất Beauvericin từ vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(3): 533-538 Nguyễn Thị Thanh Mai, Trần Bảo Trâm, Trương Thị Chiên, Nguyễn Thị Hiền , Nguyễn Thị Phương Trang, Mai Thị Đàm Linh (2017).Đặc điểm sinh học, giá trị dược liệu phương pháp nuôi trồng nấm Cordyceps militaris Viện Ứng dụng công nghệ ,Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Trung Hậu , Lê Thị Như Thảo , Trần Văn Minh (2014), Nuôi cấy mô Đinh Lăng (Polyscias fruticosa L Harms) Tạo rễ tơ định lượng hoạt chất Samponin tích lũy Trường Đại học Cơng Nghiệp Hồ Chí Minh, Trường Đại học Nơng Lâm Hồ Chí Minh,Trường Đại học Quốc Tế, ĐHQG HCM Nguyễn Văn Bá (2008), Giáo trình mơn nấm học, trường Đại Học Cần Thơ- Viện nghiên phát triển công nghệ sinh học 24 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Bhushan Shrestha, Sang Kuk Han, Jae-Mo Sung and Gi-Ho Sun (2012) Fruiting Body Formation of Cordyceps militaris from Multi-Ascospore Isolates and Their Single Ascospore Progeny Strains Mycobiology 40(2), pp.100-106 Bhushan Shrestha, Sang-Kuk Han, Kwon-Sang Yoon1 and Jae-Mo Sung (2005), Morphological Characteristics of Conidiogenesis in Cordyceps militaris, The Korean Society of Mycology, 33(2): 69-76 Chen, Luo, Y li, Y J Sun, CK Zang (2004) Study on antioxidant activity of three Cordyceps sp by chemiluminescence Shanghai J Traditional Chinese Medicine, 38, 53– 55 in Chinese Choi, Y.W, Hyde, K D & Ho, W.H (1999) Single spore isolation of fungi Fungal diversity Das SK csl(2010) Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects Fitoterapia, 81, 961–968 Das SK, Masuda M, Mikio S (2010) Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects Fitoterapia 81, pp.961-968 Goh, T K (1999) Single-spore isolation using a hand-made glass needle Fungal Diversity, 2, 47-63 J, Lei C, Ai X, Wang Y (2012) Selenium enrichment on Cordyceps militaris Link and analysis on its main active components Applied Biochemistry and Biotechnology.166, pp.1215-1224 Jeong Seok Kwon, Jong Seok Lee, Won Cheol Shin, Keun Eok Lee, Eock Kee Hong, (2009) Optimization of Culture Conditions and Medium Components for the Production of Mycelial Biomass and Exo-polysaccharides with Cordyceps militaris in Liquid Culture Biotechnology and Bioprocess Engineering 14, pp.756-762 Jung, K., Kim, I H., & Han, D (2004) Effect of medicinal plant extracts on forced swimming capacity in mice Journal of Ethnopharmacology, 93, 75–81 Kamble V.R and Agre D.G.(2012) Reinvestigation of insect parasite fungus Cordyceps militaris from Maharashtra Bionano Frontier 5(2):224-225 25 Kang, N., Lee, H.-H., Park, I & Seo Y.-S (2017) Development of High CordycepinProducing Cordyceps militaris Strains Mycobiology, 45(1), 31–38 Khan, Mousumi Tania, Dian-zheng Zhang, Han-chun Chen (2010) Cordyceps mushroom: a potent anticancer nutraceutical The Open Nutraceuticals Journal, 8, Kobayashi Y (1982) Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella Transactions of the Mycological Society of Japan 23:329–364 Herbal, New York Li SP, Yang FQ, Tsim KWK (2006) Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41, pp.1571-84 Li SP, Yang FQ, Tsim KWK, (2006) Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41, pp.1571-84 Lim L., Lee C., Chang E., (2012) Optimization of solid state culture conditions for the production of adenosine, cordycepin, and D-mannitol in fruiting bodies of medicinal caterpillar fungus Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link (Ascomycetes) Int J Med Mushrooms, 14, 181–7 QI Tan, Tao Cai, Jing Wei, Aiping Feng, Wenjun Mao, Dapeng Bao (2011) Molecular identification of mating type genes in asexual spores of Cordyceps militaris Sandra C Stringer, Martin D Webb, Susan M George, Carmen Pin, and Michael W Peck, (2005), Heterogeneity of Times Required for Germination and Outgrowth from Single Spores of Non Proteolytic Clostridium botulinum Sarada, R.V.R., D Usha, G.A.R (2006) An Efficient Method for Extraction of Astaxanthin From Green Alga Haematococcus Pluvialis Seulmee S., Sungwon L., Jeonghak K., Sunhee M., Seungjeong L., Chong-Kil L., Kyunghae C., Nam-Joo H., Kyungjae K (2009) Cordycepin suppresses Expression of Diabetes Regulating Genes by Inhibition of Lipopolysaccharide-induced Inflammation in Macrophages Immune Network 9(3):98-105 Shih, I L., Tsai, K L., & Hsieh, C (2007) Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris Biochemical Engineering Journal, 33, 193–201 26 Shonkor K D., Shinya F., Mina M and Akihiko S., (2010) Efficient Production of Anticancer Agent Cordycepin by Repeated Batch Culture of Cordyceps militaris Mutant Lecture Notes in Engineering and Computer Science 20-22 Shrestha; B., Lee, W H.; Han, S K., Sung, J M (2006) Observations on some of the mycelial growth and pigmentation characteristics of Cordyceps militaris isolates Mycobiology, 34(2), 83-91 So-Young Won, Eun-Hee Park (2005) Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris Journal of Ethnopharmacology, 96, 555–561 Stringer, S C., Webb, M D., George, S M., Pin, C., & Peck, M W (2005) Heterogeneity of times required for germination and outgrowth from single spores of nonproteolytic Clostridium botulinum Applied and Environmental Microbiology, 71(9), 4998-5003 Sung, G H., Shrestha, B., Park, K B., & Sung, J M (2010) Cultural characteristics of Shimizuomyces paradoxus collected from Korea Mycobiology, 38(3), 189-194 Wang GD (1995) Ecology, cultivation and application of Cordyceps and Cordyceps sinensis Scientific and Technical Documents, Beijin Young-Joon Ahn, Suck-Joon Park, Sang-Gil lee, Sang-Cheol Shin and Don-Ha Cho, (2000), Cordycepin: selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp Journal of Agricultural and Food K Zhang, S YuanYing, and L Cai (2013) An Optimized Protocol of Single Spore Isolation for Fungi Cryptogam Mycol., vol 34, no 4, pp 349–356,.Chemistry, 48, 2744–2748 Zhang (2010) Extraction, purification and antitumor activity of polysaccharide from mycelium of mutant Cordyceps militaris Chemical Research in Chinese Universities, 26, 798–802 Zheng P., Xia Y.L., Xiao Ch.H.,(2011) Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine Genome Biology 23; 27 ... (d)SDAY1 Hình 3.10 Quy trình phân lập bào tử đơn từ thể Cordyceps militaris dung dịch HCl vii 21 TÓM TẮT Đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng quy trình phân lập bào tử đơn nấm Cordyceps militaris? ?? thực... MẦM CỦA HỆ SỢI VÀ BÀO TỬ NẤM 15 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG TỚI TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG CỦA SỢI NẤM PHÁT TRIỂN TỪ BÀO TỬ ĐƠN 17 3.5 QUY TRÌNH PHÂN LẬP BÀO TỬ NẤM CORDYCEPS MILITARIS. .. triển bào tử nấm hệ sợi nấm Cordyceps militaris Xây dựng quy trình phân lập bào tử nấm Cordyceps militaris Tìm loại mơi trường thích hợp cho tốc độ sinh trưởng sợi nấm hình thành từ bào tử CHƯƠNG