Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng đến sinh trưởng và hàm lượng cordycepin của hệ sợi nấm cordyceps militaris trong môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN DINH DƯỠNG ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG CORDYCEPIN CỦA HỆ SỢI NẤM Cordyceps militaris TRONG MÔI TRƯỜNG DỊCH THỂ NUÔI CẤY TĨNH NGUYỄN TƯỜNG VƯƠNG Đà Nẵng, năm 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN DINH DƯỠNG ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG CORDYCEPIN CỦA HỆ SỢI NẤM Cordyceps militaris TRONG MÔI TRƯỜNG DỊCH THỂ NI CẤY TĨNH Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa: 2016-2020 Sinh viên: Nguyễn Tường Vương Người hướng dẫn: ThS Lê Vũ Khánh Trang Đà Nẵng, năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hoàn toàn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả Nguyễn Tường Vương i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp mình, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể giáo viên khoa Sinh – Môi trường, Đại học Sư phạm Đà Nẵng hết lịng tận tình bảo, truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học tập trường thời gian qua Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Lê Vũ Khánh Trang TS Trịnh Đăng Mậu, người trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ động viên cá nhân tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Thật lịng vơ cảm ơn hỗ trợ, giúp đỡ động viên gia đình tơi, bạn bè suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp, suốt trình học tập vừa qua Mặc dù cố gắng để hồn thành khóa luận song khơng thể tránh khỏi thiếu sót Kính mong q thầy, giáo tồn thể bạn bè góp ý để đề tài hồn thiện Xin kính chúc q thầy cô sức khỏe thành công nghiệp đào tạo hệ tri thức tương lai Một lần xin chân thành cảm ơn Đà Nẵng, ngày 18 tháng 07 năm 2020 Nguyễn Tường Vương ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU 1 TÍNH CẤP THIẾT MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Ý NGHĨA ĐỀ TÀI 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ NẤM Cordyceps militaris 1.2 GIỚI THIỆU VỀ HỢP CHẤT SINH HỌC CORDYCEPIN 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NẤM Cordyceps militaris TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM …………………………………………………………………………………………6 1.3.1 Nghiên cứu nấm Cordyceps militaris Việt Nam 1.3.2 Nghiên cứu nấm Cordyceps militaris giới CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon đến hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm Cordyceps militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường đến hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm Cordyceps militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 10 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại đến hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm Cordyceps militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 10 2.2.4 Phương pháp xác định sinh khối khô 11 iii 2.2.5 Phương pháp định lượng Cordycepin 11 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 12 2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 12 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBON ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG CORDYCEPIN CỦA HỆ SỢI NẤM C MILITARIS 16 3.1.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng hệ sợi nấm C militaris 16 3.1.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm Cordyceps militaris 17 3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG CORDYCEPIN CỦA HỆ SỢI NẤM C MILITARIS 18 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ đường đến sinh trưởng hệ sợi nấm C militaris 18 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ đường đến hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm Cordyceps militaris 20 3.3 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ION KIM LOẠI ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG CORDYCEPIN CỦA HỆ SỢI NẤM CORDYCEPS MILITARIS 21 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại đến sinh trưởng hệ sợi nấm C militaris 21 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại đến hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm Cordyceps militaris 22 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT C.militaris Cordyceps militaris cs cộng g/L gam/lit mg/mL miligam/mililit HPLC High Performance Liquid Chromatography v DANH MỤC BẢNG Số hiệu Tên bảng Trang Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon 12 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường 13 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng ion kim loại 15 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc Cordycepin (A) Adenosine (B) 3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng hệ sợi nấm 16 C.militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 3.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hàm lượng Cordycepin 17 hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 3.3 Ảnh hưởng nồng độ đường đến sinh trưởng hệ sợi nấm 19 C.militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 3.4 Ảnh hưởng nồng độ đường đến hàm lượng Cordycepin 20 hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 3.5 Ảnh hưởng ion kim loại đến sinh trưởng hệ sợi nấm 21 C.militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 3.6 Ảnh hưởng ion kim loại đến hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh vii 22 TÓM TẮT Cordycepin hợp chất có hoạt tính sinh học sản xuất chi Cordyceps chất chuyển hóa linh hoạt Cordyceps militaris (C.militaris) đa dạng hoạt động sinh học Hợp chất sử dụng tác nhân dược phẩm, có khả kháng ung thư, kháng oxy hóa, kháng viêm, tăng cường hoạt động hệ miễn dịch Do đó, việc tích lũy hàm lượng Cordycepin mục tiêu việc ni cấy hệ sợi môi trường dịch thể Nghiên cứu tập trung khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến khả tích lũy Cordycepin hệ sợi nấm C.militaris Kết cho thấy, môi trường chứa maltose thu hàm lượng Cordycepin cao với 0,317 mg/mL thấp môi trường chứa saccharose (0,09 ± 0,008 mg/mL) Nồng độ maltose 20 g/L thu hàm lượng Cordycepin cao với (0,43 ± 0,05 mg/mL) thấp nồng độ maltose 40g/L (0,17 ± 0,06 mg/mL) Mơi trường có bổ sung ion Fe2+ cho hàm lượng Cordycepin cao (0,23 ± 0,008 mg/mL), đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng tối ưu, phù hợp cho phát triển hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh viii 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ đường đến hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm C militaris Các nồng độ maltose khác (20g/L, 40g/L 60g/L) khảo sát để đánh giá tác dụng chúng việc sản xuất Cordycepin Hình 3.4 thể ảnh hưởng nồng độ maltose đến hàm lượng Cordycepin tích lũy hệ sợi nấm ni môi Cordycepin (mg/mL) trường dịch thể, điều kiện nuôi cấy tĩnh Nồng độ cacbon (g/L) Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ đường đến tích lũy Cordycepin hệ sợi nấm C militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh Khối lượng Cordycepin cao ghi nhận mơi trường có nồng độ maltose 20g/L (0,43 ± 0,05 mg/mL), sau maltose 60g/L (0,212 ± 0,07 mg/mL) thấp maltose 40g/L (0,17 ± 0,06 mg/mL) Kết nghiên cứu ghi nhận xu hướng với nghiên cứu Ting-chi Wen cs (2014), hàm lượng Cordycepin thu giảm tăng nồng độ cacbon (Tingchi Wen cs, 2014) Nguyên nhân làm giảm hàm lượng Cordycepin áp suất thẩm thấu gây nồng độ cacbon cao gây bất lợi cho trình sinh tổng hợp chất 20 chuyển hóa, khơng thuận lợi cho q trình sinh tổng hợp Cordycepin nấm dược liệu C.militaris (Bai YH cs, 2012; Hà Thị Hoa Chun-Li Wang, 2015) 3.3 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ION KIM LOẠI ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG CORDYCEPIN CỦA HỆ SỢI NẤM CORDYCEPS MILITARIS 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại đến sinh trưởng hệ sợi nấm C militaris Để khảo sát ảnh hưởng ion kim loại đến hệ sợi nấm C.militaris mơi trường có bổ sung ion kim loại khác bao gồm Cu2+, Zn2+, Fe2+ Fe3+ để quan sát ảnh hưởng chúng phát triển sinh khối sợi nấm C.militaris Kết đánh Trọng lượng khô (mg/mL) giá trọng lượng nấm khô sau cấy giống 15 ngày, kết thể hình 3.5 Ion kim loại Hình 3.5 Ảnh hưởng ion kim loại đến sinh trưởng hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể ni cấy tĩnh Thí nghiệm ảnh hưởng ion kim loại đến phát triển sợi nấm C.militaris tiến hành khảo sát với ion kim loại Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+ mẫu đối chứng không bổ sung ion kim loại Kết thể hình 3.5, trọng lượng khơ cao 21 ghi nhận môi trường chứa Fe2+ (9,19 ± 1,4 mg/mL), Cu2+ (8,67 ± 0,6 mg/mL), Fe3+ (6,7195 ± 0,09 mg/mL) thấp Zn2+ (4,6175 ± 0,46 mg/mL) So với mẫu đối chứng, trọng lượng sinh khối khô bổ sung Fe2+ cao 1,35 mg/mL, mơi trường có bổ sung Fe3+ Zn2+ làm giảm sinh khối sợi nấm Trong nghiên cứu Dan-dan Fan cs (2012) nhận định rằng, việc bổ sung Fe2+ cải thiện tăng trưởng sợi nấm Như vậy, nguồn ion kim loại khảo sát mơi trường chứa ion Fe2+ cho hệ sợi tơ nấm C.militaris phát triển tốt nhất, đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng tối ưu, phù hợp cho phát triển hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại đến hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm C militaris Để khảo sát ảnh hưởng ion kim loại đến q trình tích lũy Cordycepin hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể giống cấp nuôi cấy môi trường có bổ sung ion kim loại khác bao gồm Cu2+, Zn2+, Fe2+ Fe3+ để quan sát ảnh hưởng chúng sản xuất Cordycepin sợi nấm C.militaris Kết thể Cordycepin (mg/mL) hình 3.6 Ion kim loại Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ ion kim loại đến tích lũy Cordycepin hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể ni cấy tĩnh 22 Thí nghiệm ảnh hưởng ion kim loại đến khả tích lũy Cordycepin sợi nấm C.militaris tiến hành khảo sát với ion kim loại Cu 2+, Zn2+, Fe2+ Fe3+ mẫu đối chứng không bổ sung ion kim loại Kết thể hình 3.6 cho thấy sản xuất Cordycepin tối đa thu cao mơi trường có bổ sung Fe2+ (0,23 ± 0,008 mg/mL) sau Zn2+ (0,135 ± 0,0008 mg/mL), Fe3+ (0,121 ± 0,03 mg/mL ) thấp Cu2+ (0,096 ± 0,02 mg/mL) So với mẫu đối chứng mơi trường có bổ sung Fe2+ cho hàm lượng Cordycepin cao 0,2105 mg/mL, hàm lượng Cordycepin môi trường lại thấp so với mẫu đối chứng Kết thí nghiệm tương tự với nghiên cứu Dan-dan Fan cs (2012), hàm lượng Cordycepin thu cao môi trường bổ sung Fe2+ (0,33 ± 0,03 mg/mL) cao kết thí nghiệm 0,1 mg/mL Nghiên cứu nhận định rằng, bổ sung Fe2+ vào môi trường nuôi cấy tham gia chất xúc tác sinh học trình tích lũy Cordycepin Qua kết thí nghiệm, kết luận việc bổ sung Fe2+ có tác động tích cực đến tích lũy Cordycepin mơi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua trình khảo sát điều kiện nuôi cấy môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh hệ sợi nấm Cordyceps militaris, rút kết luận sau: - Nguồn cacbon có ảnh hưởng tới sinh trưởng hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm điều kiện nuôi cấy tĩnh Sinh trưởng tốt ghi nhận nguồn cacbon saccharose (đạt 9,7 ± 0,29 mg/mL), hàm lượng Cordycepin lại ghi nhận nguồn cacbon maltose (đạt 0,317 mg/mL) - Nồng độ đường có ảnh hưởng tới sinh trưởng hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm điều kiện nuôi cấy tĩnh Sinh trưởng hàm lượng Cordycepin tốt ghi nhận nồng độ maltose 20 g/L 8,255 ± 0,57 mg/mL 0,43 ± 0,05 mg/mL - Ion kim loại có ảnh hưởng tới sinh trưởng hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm điều kiện nuôi cấy tĩnh Sinh trưởng hàm lượng Cordycepin tốt ghi nhận môi trường có bổ sung Fe2+ 9,19 ± 1,4 mg/mL, 0,23 ± 0,008 mg/mL KIẾN NGHỊ - Tiếp tục khảo sát nồng độ đường ảnh hưởng đến sinh trưởng hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm C.militaris - Đánh giá thêm số yếu tố tác động đến sinh trưởng hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể: pH, nguồn Nito để hồn thiện quy trình nhân giống Cordyceps militaris môi trường dịch thể, - Định lượng tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học cao alkaloid, polysaccharides hệ sợi tơ nấm C.militaris để phục vụ cho y dược 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2009), Khái quát nhân giống sản xuất nấm: 63-65 Nguyễn Như Chương cs (2016), Nuôi cấy thành công nấm Đông trùng hạ thảo (Cordycepin militaris), Hướng đến chuyển giao, nhân rộng góp phần phát triển kinh tế- xã hội địa phương, Trung tâm ứng dụng khoa học công nghệ tỉnh Lâm Đồng: 2-6 Trần Thị Thu Hà cs (2015), Bước đầu nghiên cứu công nghệ nuôi trồng nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) Việt Nam, Tạp chí Khoa học Phát triển,13 (3): 445-446 Nguyễn Thị Minh Hằng cs (2017), Nghiên cứu nuôi trồng đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) giá thể tổng hợp nhộng tằm, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Lâm nghiệp, 4: 10-11 Hà Thị Hoa and Chun-Li Wang (2015), The Effects of Temperature and Nutritional Conditions on Mycelium Growth of Two Oyster Mushrooms (Pleurotusostreatus and Pleurotus cystidiosus), Mycobiology, 43(1): 14-23 Vũ Hoài Nam, Mai Thị Trang, Trần Văn Phụng, Nguyễn Huy Thuận Dương Văn Cường (2019), The effects of nutritional and fermentation conditions on mycelium growth of Cordyceps militaris in liquid culture, Journal of Applied Biotechnology & Bioengineering Nguyễn Thị Liên Thương cs, (2016), Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris: đăc điểm sinh học, giá tri ̣dược liêu yếu tố ảnh hưởng đến q trı̀nh ni trồng nấm Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 44b: 9-17 Bùi Thị Kim Tuyền (2010), Nghiên cứu so sánh phát triển sinh khối hàm lượng βglucan số chủng nấm Hương nuôi cấy môi trường lỏng, Hà Nội Trung tâm thơng tin khoa học cơng nghệ TP Hồ Chí Minh (2014), Đông trùng hạ thảo xu hướng sản xuất thương mại, Báo cáo phân tích xu hướng cơng nghệ: 4-15 Ahn YJ., Park SJ., Lee SG., Choi DH (2000), Cordycepin: selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp., J Agric., Food Chem, 48: 2744-2748 25 Aguilar CN., Aguilera-Carbo A., Robledo A., cs (2008), Production of antioxidant nutraceuticals by Solid-State cultures of pomegranate (Punica granatum) peel and creosote bush (Larrea tridentata) leaves, Food Technol Biotech, 46: 218–22 Bai YH, Feng YQ, Mao DB, Xu CP Optimization for betulin production from mycelial culture of Inonotus obliquus by orthogonal design and evaluation of its antioxidant activity J Taiwan Inst Chem Eng 2012;43:663-9 Chiang cs (2017), Effect of light-emitting diodes on the production of Cordycepin, mannitol and adenosine in solid-state fermented rice by Cordyceps militaris Chunyan XIE, Gaixia LIU, Zhenxin GU*, Gongjian FAN, Lei ZHANG, Yingjuan GU (2009), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Jiangsu: 294- 296 Dan-dan Fan, Wei Wang and Jian-Jiang Zhong (2012), Enhancement of Cordycepin production in submerged cultures of Cordyceps militaris by addition of ferrous sulfate, Biochemical Engineering Journal: 30-35 Gu YX., Song YW., Fan LQ., Yuan QS (2007), Antioxidant activity of natural and cultured Cordyceps spp, Article in Chinese 32(11): 1028-31 Hardeep S Tuli SSS., A K Sharma (2014), Pharmacological and therapeutic potential of Cordyceps with special reference to Cordycepin, Biotech, 4: 1-12 Hui-Chen Lo CH., Tai-Hao Hsu (2013), A Systematic Review of the Mysterious Caterpillar Fungus Ophiocordyceps sinensis in Dong-ChongXiaCao (冬蟲夏草 Dōng Chóng Xià Cǎo) and Related Bioactive Ingredients, Traditional and Complementary Medicine: 16-32 Frederiksen S., Malling H., Klenow H (1965), Isolation of 3'- deoxyadenosine (Cordycepin) from the liquid medium of Cordyceps militaris (L.ex Fr.) Link, Biochim Biophys Acta, 95: 189-193 26 Kaczka EA., Trenner NR., Arison B., Walker RW., Folkers K (1964), Identification of Cordycepin, a metabolite of Cordyceps militaris, as 3'-deoxyadenosine, Biochem Biophys Res Commun, 14: 456-457 Lee HH., Park C., Jeong JW., Kim MJ., Seo MJ., Kang BW., Park JU., Kim GY., Choi BT., Choi YH., Jeong YK (2013), Apoptosis induction of human prostate carcinoma cells by Cordycepin through reactive oxygen species mediated mitochondrial death pathway, Int J Oncol, 42: (3) 1036-1044 Lei Huang, Qizhang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang and Xuanwei Zhou (2009), Determination and analysis of Cordycepin and adenosine in the products of Cordyceps spp., African Jourrnal of Microbiology Research 3(12): 957-961 Li Ma, Song Zhang and Mei Du (2015), Cordycepin from Cordyceps militaris prevents hyperglycemia in alloxan-induced diabetic mice, Nutrition Research 35: 431-439 Lim L.T., Lee C.Y and Chang E.T (2012), Optimization of solid state culture conditions for the production of adenosine, Cordycepin, and D-mannitol in fruiting bodies of medicinal caterpillar fungus Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link (Ascomycetes), Int J Med Mushrooms,2: 181-187 Mao XB and Zhong JJ (2004), Hyper-production of Cordycepin by two-stage dissolved oxygen control in submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris in bioreactors, Biotechnol Prog 20(5): 1408–1413 Mao XB, Titiporn Eksriwong, Somchai Chauvatcharin, Jian-Jiang Zhong (2005), Optimization of carbon source and carbon/nitrogen ratio for Cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris, Process Biochemistry 40: 1667–1672 Mao XB and Zhong JJ (2006), Significant effect of NH4+ on Cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris, Enzyme Microb Technol, 31: 250-255 27 Masuda M, Urabe E, Sakurai A and Sakakibara, M (2006), Production of Cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris, Enzyme Microb Technol 39(4): 641–646 Mohd Adnan, Syed Amir Ashraf, Saif Khan, Eyad Alshammari and Amir Mahgoub Awadelkareem (2017), Effect of pH, temperature and incubation time on Cordycepin production from Cordyceps militaris using solid-state fermentation on various substrates, CyTA - Journal of Food,15:4, 617-621 Ni H, Zhou XH, Li HH and Huang WF (2009), Column chromatographic extraction and preparation of Cordycepin from Cordyceps militaris waster medium, Chromatogr B;877:2135-41 Jiapeng T, Yiting L and Li Z (2014), Optimization of fermentation conditions and purification of Cordycepin from Cordyceps militaris, Prep Biochem Biotechnol 44: 90– 106 J.P Park, S.W Kim, H.J Hwang and J.W Yun (2001), Optimization of submerged culture conditions for the mycelial growth and exo-biopolymer production by Cordyceps militaris, Letters in Applied Microbiology, 33: 76 - 81 Ryu E., Son M., Lee M., Lee K., Cho JY., Cho S., Lee SK., Lee YM., Cho H., Sung GH., Kang H (2014), Cordycepin is a novel chemical suppressor of Epstein-Barr virus replication, Oncoscience, 1(12): 866-881 Sung JM, Park YJ, Lee Jo (2006), Effect of preservation periods and subcultures on fruiting body formation of Cordyceps militaris in vitro, Mycobiology 34: 196 -199 Tang Jiapeng, Liu Yiting and Zhu Li (2014), OPTIMIZATION OF FERMENTATION CONDITIONS AND PURIFICATION OF CORDYCEPIN FROM Cordyceps militaris, Preparative Biochemistry & Biotechnology, 44: 90–106 Ting-chi Wen, Guang-rong Li, Ji-chuan Kang, Chao Kang and Kevin D Hyde (2014), Optimization of Solid-state Fermentation for Fruiting Body Growth and Cordycepin Production by Cordyceps militaris, Chiang Mai J Sci, 41(4) : 858-872 28 Tuli HS, Sadhu SS, Sharma AK and Kashayap D (2014), Optimization of extraction conditions and antimicrobial potential of a bioactive metabolite, Cordycepin from Cordyceps militaris 3936, WJPPS 3: 1525-1535 Xian-Bing Mao, Titiporn Eksriwong, Somchai Chauvatcharin, Jian-Jiang Zhong (2005), Optimization of carbon source and carbon/nitrogen ratio for Cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris, Process Biochemistry 40, 1667–1672 Xuesong Wang, Fang Liu, Fang Li, Hongyan Cai, Wei Sun, Xuan Chen (2016), Determination of Cordycepin content of Cordyceps militaris recobinant rice by high performance liquid chromatography, Trop Journal of Pharma Research October, 15(10): 2235-2239 Zeng-Chin Liang, Chiu-Yeh Wu, Zheng-Liang Shieh, Shou-Liang Cheng (2009), Utilization of grass plants for cultivation of Pleurotus citrinopileatus, International Biodeterioration & Biodegradation pp: 509–514 Wang HJ, Lv ZL, Zhang BP (2009), Study on variability of Cordyceps militaris Edible Fungi China., 28(5), tr 30 -31 Xinghui Yu JL., Xianfang Liu., Sen Guo., Yidan Lin., Xiangguo Liu., Ling Su (2016), Cordycepin induces autophagy-mediated c-FLIPL degradation and leads to apoptosis in human non-small cell lung cancer cells, Cancer Chemother Pharmacol(8): 6691-6699 Yuko O., Jung-Bum L., Kyoko H., Akio F., Dong-Ki P and Toshimitsu H.( 2007), In Vivo Anti-influenza Virus Activity of an Immunomodulatory Acidic Polysaccharide Isolated from Cordyceps militaris Grown on Germinated Soybeans, Journal of Agricultural and Food Chemistry 55: 10194–10199 29 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đường chuẩn Cordycepin Phụ lục 2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Cordycepin 30 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu saccharose Phụ lục 4: Sắc ký đồ mẫu maltose 31 Phụ lục 5: Sắc ký đồ mẫu maltose 40g/L Phụ lục 6: Sắc ký đồ mẫu maltose 20g/L 32 Phụ lục 7: Sắc ký đồ mẫu Cu2+ Phụ lục 8: Sắc ký đồ mẫu Fe2+ 33 Phụ lục 9: Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh Nguồn cacbon Sinh khối khô (mg/mL) Hàm lượng Cordycepin (mg/mL) Fructose 6,525 ± 0,007 0,209 ± 0,014 Glucose 6,69 0,19 ± 0,019 Lactose 6,865 ± 0,5 0,25 ± 0,0008 Maltose 7,395 ± 1,86 0,317 Saccharose 9,7 ± 0,3 0,008 ± 0,0008 Phụ lục 10: Ảnh hưởng nồng độ đường đến sinh trưởng hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh Nồng độ Sinh khối khô (mg/mL) Hàm lượng Cordycepin (mg/mL) 20 g/L 8,255 ± 0,57 0,43 ± 0,05 40 g/L 7,265 ± 1,31 0,17 ± 0,06 60 g/L 6,043 ± 0,57 0,212 ± 0,07 Phụ lục 11: Ảnh hưởng ion đến sinh trưởng hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm C.militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh Ion kim loại Sinh khối khô (mg/mL) Hàm lượng Cordycepin (mg/mL) Cu2+ 8,67 ± 0,6 0,096 ± 0,02 Zn2+ 4,6175 ± 0,46 0,135 ± 0,0008 Fe2+ 9,19 ± 1,4 0,23 ± 0,008 Fe3+ 6,7195 ± 0,09 0,121 ± 0,03 34 ... Cordycepin hệ sợi nấm Cordyceps militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 10 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại đến hàm lượng Cordycepin hệ sợi nấm Cordyceps militaris môi trường dịch thể nuôi. .. nấm C .militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 3.3 Ảnh hưởng nồng độ đường đến sinh trưởng hệ sợi nấm 19 C .militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 3.4 Ảnh hưởng nồng độ đường đến hàm lượng. .. lượng Cordycepin 20 hệ sợi nấm C .militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 3.5 Ảnh hưởng ion kim loại đến sinh trưởng hệ sợi nấm 21 C .militaris môi trường dịch thể nuôi cấy tĩnh 3.6 Ảnh hưởng