Luận án với mục tiêu nghiên cứu đặc điểm và tính chất của LipA tái tổ hợp (rLipA) từ B. Subtilis FS2 có hai hoạt tính Lipase và Gelatinase; xác định ảnh hưởng của các gốc axít amin trong trung tâm hoạt động lên hai hoạt tính của rLipA.
bộ giáo dục v đo tạo viện khoa học v c«ng nghƯ viƯt nam ViƯn c«ng nghƯ sinh häc PHÙNG THU NGUYT Phân lập v nghiên cứu tính chất lipase A tái tổ hợp có hai hoạt tính lipase - GELATINASE từ bacillus subtilis fs2 Chuyên ngành: Vi sinh vËt häc M· sè: 62 42 40 01 Tãm t¾t Luận án tiến sĩ sinh học Hà Nội - 2010 Cơng trình hồn thành tại: Viện Cơng nghệ sinh học Trung tâm Sinh học Y dược Upsala, Trường Đại học Uppsala, Thụy Điển Người hướng dẫn khoa học PGS.TS TRƯƠNG NAM HẢI Viện Công nghệ sinh học GS JAN-CHRISTER JANSON Trường Đại học Uppsala - Thụy Điển Phản biện 1: GS TS Nguyễn Đình Quyến Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia HN Phản biện 2: GS TS Nguyễn Thành Đạt Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Thị Hồi Trâm Viện Cơng nghiệp thực phẩm Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước họp tại: Viện Công nghệ sinh học vào hồi 8h30 , ngày 09 tháng 07 năm 2010 Có thể tìm hiểu luận án tại: Viện Công nghệ sinh học Và thư viện Quốc gia H Ni Danh mục Các công trình khoa học có liên quan đến nội dung luận án Phung Thu Nguyet, Tran Minh Tri, Nguyen Hong Thanh, To Kim Anh, Truong Nam Hai (2005) Cloning and expression of gene encoding for collagenase from Bacillus subtilis FS2, Proceeding of International Vietnam – Korea Symposium, 16-21 Nguyễn Hồng Thanh, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải, (2007), “Biểu gen mã hóa lipase A (lipA) từ chủng Bacillus subtilis FS2”, Tạp chí Công nghệ sinh học, (1): 41-46 Phung Thu Nguyet, Nguyen Hong Thanh, Jan-Christer Janson, Truong Nam Hai (2007) “Study on a novel property of recombinant lipase A of Bacillus subtilis FS2” Asian Journal on Science and Technology for Development, 25(2): 333-340 Phùng Thu Nguyệt, Nguyễn Hồng Thanh, Jan-Christer Janson, Trương Nam Hải (2009) “Nghiên cứu lên men lượng lớn chủng Escherichia coli BL21 tái tổ hợp mang gen mã hóa lipase Bacillus subtilis FS2” Tạp chí Khoa học Công nghệ, 47 (2): 109116 Phùng Thu Nguyệt, Nguyễn Hồng Thanh, Karl Hult, Trương Nam Hải (2009) “Phân lập nghiên cứu tính chất lipase A có hai hoạt tính lipase gelatinase từ vi khuẩn Bacillus subtilis FS2” Báo cáo khoa học hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2009, pp 671-675 Nguyễn Hồng Thanh, Phùng Thu Nguyệt, Karl Hult, Trương Nam Hải (2010) “Nghiên cứu ảnh hưởng đột biến trung tâm hoạt động lipase A tái tổ hợp từ Bacillus subtilis FS2 lên hai hoạt tính lipase gelatinase” Tạp chí Cơng nghệ sinh học, (1): 1-8 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT & đtg AcN bp BSA ĐC DNA dO2 E-S FPLC HCDC IPTG đồng tác giả Acetonitrile Base pair Bovine serum albumin Đường chạy Deoxyribonucleic acid Dissolved oxygen Enzyme - substrate Fast Protein Liquid Chromatography High cell density culture kb kDa LB LBA MU ORF PCR PDA PDB PNPB rLipA SDS SDS-PAGE Kilo base Kilo Dalton Luria-Betani Luria-Betani Ampicillin 4-methylumbelliferyl heptylphosphonate Open Reading Frame Polymerase Chain Reaction Pyrenedecanoic acid Protein Data Bank p-nitrophenylbutyrate Recombinant lipase A Sodium dodecyl sulphate SDS-polyarcrylamide gel electrophoresis Isopropyl-β-D-thiogalactosidase -1- MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Thông thường enzyme đặc hiệu với kiểu phân cắt tạo thành liên kết định, nhiên số enzyme vừa có khả tham gia phản ứng thủy phân lại vừa tham gia phản ứng tổng hợp tạo liên kết Các enzyme biết đến với khả xúc tác cho nhiều kiểu phản ứng hoá học chúng thường gọi enzyme đa xúc tác (enzyme promiscuity) Ngồi hoạt tính bản, enzyme xuất số hoạt tính khác thay đổi điều kiện phản ứng, thay đổi chất hay thay đổi tính xúc tác enzyme Đây đặc điểm ngẫu nhiên enzyme tự nhiên giúp cho sinh vật thích nghi với điều kiện khác góp phần vào q trình tiến hóa đa dạng sinh học enzyme Trong năm gần đây, enzyme đa xúc tác ngày quan tâm enzyme khơng đóng vai trò quan trọng q trình tiến hóa mà có vai trò q trình chuẩn bị enzyme để tổng hợp hợp chất hữu công nghiệp dược phẩm Việc nghiên cứu enzyme đa xúc tác khơng góp phần hiểu biết chế hoạt động enzyme mà có vai trò việc ứng dụng vào ngành công nghiệp Ngày nay, với phát triển công nghệ sinh học, việc sử dụng kỹ thuật di truyền tạo đột biến điểm kết hợp với phân tích cấu trúc protein, người ta chủ động làm tăng giảm hoạt tính enzyme nhiều lần điều kiện phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích ứng dụng thực tiễn Những thay đổi nhỏ trình tự axít amin làm thay đổi hoạt tính xúc tác enzyme dẫn đến thay đổi tính đặc hiệu với chất Trong trình sàng lọc gen mã hoá gelatinase Bacillus -2- subtilis FS2 phân lập từ nguồn nước mắm truyền thống Việt Nam, chúng tơi phát lipase A (LipA) ngồi hoạt tính lipase có hoạt tính thứ hai hoạt tính gelatinase LipA bên cạnh khả thủy phân chất lipase tributyrin enzyme thủy phân chất gelatinase collagen biến tính dạng gelatin đĩa thạch Như vậy, LipA B subtilis FS2 có đặc điểm enzyme đa xúc tác với hai hoạt tính lipase gelatinase Dựa vào đặc điểm LipA, tiến hành biểu LipA dạng tái tổ hợp nghiên cứu tính chất enzyme Các nghiên cứu tạo đột biến điểm trung tâm hoạt động LipA nhằm làm sáng tỏ vai trò gốc axít amin hoạt tính chế xúc tác enzyme Hiện nay, lipase gelatinase enzyme quan tâm nhiều khả ứng dụng rộng rãi chúng số ngành công nghiệp đặc biệt y dược Xuất phát từ nhu cầu ứng dụng enzyme thực tiễn từ đặc điểm LipA, tiến hành đề tài “Phân lập nghiên cứu tính chất lipase A tái tổ hợp có hai hoạt tính lipase - gelatinase từ B subtilis FS2” Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm tính chất LipA tái tổ hợp (rLipA) từ B subtilis FS2 có hai hoạt tính lipase gelatinase Xác định ảnh hưởng gốc axít amin trung tâm hoạt động lên hai hoạt tính rLipA Nội dung nghiên cứu - Phân lập biểu gen lipA mã hóa cho LipA B subtilis FS2 Nghiên cứu xác định hoạt tính lipase gelatinase rLipA ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, pH, ion kim loại tới hai hoạt tính Xác định thơng số động học enzyme - Tạo đột biến điểm gốc xúc tác trung tâm hoạt động enzyme để xác định vai trò gốc axít amin lên hai hoạt tính lipase gelatinase -3- - Nghiên cứu lên men tăng hiệu suất tổng hợp lipase tái tổ hợp từ chủng E coli BL21 (DE3) để ứng dụng vào sản xuất Việt Nam Những đóng góp luận án Đây cơng trình nghiên cứu LipA tái tổ hợp từ B subtilis FS2 có hai hoạt tính lipase gelatinase Cơng trình chứng minh gelatinase hoạt tính thứ hai rLipA phương pháp xác định hoạt tính đĩa thạch kit xác định hoạt tính Đã sử dụng phương pháp Mega-primer để tạo đột biến điểm gốc xúc tác Ser77, Asp133 His156 trung tâm hoạt động rLipA Hai đột biến S77C H156N tạo có hoạt tính lipase bị giảm hoạt tính gelatinase lại tăng lên Cơng trình nghiên cứu lần sử dụng chương trình phần mềm PYMOL để nghiên cứu cấu trúc protein rLipA từ B subtilis dựa sở liệu ngân hàng protein RCSB PDB Đã lên men thành công chủng E coli BL21-lipA hệ thống lên men lít, 10 lít 200 lít Hiệu tổng hợp lipase tái tổ hợp tăng lên gấp 10 lần phương pháp lên men fed-batch HCDC Kết mở triển vọng ứng dụng rLipA tái tổ hợp vào sản xuất công nghiệp Việt Nam Bố cục luận án Luận án gồm 143 trang có 19 bảng 67 hình; Mở đầu (3 trang); Chương Tổng quan tài liệu (38 trang); Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu (19 trang); Chương Kết thảo luận (66 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang); Các cơng trình khoa học liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (14 trang : tài liệu tiếng Việt, 118 tài liệu tiếng Anh 12 tài liệu Internet) -4- Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung enzyme 1.2 Đặc điểm số enzyme đa xúc tác 1.2.1 Giới thiệu chung enzyme đa xúc tác 1.2.2 Phân loại enzyme đa xúc tác 1.2.3 Các enzyme đa xúc tác góp phần vào tiến hóa đa dạng enzyme 1.3 Giới thiệu chung lipase 1.3.1 Đặc điểm chung lipase 1.3.2 Các lipase Bacillus 1.3.3 Các ứng dụng lipase sản xuất công nghiệp 1.4 Giới thiệu chung gelatinase 1.4.1 Các chất gelatinase 1.4.2 Cấu trúc gelatinase 1.4.3 Những ứng dụng gelatinase 1.5 Kỹ thuật tạo đột biến làm thay đổi tính chất enzyme 1.5.1 Các phương pháp tạo đột biến kỹ thuật di truyền 1.5.2 Ứng dụng phương pháp tạo đột biến làm thay đổi hoạt tính enzyme 1.6 Tình hình nghiên cứu lipase Việt Nam Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị máy móc 2.1.1 Vật liệu: Chủng B subtilis FS2 cung cấp từ PGS TS Tô Kim Anh, Viện CNSH-CNTP, Trường ĐH Bách Khoa, Hà Nội Chủng E coli DH5α, E coli BL21(DE3) plasmid pBluescriptSK(+), pUC18, pET22b(+) sử dụng để tách dòng biểu gen 2.1.2 Hóa chất thiết bị máy móc: Tất loại hóa chất cung cấp hãng Sigma, Bio-Rad, New England Bio-Labs (Mỹ); Merck, Fermentas (Đức) Các thiết bị máy móc sản xuất nước Mỹ, Nhật Bản, Thụy Điển Đức -5- 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp vi sinh: nuôi cấy lưu trữ chủng vi khuẩn theo Sambrook & đtg, 1989 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử: tách chiết DNA hệ gen từ B subtilis FS2, điện di DNA gel agarose, tách chiết DNA plasmid, kỹ thuật PCR, tinh DNA từ gel agarose, phản ứng cắt gắn DNA, biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli, biểu gen tế bào E coli theo Sambrook & đtg, 1989; xác định trình tự gen theo Sanger & đtg, 1977; điện di protein SDSPAGE theo Hames & đtg, 1989; tinh chế protein sắc ký lực, định lượng protein theo phương pháp Bradford, 1976; tạo đột biến điểm phương pháp Mega-primer theo Sarkar G, 1990 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính: hoạt tính lipase xác định đĩa thạch theo Beisson & đtg, 2000 kit xác định hoạt tính lipase Hoạt tính gelatinase xác định đĩa thạch theo phương pháp Tran & đtg, 2002 kit xác định hoạt tính gelatinase 2.2.4 Phương pháp lên men: lên men batch chủng E coli BL21-lipA theo Sambrook & đtg, 1989 Phương pháp lên men fed-batch HCDC theo phương pháp Lee S.Y, 1996 2.2.5 Phương pháp tin sinh xử lý số liệu phần mềm sinh học: phần mềm BioEdit, Expasy Swiss-Model tool phần mềm PYMOL (DeLano Scientific LLC Version 4.0, Mỹ) Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo ngân hàng DNA hệ gen phân lập gen mã hóa gelatinase Mục đích ban đầu chúng tơi phân lập gen mã hóa gelatinase từ vi khuẩn B subtilis FS2 để tổng hợp enzyme tái tổ hợp Do trình tự gen gelatinase B subtilis FS2 chưa xác định ngân hàng gen Genbank nên phải tiến hành sàng lọc gen từ ngân -6- hàng DNA hệ gen Trước hết DNA hệ gen B subtilis FS2 tách chiết xử lý enzyme hạn chế Sau3A I để tạo đoạn DNA có kích thước khoảng - kb (hình 3.1) Các đoạn DNA đưa vào vector pUC18 tạo ngân hàng DNA hệ gen B subtilis FS2 Trong trình sàng lọc 10000 khuẩn lạc từ ngân hàng DNA hệ gen, chọn dòng tái tổ hợp có hoạt tính gelatinase (hình 3.2) Dòng tế bào ký hiệu pUC-Gel kb Dòng đối chứng có pUC18 Dòng tái tổ hợp có vòng thủy phân 0,5 Hình 3.1 DNA hệ gen B subtilis FS2 xử lý Sau3A I ĐC 1: DNA hệ gen cắt Sau3A I, ĐC 2: Thang DNA chuẩn 1kb Hình 3.2 Dòng E coli DH5α tái tổ hợp sàng lọc từ ngân hàng DNA hệ gen có hoạt tính gelatinase mơi trường đĩa thạch chứa collagen biến tính 0,3% Đoạn DNA plasmid pUC-Gel có kích thước khoảng 3,3 kb Để xác định gen mã hóa gelatinase đoạn DNA 3,3 kb, trước hết phải xác định trình tự gen đoạn DNA Do đoạn DNA có kích thước tương đối lớn nên q trình đọc trình tự gen thường khơng hiệu xác Chúng thiết kế lập đồ vị trí cắt enzyme hạn chế để chia nhỏ đoạn gen tạo thuận lợi cho trình đọc trình tự gen Bản đồ enzyme hạn chế đoạn gen xác định dựa vào việc phân cắt đoạn DNA enzyme hạn chế khác Các enzyme hạn chế lựa chọn Kpn I, Sac I, EcoR I, Hind III, Xba I, Pst I, Sma I, Hinc II nằm vùng đa nối pUC18 enzyme Bcl I, Bgl II, Not I, Nco I, Cla I, Nde I, Dpn I, Xho I, Alu I, Rsa I khơng có điểm cắt vector Đoạn DNA 3,3 kb xử lý - 10 - tính đĩa thạch kit xác định hoạt tính 3.3.1 Xác định hoạt tính lipase gelatinase rLipA đĩa thạch Hoạt tính lipase xác định đĩa thạch có chứa chất tributyrin 0,1% hoạt tính gelatinase rLipA xác định đĩa thạch có chứa collagen biến tính 0,3% (dạng gelatin) Kết hình 3.8 3.9 cho thấy có xuất vòng thủy phân xung quanh giếng thạch có bổ sung rLipA, chứng tỏ enzyme có khả thủy phân hai loại chất khác đối chứng âm khơng chứa rLipA khơng thấy có tượng Ngồi ra, kết cho thấy số enzyme khác lysozyme, trypsin protease khơng có khả thủy phân chất collagen biến tính dạng gelatin rLipA (hình 3.9) 6 Hình 3.8 Kiểm tra hoạt tính lipase Hình 3.9 Kiểm tra hoạt tính gelatinase rLipA rLipA đĩa thạch chứa tributyrin 0,1% đĩa thạch có chứa collagen biến tính 0,3% 1: Đối chứng không chứa lipase, 2-9: rLipA tinh loại muối 1: Lysozyme, 2: Trypsin, 3, 4, 6: rLipA tinh loại muối, 5: Protease, 7: Đối chứng âm khơng chứa lipase Bên cạnh đó, chúng tơi tiến hành xác định hoạt tính lipase gelatinase kit xác định hoạt tính 3.3.2 Xác định hoạt tính rLipA kit xác định hoạt tính Hoạt tính lipase gelatinase rLipA xác định kit xác định hoạt tính chất gắn với nhóm huỳnh quang Khi phản ứng E-S xảy nhóm huỳnh quang phân tử chất giải phóng phát xạ bước sóng xác định Dựa vào cường độ phát xạ nhóm huỳnh quang, xác định tốc độ phản ứng - 11 - phản (mmol/phút) TốcTốc độ độ phản ứngứng (μmole/phút/mg) từ xác định hoạt độ riêng rLipA hoạt tính Hoạt tính lipase đo bước sóng phát xạ 470 nm hoạt tính gelatinase đo bước sóng phát xạ 535 nm (hình 3.10) 30 25 20 Hình 3.10 Xác định hoạt tính lipase gelatinase rLipA 15 10 0 10 20 30 thời gian (phút) 40 50 Lipase 60 70 Gelatinase Dựa vào tốc độ phản ứng đo sử dụng kit xác định hoạt tính lipase gelatinase, xác định hoạt độ riêng rLipA với DPG (cơ chất lipase) 19814 U/mg hoạt độ riêng rLipA với DQ-gelatin (cơ chất gelatinase) 1245 U/mg Như vậy, hoạt độ riêng rLipA hoạt tính lipase cao gấp khoảng 15 lần so với hoạt độ riêng hoạt tính gelatinase Các kết xác định hoạt tính lipase gelatinase rLipA đĩa thạch kit xác định hoạt tính cho thấy rLipA enzyme đa xúc tác có khả phân cắt liên kết hóa học khác nhau: liên kết ester C=O (của chất DPG) liên kết amide C-N (của chất DQ-gelatin) Hiện tượng enzyme có khả xúc tác cho nhiều phản ứng hóa học liên quan tới đa dạng cấu hình khơng gian trung tâm hoạt động enzyme Sự thay đổi cách linh động vùng trung tâm hoạt động cho phép enzyme có khả liên kết với chất có cấu hình khác Đây quan điểm trung tâm đóng vai trò giải thích chế hoạt động enzyme đa xúc tác Sự ăn khớp cấu hình khơng gian chất enzyme trạng thái chuyển tiếp đóng vai trò định tính đặc hiệu enzyme chất Mặc dù trạng thái chuyển tiếp E-S giống trình - 12 - chuyển điện tử để cơng vào nguyên tử carbon vị trí khác dẫn đến phân cắt kiểu liên kết khác Do vậy, enzyme đa xúc tác thuỷ phân chất khác 3.3.3 Xác định ảnh hưởng nhiệt độ, pH ion kim loại hai hoạt tính lipase gelatinase 30.0 30 25 25.0 37 30 20.0 15.0 25 37 10 45 10.0 60 5.0 45 10 60 0.0 10 20 30 40 50 60 70 Nhiệt độ (oC) Lipase gelatinase Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ hoạt tính lipase gelatinase độĐộ phản (umol/phút) hấp thụ (FU) TốcTốc độ phản ứngứng (μmole/phút/mg) độ ứng phản(μmole/phút/mg) ứng (umol/phút) Tốc độTốc phản Để xác định ảnh hưởng nhiệt độ, pH ion kim loại lên hai hoạt tính enzyme, chúng tơi tiến hành phản ứng E-S điều kiện nhiệt độ, pH ion kim loại khác 35.0 30.0 25.0 20.0 15.0 10.0 5.0 0.0 pH2 pH pH pH pH8 pH10 pH13 lipase gelatinase Hình 3.12 Ảnh hưởng pH hoạt tính lipase gelatinase Tốc độ phản ứng (umol/phút) Tốc độ phản Độứng hấp(μmole/phút/mg) thụ (FU) Kết hình 3.11 3.12 cho thấy hai hoạt tính lipase gelatinase rLipA có nhiệt độ tối ưu 30oC pH tối ưu pH 10 Các hoạt tính bị ức chế mạnh ion Fe++, Co++ Mn++, Ca++ (hình 3.13) Tuy nhiên ion Zn++ lại làm tăng hoạt tính lipase giảm hoạt tính gelatinase Sự khác ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính enzyme chứng tỏ liên kết ion kim loại số gốc axít amin định hoạt tính khơng giống 25.0 Hình 3.13 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính lipase gelatinase 20.0 15.0 10.0 5.0 0.0 Ca++ Fe++ Mn++ Zn++ Co++ C- C+ lipase gelatinase C -: Đối chứng âm (thành phần phản ứng khơng có enzyme) C +: Đối chứng dương (thành phần phản ứng có enzyme khơng có ion kim loại) - 13 - 3.4 Xác định thông số động học Lipase enzyme có khả tham gia nhiều phản ứng xúc tác chuyển hóa nhiều loại chất khác nhau, việc lựa chọn chất tối ưu cho hoạt tính lipase để xác định thông số động học cần thiết Trong nghiên cứu này, sử dụng chất PNPB (C10H11NO4) chất điển hình lipase để xác định thông số động học enzyme 3.4.1 Ảnh hưởng SDS Acetonitrile lên hoạt tính lipase 80000 45000 70000 40000 Hoạt tính lipase (uM/min) Tốc độ phản ứng (μmole/phút/mg) TốcTốc độ phản độ phản ứng (μmole/phút/mg) ứng (um ol/phút) Theo Pouderoyen & đtg, 2001 LipA B subtilis khơng có cấu trúc nắp che phủ trung tâm hoạt động, mà vị trí xúc tác thường nằm bộc lộ bề mặt để liên kết trực tiếp với phân tử chất Tuy nhiên chất lipase lipid thường có xu hướng kết tụ với nhau, khó kết hợp với enzyme Để phản ứng lipase với chất đạt hiệu phản ứng E-S, người ta thường sử dụng SDS chất làm tăng sức căng bề mặt Kết hình 3.14 cho thấy tốc độ phản ứng E-S tăng dần nồng độ SDS từ 100 μM 500 μM nồng độ SDS 500 μM hoạt tính thủy phân chất PNPB thể mạnh Ở nồng độ SDS cao tốc độ phản ứng giảm dần phản ứng E-S bắt đầu bị ức chế 60000 Hoạt tính lipase 50000 40000 30000 20000 10000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 NồngđộđộSDS SDS(µM) (uM) Nồng Hình 3.14 Ảnh hưởng SDS lên hoạt tính lipase 35000 30000 25000 10% AcN 20000 1% AcN 15000 10000 5000 0 200 400 600 800 1000 1200 Nồng độPNPB PNPB (uM) Nồng độ (µM) Hình 3.15 Ảnh hưởng nồng độ AcN lên hoạt tính thủy phân PNPB Ngồi ra, nhân tố khác ảnh hưởng tới phản ứng E-S, khả hòa tan chất PNPB Acetonitrile (AcN) dung - 14 - mơi hữu có khả hòa tan chất lipid, có mặt AcN chất PNPB hòa tan tốt phản ứng E-S hiệu Kết nghiên cứu ảnh hưởng AcN hình 3.15 cho thấy điều kiện phản ứng có 1% AcN tốc độ phản ứng thấp nồng độ PNPB khoảng từ 10-50 µM Điều chứng tỏ PNPB tồn dạng không tan, phản ứng diễn hiệu Tuy nhiên, tăng nồng độ AcN 10% tốc độ phản ứng tăng lên nhanh chóng chất PNPB hòa tan hồn toàn 3.4.2 Xác định phần trăm (%) enzyme hoạt động Để xác định thông số động học enzyme, trước hết cần phải xác định phần trăm số phân tử enzyme thực tham gia vào phản ứng tổng lượng enzyme ban đầu Để xác định thông số này, người ta thường sử dụng phương pháp chuẩn độ enzyme phản ứng liên kết enzyme chất ức chế Chất ức chế ethyl 4methylumbelliferyl heptylphosphonate sử dụng làm chất cho phản ứng chuẩn độ rLipA, Fujii & đtg, 2003 Phản ứng xúc tác thủy phân lipase giải phóng nhóm 4-methylumbelliferone (4 MU) gắn nhóm huỳnh quang tốc độ phản ứng tỷ lệ với nhóm MU đo bước sóng phát xạ 445 nm (hình 3.16) 300 y = 0.01x + 1.2844 R2 = 0.9997 OD 445 thụ (FU) Độ hấp 250 200 150 Hình 3.16 Đồ thị chuẩn dựa vào nồng độ 4MU giải phóng 100 50 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 Nồng độ chất (nM) Dựa vào đồ thị chuẩn hình 3.16, chúng tơi xác định nồng độ nhóm giải phóng MU từ xác định nồng độ enzyme hoạt động khoảng 95% Kết chứng tỏ enzyme - 15 - rLipA hoạt động tương đối hiệu hầu hết phân tử enzyme liên kết với chất ức chế ethyl 4-methylumbelliferyl heptylphosphonate 3.4.3 Xác định giá trị Km, Vmax Các thơng số động học enzyme tính tốn dựa vào tốc độ phản ứng enzyme nồng độ chất PNPB khác Thành phần phản ứng bao gồm Na-PO4 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5 10% AcN 500 μM SDS Sản phẩm tạo thành p-nitrophenol đo bước sóng 405 nm Trong nghiên cứu xây dựng đồ thị theo mơ hình Hanes-Wilkinson để biểu diễn thơng số động học rLipA (hình 3.17) y = 5E-06x + 0.0209 R2 = 0.9828 0.05 Bảng 3.1 Các thông số động học enzyme 0.04 [S]/v 0.03 0.02 - Km -4000 -2000 Vmax (μmole/phút/mg) kcat 4,18 200000 82,5 (s-1) Km/Vmax 0.01 -6000 Km (mM) -0.01 [S] 2000 4000 6000 kcat/Km 19,7 x 103 (M-1.s-1) Hình 3.17 Phương trình động học Hanes-Wilkinson hoạt tính lipase Hằng số Km thể lực enzyme với chất, giá trị Km nhỏ lực enzyme chất lớn Kết bảng 3.1 cho thấy giá trị Km lipase 4,18 mM tương đối thấp, lực rLipA với chất PNPB tương đối lớn Giá trị kcat phản ánh hoạt độ phân tử xác định 82,5/giây Như giây phân tử enzyme có khả thủy phân nhiều 82,5 phân tử chất điều kiện enzyme bão hòa chất Giá trị kcat/Km 19,7 x 103 (M-1.s-1) cho thấy rLipA có tính đặc hiệu cao với chất PNPB 3.5 Gây đột biến điểm trung tâm hoạt động enzyme Trong cấu trúc LipA từ B subtilis có gốc xúc tác trung tâm hoạt động nằm vị trí Ser77, Asp133 His156, Pouderoyen - 16 - & đtg, 2001 Để nghiên cứu vai trò gốc xúc tác ảnh hưởng tới hoạt tính rLipA, chúng tơi tạo đột biến điểm ba gốc axít amin Ser77, Asp133 His156 tiến hành xác định hoạt tính lipase gelatinase đột biến Dựa vào thành phần cấu trúc hóa học axít amin, chúng tơi lựa chọn axít amin Cys (C) thay cho Ser77 (ký hiệu S77C), Asn (N) thay cho Asp133 (ký hiệu D133N) Asn thay cho His156 (ký hiệu H156N) 3.5.1 Tạo đột biến phương pháp Mega-primer Plasmid pET22-lipA sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR tạo Mega-primer Sản phẩm PCR lần tạo Mega-primer H156N, D133N S77C có kích thước tương ứng khoảng 0,3 kb, 0,5 kb 0,6 kb (hình 3.18) Các Mega-primer sử dụng cho phản ứng PCR lần để nhân toàn đoạn gen lipA mang đột biến mong muốn Sản phẩm PCR lần cho băng đặc hiệu kích thước khoảng 0,8 kb, tính tốn theo lý thuyết chứng tỏ toàn gen lipA chứa đột biến nhân lên thành cơng (hình 3.19) 4 0,8 kb 0,6 kb 0,3 kb 0,5 kb Hình 3.18 Kết điện di sản phẩm Mega-primer gel agarose 0,8 % ĐC 1-3: Các Mega-primer S77C, D133N, H156N, ĐC 4: Thang DNA chuẩn Hình 3.19 Kết PCR nhân dòng gen đột biến ĐC 1-3: Các dòng đột biến S77C, D133N, H156N, ĐC 4: Thang DNA chuẩn 3.5.2 Tách dòng biểu đột biến Các gen đột biến tách dòng vào pBluescriptSK(+) biến nạp vào E coli DH5α Một số dòng tái tổ hợp mang gen ngoại lai chọn lọc để xác định trình tự gen Kết đọc trình tự dòng gen lipA đột biến cho thấy có thay đổi mã ba lý thuyết Dựa vào - 17 - phần mềm dịch mã tự động, toàn trình tự axít amin dòng đột biến dịch mã so sánh với trình tự axít amin ban đầu rLipA Kết so sánh trình tự hình 3.20 cho thấy có thay axít amin vị trí S77C, D133N H156N mong muốn Hình 3.20 So sánh trình tự axít amin dòng đột biến với dòng chưa đột biến Sau tách dòng thành cơng đột biến S77C, D133N H156N chuyển gen bị đột biến vào vector pET22b(+) biến nạp vào E coli BL21 (DE3) Quá trình biểu cảm ứng IPTG nồng độ cuối 0,2 mM 28oC Cả dòng đột biến S77C, D133N H156N biểu tốt với băng protein có kích thước khoảng 24 kDa tính tốn lý thuyết (hình 3.21) kDa 117 Hình 3.21 Điện di kết biểu dòng đột biến gel SDS-PAGE 12,6% 85 48 ĐC 1: Thang protein chuẩn, ĐC 2-4: Các dòng đột biến S77C, D133N H156N 34 26 19 24 kDa 3.5.3 Tinh dòng đột biến Các dòng đột biến S77C, D133N H156N tinh phương pháp sắc ký lực Các enzyme đột biến tái tổ hợp có His-tag, có lực với ion Ni2+ cột sắc ký lực Kết hình 3.22 cho thấy có hai dòng đột biến S77C H156N tinh chế có kích thước khoảng 24 kDa (ĐC4, ĐC5), dòng đột biến D133N không thấy xuất băng protein vị trí mong - 18 - muốn (ĐC3), chứng tỏ không thu sản phẩm enzyme tinh kDa 70 Hình 3.22 Điện di kết tinh dòng đột biến gel SDS-PAGE 12,6% ĐC 1: Protein tổng số rLipA, ĐC 2: Thang protein chuẩn, ĐC 3: Tinh dòng đột biến D133N, ĐC 4: Tinh dòng đột biến S77C, ĐC 5: Tinh dòng đột biến H156N 55 40 35 25 24 kDa 15 10 Chúng kiểm tra khả biểu đột biến kết D133N bị biểu dạng không tan, khơng thể tinh enzyme phương pháp thông thường Đột biến thay Asp thành Asn vị trí 133 làm tăng tính kỵ nước enzyme, ảnh hưởng đến khả tan rLipA Hai dòng đột biến S77C H156N sử dụng để xác định hoạt tính enzyme 3.5.4 So sánh hoạt tính lipase rLipA dòng đột biến Tốcđộ độphản phảnứng ứng(µmole/phút/mg) (uM/phút) Tốc Hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân chất PNPB tiến hành tương tự đột biến chọn Kết so sánh hoạt tính dòng S77C H156N với dòng tái tổ hợp (rLipA) cho thấy hoạt tính lipase rLipA cao hẳn so với dòng đột biến (hình 3.23) 50000 45000 40000 35000 Hình 3.23 So sánh hoạt tính lipase dòng tái tổ hợp dòng đột biến 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0.5 1.5 Nồng độ PNPB [S](µM) (uM) 2.5 S77C rLipA 3.5 H156N ĐC (-) Bảng 3.8 Các thông số động học hoạt tính lipase rLipA dòng đột biến Thơng số S77C H156N rLipA Vmax (µmole/phút/mg) 10000 11111,11 200000 Km (mM) 5,55 4,18 - 19 - Các thông số động học xác định tốc độ phản ứng Vmax cho thấy hai đột biến S77C H156N làm giảm hoạt tính lipase khoảng 20 lần (bảng 3.8) Kết chứng tỏ đột biến gốc axít amin trung tâm hoạt động ảnh hưởng lớn đến khả xúc tác enzyme Sự thay đổi gốc xúc tác làm giảm khả tương thích mặt cấu hình khơng gian enzyme chất Theo chế xúc tác lipase, gốc Ser77 liên kết trực tiếp với chất hoạt hóa Khi đó, gốc His156 chuyển proton từ nhóm -OH Ser77 cắt nhóm alcohol khỏi chất Vì vậy, thay đổi nhóm chức gốc xúc tác khả liên kết enzyme với chất bị giảm cách rõ rệt, từ làm giảm hoạt tính xúc tác enzyme 3.5.5 So sánh hoạt tính gelatinase rLipA dòng đột biến Hoạt tính gelatinase dòng đột biến xác định điều kiện so sánh với hoạt tính gelatinase rLipA (hình 3.24) 180000 Hình 3.24 So sánh hoạt tính gelatinase dòng tái tổ hợp dòng đột biến Tốcứng độ (µmole/phút/mg) phản ứng Tốc độ phản rLipA S77C H156N 150000 120000 90000 60000 30000 0 200 400 600 800 1000 1200 Nồng độ DQ-gelatin (µM) [S] Bảng 3.9 Các thơng số động học hoạt tính lipase rLipA dòng đột biến Thơng số S77C H156N rLipA Vmax (µmole/phút/mg) 250000 125000 111111 Km (mM) 0,6 0,637 1,066 Kết bảng 3.9 cho thấy hai đột biến S77C H156N làm tăng hoạt tính gelatinase (giá trị Vmax cao) lực dòng đột biến với chất gelatinase tăng lên (giá trị Km thấp) so với dòng tái tổ hợp Kết phản ánh khả liên kết enzyme với chất gelatin tăng lên, làm tăng hoạt tính thủy - 20 - phân liên kết amide Như vậy, đột biến gốc xúc tác làm thay đổi cấu hình khơng gian tạo nên cấu hình tương thích với chất gelatin, dẫn đến làm tăng hoạt tính gelatinase enzyme Kourist & đtg, 2008 lại cho liên kết hydro tạo vùng anion oxy đóng vai trò quan trọng trì trạng thái chuyển tiếp enzyme liên kết với chất Trạng thái chuyển tiếp LipA chất bền vững liên kết hydro nguyên tử O- tích điện âm gốc Ser77 với hai nhóm -NH axít amin chuỗi bên Ile12 Met78 Dựa mơ hình liên kết E-S từ liệu ngân hàng protein RCSB PDB (1R4Z) xác định vị trí axit amin chuỗi bên Ile12, Met78 hiển thị vùng anion oxy hình thành với gốc xúc tác Ser77 chương trình phần mềm PYMOL (hình 3.25) Hình 3.25 Cấu trúc vùng anion oxy hình thành gốc xúc tác Ser77 axit amin chuỗi bên Ile12 Met78 hiển thị chương trình PYMOL Trung tâm hoạt động bao gồm ba gốc xúc tác Ser77, His156 Asp133 (màu đỏ), chất ức chế Sc-IPG-phosphonate (màu tím), hai gốc axit amin chuỗi bên Ile12 Met78 (màu xanh) Gốc Ser77 liên kết trực tiếp với phân tử chất Đường nối thể khoảng cách tính theo Ao gốc axit amin Từ kết đưa giả thuyết trạng thái hình thành phức E-S rLipA chất gelatin Hoạt tính gelatinase đột biến S77C tăng lên 2,5 lần chứng tỏ trạng thái chuyển tiếp E-S hình thành Thay nhóm OH- Ser77 tham gia liên kết với phân tử chất nhóm SH- Cys tham gia liên kết trực tiếp với phân tử chất gelatin Trong cấu trúc không gian gelatinase vùng xúc tác enzyme bao gồm gốc His gốc Cys tham gia phản ứng phân cắt - 21 - liên kết amide Việc thay gốc Ser77 thành Cys trung tâm hoạt động LipA làm tăng khả liên kết enzyme chất gelatin, dẫn đến làm tăng hoạt tính gelatinase LipA Còn đột biến H156N thay gốc His156 Asp đột biến khơng làm cho hoạt tính gelatinase bị giảm mà hoạt tính tăng lên Điều chứng tỏ có gốc His khác đóng vai trò tương tự gốc His156 hoạt tính gelatinase trình chuyển proton Bằng phương pháp nghiên cứu cấu trúc protein sử dụng chương trình phần mềm PYMOL, chúng tơi xác định vị trí gốc His nằm gần His156 cấu trúc không gian His10, His76 His152 Các gốc His cách His156 khoảng từ 9-12 Ao Ngoài ra, gốc His3 nằm xa His156, gốc His3 tham gia vào phản ứng tạo phức liên kết E-S Để xác định gốc His ảnh hưởng lên hoạt tính gelatinase phải tiến hành nghiên cứu tạo đột biến gốc His xác định hoạt tính gelatinase dòng đột biến Từ đưa sở khoa học để giải thích sâu chế hình thành liên kết E-S rLipA với chất gelatin 3.6 Lên men chủng E coli BL21-lipA tái tổ hợp 3.6.1 Lên men chủng E coli BL21-lipA hệ thống lên men Chủng E coli BL21-lipA nuôi cấy loại môi trường khác môi trường giàu, môi trường affibody, môi trường LB môi trường GE Kết lên men cho thấy mơi trường LB mơi trường thích hợp để lên men chủng E coli BL21-lipA Ngoài ra, chủng E coli BL21-lipA lên men hệ thống lên men có dung tích khác lít, 10 lít 200 lít Các thơng số hệ thống lên men nghiên cứu nồng độ oxy hoà tan 30%, nồng độ glucose bổ sung g/l, pH 7,0, tốc độ khuấy 200-250 v/p nhiệt độ sinh trưởng cho chủng E coli tái tổ hợp 37oC Quá trình sinh tổng hợp lipase tái tổ hợp cảm ứng IPTG nồng độ cuối - 22 - 0,2 mM, nhiệt độ cảm ứng 28oC sau nuôi cấy M 70 kDa 55 45 35 26 rLipA 15 10 Hình 3.26 Điện di protein rLipA biểu sau lên men gel polyacrylamide gradient nồng độ 8-25% ĐC 1: Protein rLipA biểu hệ thống lên men lít ĐC 2: Protein rLipA biểu hệ thống lên men 10 lít ĐC 3: Protein rLipA biểu hệ thống lên men 200 lít ĐC M: Thang protein chuẩn Kết hình 3.26 cho thấy có xuất băng protein khoảng 24 kDa với kích thước rLipA, chứng tỏ protein tái tổ hợp biểu thành công hệ thống lên men dung tích khác Bảng 3.10 Kết lên men chủng E coli BL21-lipA hệ thống lên men Thể tích bình lên men (lít) OD thu mẫu Sinh khối tế bào ướt (g/l) Protein tổng số (g/l) Protein tái tổ hợp (g/l) Hiệu suất tổng hợp protein (%) 13,90 20,00 5,00 0,68 13,6 10 13,50 18,75 4,69 0,57 12,1 200 13,32 18,66 4,67 0,66 14,1 Kết lên men chủng E coli BL21-lipA bảng 3.10 cho thấy sinh khối tổng hợp hệ thống lên men đạt gần tương đương khoảng từ 18 - 20 (g/l) Hiệu suất tổng hợp protein tái tổ hợp hệ thống lên men tính tốn khoảng 12 14% so với protein tổng số Protein tái tổ hợp tạo thành khoảng 570 - 680 (mg/l) Đây kết khả quan cho thấy chủng E coli BL21-lipA phát triển tương đối tốt đồng hệ thống lên men khác 3.6.2 Nghiên cứu trình lên men chủng E coli BL21-lipA phương pháp lên men fed-batch HCDC Ngoài việc khảo sát nghiên cứu lên men rLipA hệ thống lên men, người ta sử dụng phương pháp fed-batch HCDC để làm tăng sinh khối tế bào lên gấp nhiều lần mà khơng cần phải lên men với dung tích lớn Đa số protein tái tổ hợp tổng - 23 - hợp tế bào E coli BL21 tích lũy dạng nội bào, hiệu suất tổng hợp protein tái tổ hợp tỉ lệ với sinh khối tế bào sau lên men Trong phương pháp lên men fed-batch, glucose nguồn chất bổ sung liên tục vi sinh vật phát triển ổn định Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp lên men fed-batch HCDC để làm tăng sinh khối E coli BL21-lipA thu nhận lượng lớn enzyme tái tổ hợp rLipA Quá trình lên men chủng tái tổ hợp E coli BL21-lipA sau 18 nuôi cấy cho thấy giá trị OD600 đo mật độ tế bào lên tới 143 mơi trường LB (hình 3.27) Protein rLipA tổng hợp đạt khoảng mg/ml gấp 10 lần so với phương pháp lên men thơng thường logOD600 OD 600 1000 Hình 3.27 Đường cong sinh trưởng chủng E coli BL21-lipA bổ sung glucose theo phương pháp HCDC 100 10 1 10 13 16 thời gian (giờ) Protein tái tổ hợp sau lên men tinh thành công phương pháp sắc ký lực Kết mở triển vọng để tổng hợp lượng lớn lipase tái tổ hợp ứng dụng vào số ngành sản xuất công nghiệp Việt Nam KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã sàng lọc dòng tái tổ hợp chứa đoạn DNA dài khoảng 3,3 kb từ ngân hàng DNA hệ gen B subtilis FS2 có hoạt tính gelatinase Kết phân tích đoạn DNA 3,3 kb cho thấy khung đọc lipA mã hóa cho hoạt tính lipase đồng thời định cho hoạt tính gelatinase Gen lipA tách dòng biểu E - 24 - coli BL21 (DE3) Protein rLipA tinh thành công Cả hai hoạt tính lipase gelatinase rLipA tối ưu pH 10, nhiệt độ 30oC bị ức chế ion Fe++, Co++, Mn++ Ca++ Tuy nhiên, ion Zn++ lại làm tăng hoạt tính lipase giảm hoạt tính gelatinase Đã xác định thơng số động học Km, Vmax hoạt tính lipase gelatinase rLipA Đã thiết kế thành công đột biến điểm S77C, D133N H156N phương pháp Mega-primer tinh thành công hai đột biến S77C H156N Cả hai đột biến S77C H156N làm giảm hoạt tính lipase lại làm tăng hoạt tính gelatinase, chứng tỏ hai gốc Ser77 His156 có vai trò quan trọng hoạt tính lipase gelatinase rLipA Các đột biến làm thay đổi cấu hình khơng gian trung tâm hoạt động để phù hợp với chất gelatin phản ứng E-S Đã sử dụng chương trình phần mềm PYMOL để nghiên cứu cấu trúc rLipA dựa sở liệu ngân hàng protein RCSB PDB Kết nghiên cứu lên men cho thấy tìm quy trình cơng nghệ lên men phù hợp để tổng hợp lipase tái tổ hợp từ tế bào E coli BL21-lipA hệ thống lên men lít, 10 lít 200 lít Hiệu suất tổng hợp protein rLipA phương pháp lên men fedbatch HCDC tăng gấp 10 lần so với phương pháp lên men thông thường Kết mở triển vọng ứng dụng rLipA tái tổ hợp vào sản xuất công nghiệp Việt Nam Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu xác định số gốc axít amin quan trọng ảnh hưởng tới hoạt tính gelatinase rLipA phương pháp tạo đột biến điểm tạo đột biến ngẫu nhiên để làm tăng hoạt tính gelatinase Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng rLipA tái tổ hợp vào số ngành công nghiệp sản xuất Việt Nam ... Việt Nam, phát lipase A (LipA) ngồi hoạt tính lipase có hoạt tính thứ hai hoạt tính gelatinase LipA bên cạnh khả thủy phân chất lipase tributyrin enzyme thủy phân chất gelatinase collagen biến tính. .. phát từ nhu cầu ứng dụng enzyme thực tiễn từ đặc điểm LipA, tiến hành đề tài Phân lập nghiên cứu tính chất lipase A tái tổ hợp có hai hoạt tính lipase - gelatinase từ B subtilis FS2 Mục đích nghiên. .. nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm tính chất LipA tái tổ hợp (rLipA) từ B subtilis FS2 có hai hoạt tính lipase gelatinase Xác định ảnh hưởng gốc axít amin trung tâm hoạt động lên hai hoạt tính rLipA Nội