Tóm tắt luận án tiến sĩ sinh học phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương việt nam

B GIÁO D C VÀ ÀO T O I H C THÁI NGUYÊN NGUY N TH THÚY HƯ NG PHÂN L P, T O LIÊN QUAN T BI N I M GEN P5CS N TÍNH CH U H N VÀ TH NGHI M CHUY N VÀO CÂY U TƯƠNG VI T NAM Chuyên ngành: Di truy n h c Mã s : 62.42.70.01 TÓM T T LU N ÁN TI N S SINH H C THÁI NGUYÊN - 2011 CÁC CƠNG TRÌNH C A TÁC GI Ã CƠNG B LIÊN QUAN N LU N ÁN Nguy n Th Thuý Hư ng, Chu Hoàng M u, Hà T n Th , inh Th Kim Phương, Tr n Th Trư ng (2006), “Sưu t p, phân lo i ánh giá ch t lư ng h t c a m t s gi ng u tương a phương t i t nh Sơn La”, T p chí Nơng nghi p phát tri n Nông thôn, s 11 kỳ I tháng 6/2006 28-32 Chu Hoàng M u, Nguy n Th Thuý Hư ng (2006), “Thành ph n axit amin kh ch u h n c a m t s gi ng u tương a phương c a t nh Sơn La”, T p chí Nơng nghi p phát tri n Nơng thơn, s 20 kì II tháng 10/2006 2226 Nguy n Th Thúy Hư ng, Chu Hoàng M u, Lê Văn Sơn, Nguy n H u Cư ng, Lê Tr n Bình, Chu Hồng Hà (2008), " ánh giá kh ch u h n phân l p gen P5CS c a m t s gi ng u tương (Glycine max L.Merrili)", T p chí công ngh sinh h c, 6(4): 459-466 Nguy n Th Thúy Hư ng, Tr n Th Ng c Di p, Nguy n Thu Hi n, Chu Hoàng M u, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), "Phát tri n h th ng tái sinh invitro u tương (Glycine max L.Merrili) ph c v chuy n gen", T p chí khoa h c cơng ngh i h c Thái Nguyên 52 (4): 82-88 Nguy n Th Thúy Hư ng, Chu Hoàng M u, Lê Văn Sơn, Nguy n H u Cư ng, Lê Tr n Bình, Chu Hồng Hà (2009), "T o gen mã hóa Enzym P5CS (Pyroline - - carboxylate synthase) mang t bi n lo i b hi u ng c ch ph n h i b ng k thu t PCR" H i ngh cơng ngh sinh h c tồn qu c năm 2009: 191 - 193 Nguy n Th Thuý Hư ng, Chu Hoàng M u, Lê Văn Sơn, Nguy n H u Cư ng, Chu Hoàng Hà (2010), "Tách dòng ánh giá ho t ng c a promoter c m ng khô h n rd29A t Arabidopsis thaliana", T p chí Cơng ngh sinh h c 8(4): 1805-1810 Nguy n Th Thuý Hư ng, Chu Hoàng M u, Lê Văn Sơn, Nguy n H u Cư ng, Chu Hoàng Hà (2010), "T o thu c chuy n gen P5CS t bi n lo i b hi u ng ph n h i ngư c, làm tăng hàm lư ng protein kh ch ng ch u khơ h n H i ngh tồn qu c v khoa h c s s ng Bio-Hà N i 2010", T p chí cơng ngh sinh h c, (3A): 539-544 Chu Hoang Mau, Nguyen thi Thuy Huong, Nguyen Tuan Anh, Chu Hoang Lan, Le van Son, Chu Hoang Ha ( 2010) Characteristic of the gene encoding pyrroline - - carboxylate synthase (P5CS) in Vietnamese sobean cultivar (Glycine max L.Merrill) 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010) IEEE: 319-323 M U tv n Cây u tương (Glycine max (L.) Merrill) m t nh ng tr ng quan tr ng khơng ch Vi t Nam mà cịn i v i nhi u qu c gia th gi i Tình tr ng h n hán nh hư ng t i tình hình s n xu t u tương khơng ch Vi t Nam mà c nh ng nư c s n xu t u tương hàng u th gi i u tương tr ng thu c nhóm có kh ch u h n Vi t Nam, nhi u gi ng u tương có kh ch ng ch u h n ã c ch n t o thành công ang c tri n khai canh tác m t s a phương Tuy nhiên phương pháp ch n gi ng truy n th ng t n nhi u th i gian, ph c t p c n ph i có qu n th l n không n nh Nh ng c i m c a phương pháp truy n th ng có th kh c ph c b ng vi c áp d ng k thu t m i c a công ngh sinh h c K thu t chuy n gen th c v t thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens ã c nhà khoa h c th gi i ng d ng t c nh ng k t qu r t có tri n v ng u tương Vi t Nam, nhóm nghiên c u c a Tr n Th Cúc Hòa t i Vi n Nghiên c u lúa ng b ng Sông C u Long ã thành công vi c t o gi ng u tương m i mang tính kháng sâu b nh, nhiên cho n cơng trình nghiên c u v chuy n gen ch u h n vào u tương v n chưa c quan tâm úng m c Xu t phát t nh ng lý ti n hành tài lu n án ti n sĩ là: “Phân l p, t o t bi n i m gen P5CS liên quan n tính ch u h n th nghi m chuy n vào Vi t Nam” u tương M c tiêu nghiên c u 2.1 So sánh trình t gen mã hóa P5CS c a gi ng a phương thu c nhóm ch u h n t t ch u h n T o c t bi n lo i b hi u ng c ch ph n h i b i prolin 2.2 T o c vector chuy n gen mang c u trúc liên quan n tính ch u h n u tương 2.3 T o u tương mang c u trúc gen liên quan n c tính ch u h n 3 N i dung nghiên c u 3.1 Phân tích c i m sinh lý, hóa sinh c a m t s gi ng u tương tr ng t i khu v c mi n B c 3.2 Phân l p xác nh trình t gen mã hóa enzyme 1-pyrroline-5 carboxylate synthetase (P5CS) 3.3 T o t bi n lo i b hi u ng c ch ph n h i (feedback inhibition) b i prolin b ng phương pháp t o t bi n i m 3.4 Phân l p promoter c m ng dư i i u ki n khô h n rd29A t Arabidopsis thaliana Phân tích ho t ng c a promoter d a vào ho t ng c a gen GUS dòng thu c chuy n gen 3.5 Thi t k c u trúc mang gen P5CS t bi n c promoter rd29A chuy n c u trúc vào thu c i u n b i 3.6 Phân tích ch tiêu hóa sinh kh ch ng ch u c a dòng thu c i u ki n gây h n nhân t o 3.7 Bi n n p c u trúc mang gen P5CS vào u tương thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens Phân tích s có m t c a gen bi n n p Nh ng óng góp m i c a lu n án 4.1 Gen P5CS c phân l p c trình t t hai gi ng u tương Vi t Nam (DT84 SL5), có kích thư c 2148 nucleotit, mã hóa 715 axit amin 4.2 ã t o t bi n i m nh hư ng b ba có v trí th 125 c a gen P5CS c a gi ng SL5, thay th Asp b ng Ala trình t protein, lo i b hi u ng c ch ph n h i (feedback inhibition) 4.3 Promoter rd29A ã c phân l p thành cơng t A.thaliana, có kích thư c 1298bp mang trình t c trưng g m nhân t cis thu c nhóm MYB, DRE, AMYBOX nhân t c trưng c a promoter nhân t c m ng i u ki n khô h n 4.4 Thi t k thành công c u trúc c a promtor rd29A :: GUS c u trúc rd29A::P5CSM Các c u trúc ã c ánh giá thu c i u ki n h n 4.5 T i ưu c quy trình tái sinh chuy n gen thông qua mô nách m m u tương Bư c u chuy n thành công c u trúc gen rd29A::P5CSM vào gi ng u tương DT84 thu dương tính PCR i v i gen chuy n c m t s dòng Ý nghĩa khoa h c th c ti n 5.1 V khoa h c, lu n án cơng trình Vi t Nam ã ánh giá c kh ch ng ch u h n c a gi ng u tương i u ki n gây h n nhân t o, phân l p thay i c u trúc gen P5CS d a vào phương pháp gây t bi n có nh hư ng b ng ph n ng PCR Các k t qu phân tích gen P5CS kh ng nh r ng s khác v kh ch u h n c a gi ng u tương khác nhi u y u t quy nh, nhiên ho t ng c a gen P5CS gi vai trò quan tr ng i v i tính ch u h n tr ng 5.2 V th c ti n, nh ng k t qu ánh giá ho t ng c a c u trúc chuy n gen mang promoter rd29A i u n ho t ng c a gen P5CS ã b gây t bi n lo i b hi u ng ph n h i b i prolin thu c ã kh ng nh ý nghĩa th c ti n c a lu n văn Kh ch ng ch u c c i thi n rõ r t dòng thu c chuy n gen mang c u trúc m b o tính kh thi c a vi c ng d ng c y trúc chuy n gen i tư ng tr ng khác nh m c i thi n m t nh ng tính tr ng r t quan tr ng ch ng ch u h n K t qu ban u vi c thi t l p quy trình chuy n gen u tương s ti n quan tr ng ti n trình t o gi ng u tương m i có tính ch u h n cao C u trúc c a lu n án Lu n án g m 113 trang, c chia thành ph n: Ph n M u g m có trang; Chương 1: T ng quan tài li u, 34 trang; Chương 2: V t li u Phương pháp, 15 trang; Chương 3: K t qu Th o lu n, 46 trang; Phân K t lu n ngh : trang; Các cơng trình ã cơng b c a tác gi : trang Tài li u tham kh o: 11 trang; Lu n án có 29 b ng s li u, 43 hình 108 tài li u tham kh o b ng ti ng Vi t ti ng Anh Chương T NG QUAN TÀI LI U Lu n án ã tham kh o t ng k t 64 tài li u, ó có 10 tài li u ti ng vi t, 51 tài li u ti ng Anh a ch trang web v v n liên quan, : (1) Gi i thi u v b n u tương (Glycine max (L.) Merill), giá tr kinh t giá tr s d ng c a sinh c a c tính ch ng ch u h n c a u tương; (2) Cơ s sinh lý, hóa u tương; (3) Prolin vai trò c a enzym P5CS ng sinh t ng h p prolin; (4) Promoter vai trò i u n ho t ng c a gen i u ki n h n; (5) Nh ng nghiên c u nâng cao kh ch u h n c a u tương Prolin c bi t n m t nh ng ch t óng vai trị quan tr ng q trình i u ch nh áp su t th m th u th th c v t s ng i u ki n b t l i h n, m n (Delauney and Verma, 1993) Tác d ng b o v c u trúc n i bào i phân t t bào g p i u ki n b t l i v áp su t th m th u; b o v c u trúc protein nâng cao ho t tính c a nhi u lo i enzyme khác nhau; ch ng oxy hóa v i ch c phân c t g c oxy ph n ng (reactive oxygen residues) b t ho t g c oxy t (singlet oxygen quencher) (Szavados tg, 2009) th c v t, trình sinh t ng h p prolin c ki m soát b i ho t tính c a hai gen mã hóa cho enzym P5CS Hai gen có tương ng r t cao v trình t mã hóa bi u hi n l i r t khác nh ng i u ki n khác C hai gen P5CS u ho t ng mô phân sinh c a hoa, ch y u cung c p prolin cho trình phát tri n c a hoa (Mattioli tg, 2009) Nghiên c u Arabidopsis nhà khoa h c ã ch ng minh c m i quan h ch t ch gi a ho t ng c a enzme P5CS s tích lũy prolin i u ki n b x lý m n; hi u ng c ch ngư c c a prolin t i ho t tính c a P5CS b nh hư ng i u ki n b t l i Khi chuy n gen P5CS ã b gây t bi n lo i b hi u ng c ch ngư c b i prolin vào thu c nhà khoa h c ã nh n r ng dòng thu c chuy n gen tăng cư ng tích lũy prolin nhi u g p l n so v i dòng thu c c chuy n gen P5CS ki u d i G n ây, gen P5CS phân l p thành công t lúa c chuy n tr l i lúa nh m tăng cư ng ho t ng c a gen nhà khoa h c ã nh n th y r ng tính ch u m n ch u l nh c c i thi n rõ r t Promoter rd29A m t trình t b c m ng bi u hi n dư i i u ki n b t l i khô h n, m n, l nh ã c nhi u nhà khoa h c quan tâm M t s nghiên c u ã phát hi n c trình t promoter rd29A ch a vùng có ho t tính cis vùng c m ng ABA (ABRE) vùng c m ng m t nư c (DRE)/C repeat (CRT) C vùng u liên quan n s bi u hi n gen bi u hi n dư i i u ki n b t l i c a môi trư ng (Yamaguchi-Shinozaki Shinozaki, 1993) Nhi u phịng thí nghi m th gi i ã phân l p ki m tra ho t ng c a promoter rd29A nhi u loài A thaliana, thu c lúa mì (Sun Chen, 2002) C u trúc promoter RD29A i u n gen ch th GUS c chuy n vào khoai tây, mía Ho t tính c a GUS u c phát hi n chuy n gen dư i i u ki n b t l i c a môi trư ng nuôi c y (Zhang et al., 2005) Có nhi u bi n pháp c i thi n kh ch u h n c a tr ng, nh ng hi n áp d ng k thu t chuy n gen nh m tăng cư ng kh ch u h n c a th c v t ang c quan tâm nghiên c u Có th nh n nh r ng tính kh thi ti m ng d ng phương pháp chuy n gen th c v t bi n pháp nâng cao kh ch u h n c a u tương t i Vi t Nam r t cao Chương V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 V t li u, hóa ch t, thi t b V t li u th c v t: 16 gi ng a phương DT84; gi ng thu c 326 (Nicotiana tabacum), Arabidopsis thaliana Hóa ch t nghiên c u: Vector tách dòng pBT, vector pBI101 dùng m c ích thi t k vector chuy n gen, vector pTN 289 dùng c p m i dùng chuy n gen Các nhân b n gen P5CS promoter RD29A c thi t k d a trình t gen P5CS promoter RD29A ăng kí GeneBank v i mã s : AY492005, AB428730 Các lo i hóa ch t dùng cho thí nghi m nuôi c y mô sinh h c phân t c mua t hãng hóa ch t: Merk, Bioneer, Fermentas Phịng Cơng ngh t bào th c v t, Vi n Công ngh sinh h c cung c p 2.2 Phương pháp nghiên c u 2.2.1 Phương pháp sinh lý, hố sinh Bình ánh giá nhanh kh ch u h n theo phương pháp c a Lê Tr n ng tác gi năm 1998 - nh lư ng protein tan c th c hi n theo phương pháp Lowry nh lư ng lipit c mô t tài li u c a Ph m Th Trân Châu Hàm lư ng thành ph n axit amin h t theo Ph m Văn Chi tg (1997) - Hàm lư ng prolin c xác nh b ng phương pháp Bates tg (1973) - Phương pháp tính tốn x lý s li u theo Nguy n H i Tu t Ngô Kim Khôi (1996) 2.2.2 Các phương pháp s d ng nuôi c y in vitro Các phương pháp s d ng nuôi c y in vitro theo Topping ,1988 i v i cây Arabidopsis, thu c u tương tái sinh qua a ch i t nách m m h t chín quy trình chuy n gen vào nách m m h t chín c ti n hành d a phương pháp c a Olhoft tg (2001) có c i ti n 2.2.3 Phương pháp sinh h c phân t Thi t k m i d a vào trình t ã cơng b GenBank Quy trình tách chi t DNA t ng s ( i v i Arabidopsic thu c lá) Phương pháp tách chi t RNA t ng s : S d ng b kit Trizol Regents (c a hãng Invitrogen) tách chi t RNA t ng s t m u u tương theo ch d n c a nhà s n xu t Phương pháp tách chi t, tinh s ch DNA RNA - Phương pháp t ng h p cDNA RNA t ng s c s d ng nhân gen b ng phương pháp t ng h p cDNA, cDNA c t ng h p theo quy trình RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) - Ph n ng PCR Chu trình nhi t c a ph n ng PCR: Gen P5CS c khu ch i b ng k thu t PCR v i c p m i c hi u theo chu trình nhi t sau: 94ºC/5 phút;: 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 35 chu kì Ti n hành ph n ng PCR v i nhi t 620C) tìm nhi t g nm i khác (t 50 - c hi u - Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention) Chu trình nhi t c a ph n ng PCR: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, chu kì Sau chu kỳ l y s n ph m t vào b sung 1µl BamHI 1µl SaclI th c hi n ti p ph n ng theo chu trình nhi t sau: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 30 chu kì - Phương pháp tách dịng: Tách chi t plasmid tái t h p c th c hi n theo Sambrook tg (2001) tinh s ch b ng Plasmid Miniprep Kit (Qiagen) Phương pháp s d ng enzym c t h n ch th c hi n theo Sambrook tg (2001) - Phương pháp PCR tr c ti p t khu n l c (colony-PCR) - Thi t k c u trúc rd29A :: GUS rd29A :: P5CSM - Các phương pháp phân tích bi n n p Ki m tra s có m t c a gen chuy n b ng phương pháp hóa sinh Cây thu c chuy n gen sau s ng nhà kính c x lý h n nhân t o b ng PEG (Jun tg 20001) Hàm lư ng enzym Gus ti p t c c xác nh b ng phương pháp c a Tefferson tg (1987) Chương K T QU VÀ TH O LU N 3.1 K t qu sưu t p ánh giá gi ng u tương a phương c a t nh Sơn La 3.1.1 c i m hình thái, hóa sinh c a h t u tương a phương huy n u tương Phát hi n 16 gi ng 11 huy n th khác c a t nh Sơn La Hàm lư ng protein c a gi ng dao ng kho ng 29,72%-52,75% protein/kh i lư ng khô Hàm lư ng lipit dao ng t 9,9% - 18,65% Gi ng DT84 cho hàm lư ng lipit cao nh t 18,65%, n SL3 (17,34%) 3.1.2 K t qu nghiên c u ánh giá kh ch u h n c a gi ng u tương i v i gi ng SL5 hàm lư ng prolin tăng cao nh t sau gây h n c ngày (tăng 377,44%) Gi ng DT84 có t l tăng hàm lư ng prolin c ba th i i m u th p nh t (101,06; 129,26 146,81%) K t qu nghiên c u phù h p v i nghiên c u c a tác gi loài tr ng khác lúa (Nguy n H u Cư ng tg), (Do tg ), (Choudhary tg 2005), h u (Curtis tg 2004), (Chen tg 2009) 3.2 Phân l p gen P5CS t bi n i m lo i b c ch ngư c 3.2.1 K t qu phân l p gen P5CS 3.2.2 K t qu khu ch RNA t ng s i, tách dòng xác nh trình t gen P5CS ã c tách chi t t ng h p cDNA t SL5 DT84 B n o n gen P5CS c nhân lên b ng PCR c ki m tra b ng i n di gel agarose 0,8% K t qu hình 3.3 cho th y, o n thu c có kích thư c tương ng v i kích thư c tính tốn theo lý thuy t thu c gen P5CS hoàn ch nh, hai s n ph m PCR c tr n l n c s d ng làm khuôn cho ph n ng PCR v i c p m i P5CSfor/P5CSrev theo phương pháp OE-PCR S n ph m PCR thu c có kích thư c kho ng 2100 bp ( Hình 3.4) M M 4 2100bp 1500bp 1000bp Hình 3.3 K t qu nhân hai o n gen P5CS t gi ng u tương DT84 SL5 1, 3: gi ng DT84; 2, 4: gi ng SL5; M: Thang DNA chu n kb K t qu Hình 3.4 K t qu PCR ghép n i hai o n gen P5CS t gi ng u tương DT84 SL5 1, 3: gi ng DT84; 2, 4: gi ng SL5; M: Thang DNA chu n kb c trình t gen cho th y, s n ph m gen tách dòng t m u nghiên c u có kích thư c 2148 nucleotide, mã hoá 715 axit amin 128 c a P5CS c ba gi ng s c ch ho t v trí 125 u axit amin Asp Phe ây hai v trí gây ng c a enzym P5CS tăng hàm lư ng c a prolin t bào (Zhang tg 1995), (Hong tg 2000) 3.2.3 T o t bi n i m lo i b hi u ng c ch ngư c l p t P5CS phân u tương K t qu hình 3.10 cho th y, o n thu c có kích thư c tương ng v i kích thư c tính tốn theo lý thuy t S n ph m OE-PCR thu c có kích thư c kho ng 2100bp (hình 3.11) Kích thư c tương ng v i kích thư c c a gen P5CS g c M M A B 2100bp 1800bp 400bp Hình 3.10 i n di s n ph m PCR V i c p m i P5CS M125for2/SacI-P5C; V i c p m i P5CS for / P5CS rev ; M : Thang DNA chu n kb Nhưng c Hình 3.11 Ph n ng n i hai o n gen theo phương pháp OE-PCR v i c p m i BamHI-P5CS Sacl P5CS A, B : 1+2, M:thang DNA chu n kb bi t xác gen có t o c c trình t gen K t qu 310 320 t bi n i m hay không c n ph i c th hi n 330 340 hình 3.13 350 360 370 380 | | | | | | | | | | | | | | | | MSL5 AACAGCCTTATGGCTCTTTATGATGTTTTGTTTAGTCAGCTGGATGTGACATCTGCTCAGCTTCTTGTGACGGCCAATGA N SL5 S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T A N D A N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L Hình 3.13 Phân tích, so sánh trình t nucleotit phát hi n V T D N D t bi n t i v trí nucleotit 374 c a gen P5CS Trình t gen mã hố cho protein P5CS c a trình t chúng tơi nh n th y nucleotit A u tương, qua k t qu c v trí 374 c a mã b ba GAC c thay th b ng nucleotit C c a mã b ba GCC tương ng trình t protein axit amin v trí 125 Asp c thay b ng Ala 3.3 Phân l p ki m tra ho t ng c a promotor rd29A c m ng khô h n 3.3.1 Phân l p promoter rd29A Trên s trình t gen rd29A ã cơng b ngân hàng gen th gi i, c p m i rd29A -HindIII / rd29A -BamHI ã c thi t k có trình t b ng 3.7 C p m i s tách c promoter có kích thư c 1290 bp, n m trư c codon m u c a gen ch c rd29A B ng k thu t PCR, promoter rd29A ã c phân l p t A thaliana s d ng c p m i c hi u S n ph m c ki m tra gel agarose cho th y có m t băng nh t v i kích thư c kho ng 1300 bp, tương ương kích thư c tính tốn theo lý thuy t Hình 3.15 i n di s n ph m PCR c t h n ch vector pBT/ rd29A M) Marker; 1) s n ph m PCR; 2) s n ph m c t b ng BamHI/HindIII S n ph m PCR c g n vào vector tách dòng pBT c bi n n p vào E coli DH5α K t qu ch n dòng b ng colony-PCR c t plasmid b ng enzym h n ch BamHI/HindIII cho th y s n ph m có kích thư c tương ương kích thư c ã tính tốn theo lý thuy t (hình 3.15) Như v y s n ph m PCR ã c ghép n i thành cơng vào vector tách dịng pBT 10 3.3.2 Phân tích trình t promoter rd29A bi t xác s n ph m PCR ã ti n hành c trình t nucleotide K t qu thu c so sánh v i trình t gen Ngân hàng gen cho th y s n ph m promoter rd29A c a A.thaliana Khi phân tích trình t thu c cho th y promoter phân l p có chi u dài 1290 bp, ch a box trình t c n thi t cho promoter i u hòa bi u hi n gen TATA; CCAAT box- vùng giàu GC (GGGCCAATAG), Cap signal vùng liên quan qu trình phiên mã (-10 -35) Ngồi ch a vùng liên quan n c m ng i u ki n khô h n DRE, ABRE (hình 3.16) K t qu phù h p v i công b c a Wu tg (2008) Shinozaki tg (2007) Sau ã tách dòng xác ph n m m chuyên d ng nh trình t promoter rd29A s d ng phân tích trình t o n promoter ã tách dòng c K t qu nh n th y r ng o n trình t promoter rd29A phân l p nghiên c u có ch a nhân t cis thu c nhóm MYB, DRE, AMYBOX Các nhân t cis ã c kh ng nh c hi u cho promoter i u n bi u hi n c a gen dư i i u ki n b t l i h n, m t nư c m n ã phân l p thành công promoter rd29A, o n gen dài 1290bp ch a nhân t cis c hi u, s d ng o n gen thi t k vector phân tích trình bi u hi n c a promoter dư i i u ki n h n gaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaac -10 agccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccga CCAAT box vùng giàu GC ctactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcaTACCGACATcag DRE-1 ttttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatacTACCGACATg -35 DRE-2 agttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacg cttcatACGTGTCcctttatctct ABRE ctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcacaaatatgca Cap signal TATA box aactagaaaacaatcatcaggaataaagggtttgattacttctattgga Hình 3.16 Phân tích trình t promoter rd29A 11 3.3.3 Thi t k vector chuy n gen mang c u trúc rd29A ki m tra kh i u n c a promoter thu c, promoter rd29A c thi t k vào vector pBI101 i u n s bi u hi n gen ch th GUS K t qu ki m tra b ng PCR c t b ng enzym h n ch BamHI/SacI cho th y vector tái t h p thu c ch a o n promoter rd29A (hình 3.18) có kích thư c mong mu n Hình 3.18 i n di s n ph m PCR c t h n ch vector pBI101/ rd29A M) Marker; 1-2) s n ph m PCR; 3-4) s n ph m c t b ng BamHI/SacI Vector tái t h p thu c bi n n p vào ch ng vi khu n Agrobacterium C58, ây s nguyên li u cho chuy n gen vào th c v t, ánh giá kh i u n c a promoter b ng m c bi u hi n GUS dư i i u ki n x lý h n 3.3.4 T o thu c chuy n gen mang c u trúc rd29A :: GUS M nh thu c môi M nh ngâm M nh môi trư ng c m ng GM sau d ch huy n trư ng c ng sinh ngày phù vi khu n sau ngày 12 M nh môi trư ng GM + 50 mg/l Kanamycine + 400 mg/l Cefotaxime sau tháng C m ch i Cây môi môi trư ng GM + trư ng RM + 50 50 mg/l mg/l Kanamycine + Kanamycine + 400 400 mg/l mg/l Cefotaxime sau Cefotaxime tháng sau tháng Ra b u tr u: cát Trong b u t Ra nhà lư i Hình 3.19 Hình nh chuy n c u trúc promotor rd29A vào thu c ánh giá ho t ng c a promtor RD29A thu c chuy n gen K t qu thu c 51 dịng thu c tái sinh mơi trư ng ch a kanamycin Ki m tra 22 dòng b ng ph n ng PCR v i c p m i c hi u rd29A -HindIII/ rd29A -BamHI cho th y có 21 dịng mang gen chuy n rd29A ánh giá ho t ng i u n s bi u hi n gen GUS c a promoter rd29A, chúng tơi ch n ng u nhiên dịng dương tính v i PCR ti n hành x lý h n nhân t o b ng 10% PEG (polyethylene glycol) K t qu cho th y dư i i u ki n thi u nư c bi u hi n GUS dòng thu c chuy n gen m nh rõ ràng so v i dịng chuy n gen khơng x lý ch ng (hình 3.20) 13 i 800 Lư ng M U (p m o l/m in m g) 700 600 500 400 300 200 100 DCT DCS 3T 3S 4T 4S 5T 5S M u Hình 3.20 Bi u hi n gen GUS chuy n gen A: Cây i ch ng khơng chuy n gen có x lý h n; B: Cây chuy n gen không x lý h n; C: Cây chuy n gen sau x lý h n 24 gi Hình 3.21 Ho t tính c a enzym GUS dịng thu c chuy n gen mang promoter rd29A i u ki n h n nhân t o C: m u i ch ng không chuy n gen; 3, 4, 5: dòng chuy n gen, T: trư c x lý h n, S: sau x lý h n Ho t tính c a enzym GUS cịn c xác nh thông qua ph n ng chuy n hóa ch t (MUG) Enzym GUS xúc tác cho ph n ng chuy n hóa MUG thành MU, ho t tính c a gen enzym GUS m nh MU c t o nhi u MU c phát hi n b ng phép o h p th bư c sóng 378 nm ( Fior tg 2009) Lư ng MU o c sau x lý h n cao so v i trư c x lý h n t - 13 l n ( hình 3.21) Nh ng s li u hồn tồn th ng nh t v i cơng b c a (Zhang tg 2005) 3.4 ánh giá kh tăng cư ng kh ch u h n c a thu c chuy n gen mang c u trúc rd29A:: P5CSM 3.4.1 Thi t k vector chuy n gen mang c u trúc rd29A:: P5CSM K t qu c t P5CSM rd29A :: GUS b ng BamHI SacI Và th c hi n ph n ng ghép n i b ng enzym T4 ligaza bi n n p s n ph m ghép n i vào t bào kh bi n E.coli ch ng DH5α, 14 M - + M 1.3kb A 12kb 3,4kb B Hình 3.23 i n di s n ph m clony- PCR c t h n ch vector pBT rd29A:: P5CSM K t qu c a ph n ng c t b ng enzym gi i h n colony-PCR (Hình 3.23) ã kh ng nh ch c ch n c dịng khu n l c u có ch a vector chuy n gen, nghĩa ã thi t k thành công c u trúc gen chuy n mang gen ch u h n rd29A:: P5CSM c ghép n i thành cơng vào vector tách dịng pBT K t qu bi n n p vector chuy n gen rd29A:: P5CSM vào A tumefaciens K t qu PCR c i n di ki m tra gel agarose 0,8% cho th y: có dịng khu n l c c l a ch n cho k t qu dương tính v i ph n ng PCR v i băng nh t có kích thư c kho n 1300 bp i u ch ng t t ã bi n n p thành công vector rd29A:: P5CSM vào bào A tumefaciens Như v y ã t o c ch ng A tumefaciens pGV2260 mang plasmid tái t h p rd29A:: P5CSM ây ngu n nguyên li u ph c v cho m c ích chuy n gen t o tr ng ch ng ch u h n 3.4.2 T o thu c chuy n gen mang c u trúc rd29A:: P5CSM C u trúc chuy n gen pBI101 mang promoter rd9A i u n ho t ng c a gen P5CS c chuy n vào m nh thu c gi ng K326 15 M - + Hình 3.25 K t qu PCR dòng chuy n gen b ng c p m i rd29A for /rd29Arev M: Marker DNA 1kb; 1-9: Các dòng chuy n gen; (-) i ch ng âm; (+) i ch ng dương Hình 3.25 cho th y, s 33 dòng ki m tra thu c 30 dịng cho ph n ng dương tính, gi ng xu t hi n m t v ch AND có kích thư c kho ng 1,4kb ây kích thư c tương ng c a promoter rd29A i u ch ng t dịng có mang c u trúc rd29A:: P5CSM mong mu n 3.4.3 ánh giá kh ch u h n c a dòng thu c chuy n gen Các m u c a dòng thu c chuy n gen i ch ng ã c thu trư c gây h n sau gây h n 3, 5, ngày Các m u c tách chi t ki m tra hàm lư ng prolin K t qu trình bày b ng 3.7 hình 3.25 Sau gây h n nhân t o, hàm lư ng prolin tăng r t m nh so v i trư c gây h n t t c dòng nghiên c u, chuy n gen Sau ngày gây h n, prolin c bi t dịng i ch ng khơng chuy n gen tăng 206.8%, ó v i chuy n gen tăng t 259,5-451,8% (cao nh t dòng H33 th p nh t dịng H11) 16 Hình 3.27 Các dòng thu c sau 20 ngày h n nhân t o (A) sau ph c h i (B) i ch ng không chuy n gen, H11, H15, H26, H33: dòng WT: chuy n gen 3.5 K t qu t o u tương chuy n gen 3.5.1 K t qu tái sinh t o a ch i gi ng u tương DT84 3.5.1.1 T i ưu th i gian kh trùng h t So sánh hai phương pháp kh trùng (b ng khí clo b ng Javen), nh n th y phương pháp kh trùng b ng khí clo ã t ưu th hơn, v y chúng tơi l a ch n phương pháp kh trùng th i gian kh trùng 16 gi kh trùng h t thu nguyên li u cho thí nghi m ti p theo 3.5.1.2 nh hư ng c a BAP n kh t o a ch i t m m h t chín Các m u sau gây t n thương c t b nh sinh trư ng, chúng c t o a ch i lo i môi trư ng (SIM0-SIM7) ch a n ng t 0mg/l (SIM4) n 2,5 mg/l Như v y l a ch n n ng BAP BAP mg/l b sung vào môi trư ng t o a ch i s d ng k t qu cho thí nghi m ti p theo 3.5.1.3 nh hư ng c a hocmon sinh trư ng GA3,t i kh kéo dài ch i Các c m ch i t o môi trư ng SIM4 c chuy n sang môi trư ng (SEM0-SEM3) có b sung GA3 v i n ng 17 tương ng 0,5 mg/l, mg/l 1,5 mg/l Nh ng k t qu thu c nh n th y s ph i h p gi a GA3 (0,5 mg/l) thích h p cho trình kéo dài ch i K t qu phù h p v i m t s k t qu nghiên c u c a tác gi khác ã công b (Olhoft tg 2007), Olhoft tg 2001) 3.5.1.4 nh hư ng c a IBA n hi u qu t o r N ng ã nghiên c u nh n th y 0,1 mg/l n ng c a IBA chúng tơi thích h p nh t cho vi c r u tương in vitro gi ng DT84 3.5.1.5 Xác nh giá th thích h p cho in vitro Th nghi m lo i giá th khác là: tr u hun, tr u hun:1 cát vàng h n h p tr ng có bán s n Hai y u t c ánh giá thí nghi m t l s ng c a ch t lư ng Căn c vào ch t lư ng k t qu nh n th y v i t l giá th tr u hun: cát vàng phù h p Sau hai tu n chuy n 3.5.2 K t qu bư c t u chuy n gen GUS vào u tương DT84 T l bi u hi n t m th i gen gus thu c 67,5% T l m u s ng sót sau tu n mơi trư ng ch n l c 15,21% 3.5.3 K t qu chuy n c u trúc gen ch u h n vào u tương Thí nghi m c ti n hành lơ thí nghi m v i t ng s 1262 m u c s d ng cho chuy n gen, có 564 s m u t o ch i, 101 s m u kéo dài ch i, trình ch n l c kháng sinh có 28 s ng sót r tr ng lư i ki m tra s có m t c a gen chuy n, sau kho ng tháng, m u c a dòng T0 c ti n hành thu K t qu nhà tách chi t DNA t ng s i n di s n ph m PCR cho th y ã thu nh n c dương tính v i ph n ng PCR 18 M Hình 3.36 Ki m tra WT - + u tương T0 chuy n gen b ng PCR M: Thang DNA chu n 1kb; (-): i ch ng âm; WT: Cây không chuy n gen; -4: Các dịng T0 c phân tích; (+): Dịng 11 Hình 3.37 Cây i ch ng dương (plasmid) Dòng 23 Dòng 17 u tương T0 chuy n gen K T LU N VÀ NGH K t lu n 1.1 Gi ng u tương a phương sưu t p c có s a d ng phong phú v hình thái, kích thư c kh i lư ng h t Phân tích v ch tiêu hóa sinh cho th y gi ng u tương h n cao so v i gi ng a phương có ch t lư ng kh ch u i ch ng ã xác nh c m i liên quan gi a t l tăng hàm lư ng prolin kh ch u h n c a gi ng u tương ph m vi nghiên c u 1.2 Trình t gen P5CS c a hai gi ng u tương DT84 SL5 ã c phân l p g m có 2148 nucleotit, mã hóa 715 axit amin 19 1.3 ãt o t bi n b ba có v trí th 125 c a gen P5CS c a gi ng u tương SL5, thay th Asp b ng Ala trình t protein 1.4 Promoter rd29A ã c phân l p thành công t Promotor rd29A có chi u dài 1298bp mang trình t A.thaliana c trưng g m nhân t cis thu c nhóm MYB, DRE, AMYBOX nhân t c trưng c a promoter nhân t c m ng i u ki n khô h n 1.5 Kh ho t ng c a promtor rd29A ã c ánh giá thu c chuy n gen Trong i u ki n thi u nư c, promoter rd29A ã i u n gen ch th GUS bi u hi n m nh rõ ràng dòng thu c chuy n gen c x lý b i h n nhân t o so v i dịng chuy n gen khơng x lý 1.6 i ch ng i v i dòng thu c chuy n gen mang c u trúc rd29A:: P5CSM , có hi n tư ng tăng cao hàm lư ng prolin sau gây h n nhân t o, d n n kh s ng sót cao i ch ng (không chuy n gen) Kh ph c h i c a dòng chuy n gen nhanh i ch ng 1.7 T i ưu c quy trình tái sinh chuy n gen thơng qua mô nách m m u tương Bư c P5CSM vào gi ng PCR u chuy n thành công c u trúc gen rd29A:: u tương DT84, thu c m t s dịng dương tính i v i gen chuy n ngh 2.1 Ti p t c nghiên c u, phân tích dịng u tương chuy n gen ch u h n ph c v cho ch n t o gi ng 2.2 M r ng s d ng c u trúc promoter rd29A:: GUS rd29A:: P5CSM vào i tư ng tr ng khác 20 ... vector chuy n gen mang c u trúc liên quan n tính ch u h n u tương 2.3 T o u tương mang c u trúc gen liên quan n c tính ch u h n 3 N i dung nghiên c u 3.1 Phân tích c i m sinh lý, hóa sinh c a m... sĩ là: ? ?Phân l p, t o t bi n i m gen P5CS liên quan n tính ch u h n th nghi m chuy n vào Vi t Nam? ?? u tương M c tiêu nghiên c u 2.1 So sánh trình t gen mã hóa P5CS c a gi ng a phương thu c nhóm... u tương m i mang tính kháng sâu b nh, nhiên cho n cơng trình nghiên c u v chuy n gen ch u h n vào u tương v n chưa c quan tâm úng m c Xu t phát t nh ng lý ti n hành tài lu n án ti n sĩ là: “Phân