Phân lập, tạo ñột biến ñiểm ở gen P5CS liên quan ñến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây ñậu tương Việt Nam

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ABA Abcisis acid DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid ATP Adenozin triphosphata ATP-ase Enzym phân giải ATP cDNA Sợi DNA bổ sung ñược tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngược (Complementary DNA) AS A tumefaciens BAP bar bp CCM DEPC Acetosyringone Agrobacterium tumefaciens 6-benzyladenine gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase Base pair Cocultivation medium Diethyl pyrocarbonate ñtg ñồng tác giả dNTP EDTA E coli GA3 GM GUS HSP IAA IBA IPTG kb LB LSD LEA MES MS NAA nptII OD P5CS P5CDH P5CR PDH deoxynucleoside triphosphate Ethylene diamine tetraacetic acid Escherichia coli Gibberellic acid Germination medium – môi trường nảy mầm hạt β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) Indoleacetic acid Indole-3-butyric acid Isopropylthio-beta-D-galactoside kilo base Luria Bertani Least significant difference = ñộ lệch chuẩn Late embryogenesis abundant 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid Môi trường muối theo Murashige Skoog (1962) α-Naphthaleneacetic acid Neomycin phosphotransferase gene Optical density pyroline-5-carboxylate synthetase Pyrroline carboxylate dehydrogenase Pyrroline carboxylate reductase Pyrroline dehydrogenase Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn rd29A PCR RM SDS SIM SEM Taq T-DNA Ti- plasmid TBE Responsive Dehydration Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase Rooting medium – môi trường rễ Sodium dodecylsulfat Shoot induction medium – môi trường tạo ña chồi Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi Thermus aquaticus DNA Transfer –DNA = ñoạn ADN ñược chuyển Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u Tris - Boric acid - EDTA TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA v/p X-gluc X-gal vòng/phút 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase YEP Yeast extract peptone Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn MỤC LỤC MỞ ðẦU ðặt vấn ñề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ðẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 ðặc ñiểm sinh học 1.1.3 Giá trị kinh tế giá trị sử dụng ñậu tương 1.1.4 Tình hình sản xuất ñậu tương giới Việt Nam 1.2 CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ðẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ðẬU TƯƠNG 10 1.2.1 Khả thích nghi rễ ñiều kiện hạn 11 1.2.1.1.Sự phát triển rễ 11 1.2.1.2 Khả cố ñịnh nitơ ñậu tương ñiều kiện hạn 13 1.2.2 Các tính trạng liên quan ñến thích ứng ñậu tương ñiều kiện hạn 14 1.2.2.1 Cường ñộ thoát nước khí khổng 14 1.2.2.2 Cường ñộ thoát nước biểu bì 15 1.2.2.3 Mật ñộ lông tơ 16 1.2.2.4 Hiệu sử dụng nước 17 1.2.3 ðáp ứng phương diện hóa sinh ñậu tương ñiều kiện hạn 18 1.2.4 Một số gen liên quan ñến tính chịu hạn 19 1.3 PROLIN VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYME P5CS TRONG CON ðƯỜNG SINH TỔNG HỢP PROLIN 21 1.3.1 Quá trình sinh tổng hợp prolin 21 1.3.2 ðiều hòa trình trao ñổi prolin thực vật 23 1.3.3 Vai trò tích lũy prolin ñối với tính chống chịu 25 1.3.4 Vai trò enzym pyrroline-5-carboxylate synthetase ñối với tính chống chịu trồng 27 1.4 PROMOTER VÀ VAI TRÒ ðIỀU KHIỂN HOẠT ðỘNG CỦA GEN DƯỚI ðIỀU KIỆN KHÔ HẠN 1.4.1 Cấu trúc chức promoter Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 29 29 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.4.2 Các loại promoter sử dụng công nghệ sinh học 30 1.4.3 Promoter rd29A 32 1.5 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ðẬU TƯƠNG 32 1.5.1 Nâng cao khả chịu hạn ñậu tương phương pháp ñột biến thực nghiệm 32 1.5.2 Sử dụng công nghệ tế bào thực vật chọn dòng ñậu tương chịu hạn 33 1.5.3 Sử dụng kỹ thuật chuyển gen ñể nâng cao khả chịu hạn ñậu tương 35 1.5.3.1 Các phương pháp chuyển gen thực vật 35 1.5.3.2 Tiềm phương pháp chuyển gen thực vật nghiên cứu tạo ñậu tương chịu hạn 37 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 38 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.2.1 Phương pháp sinh lý, hoá sinh 39 2.2.1.1 ðánh giá nhanh khả chịu hạn 39 2.2.1.2 ðịnh lượng protein, lipit, hàm lượng thành phần axit amin hạt 39 2.2.1.3 Xác ñịnh hàm lượng prolin 40 2.2.1.4 Phương pháp tính toán xử lý số liệu 40 2.2.2 Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro 40 2.2.2.1 Arabidopsis 40 2.2.2.2 Thuốc 40 2.2.2.3 ðậu tương 41 2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử 44 2.2.3.1 Thiết kế mồi 44 2.2.3.2 Phương pháp tách chiết, tinh DNA RNA 44 2.2.3.3 Phương pháp tổng hợp cDNA 45 2.2.3.4 Phản ứng PCR 45 2.2.3.5 Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention) 46 2.2.3.6 Phương pháp tách dòng 46 2.2.3.7 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 49 2.2.2.8 Thiết kế cấu trúc rd29A::GUS rd29A::P5CSM……… ……………49 2.2.3.9 Các phương pháp phân tích biến nạp 52 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 KẾT QUẢ SƯU TẬP VÀ ðÁNH GIÁ CÁC GIỐNG ðẬU TƯƠNG ðỊA PHƯƠNG CỦA TỈNH SƠN LA 53 3.1.1 ðặc ñiểm hình thái, hóa sinh hạt ñậu tương 53 3.1.2 Kết ñánh giá khả chịu hạn giống ñậu tương nghiên cứu 55 3.2 PHÂN LẬP GEN P5CS VÀ ðỘT BIẾN ðIỂM LOẠI BỎ ỨC CHẾ NGƯỢC 58 3.2.1 Kết phân lập gen P5CS 58 3.2.2 Kết khuếch ñại, tách dòng xác ñịnh trình tự gen P5CS 58 3.2.3 Tạo ñột biến ñiểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược P5CS phân lập từ ñậu tương 69 3.3 PHÂN LẬP VÀ KIỂM TRA HOẠT ðỘNG CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN rd29A 72 3.3.1 Phân lập promoter rd29A 72 3.3.2 Phân tích trình tự promoter rd29A 73 3.3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A 75 3.3.4 Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc rd29A :: GUS 75 3.4 KẾT QUẢ ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC rd29A::P5CSM 78 3.4.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM 78 3.4.2 Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM 81 3.4.3 ðánh giá khả chịu hạn dòng thuốc chuyển gen 82 3.5 KẾT QUẢ TẠO CÂY ðẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN 84 3.5.1 Kết tái sinh tạo ña chồi giống ñậu tương DT84 84 3.5.1.1 Tối ưu thời gian khử trùng hạt 84 3.5.1.2 Ảnh hưởng BAP ñến khả tạo ña chồi từ mầm hạt chín 87 3.5.1.3 Ảnh hưởng hocmon sinh trưởng GA3 tới khả kéo dài chồi 89 3.5.1.4 Ảnh hưởng IBA ñến hiệu tạo rễ 91 3.5.1.5 Xác ñịnh giá thể thích hợp cho in vitro 93 3.5.2 Kết bước ñầu chuyển gen GUS vào ñậu tương DT84 94 3.5.3 Kết chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào ñậu tương 96 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Diện tích sản xuất ñậu tương số quốc gia giới Bảng 1.2 Sản lượng ñậu tương số quốc gia giới Bảng 1.3 Năng suất ñậu tương số quốc gia giới Bảng 1.4 Sản lượng ñậu tương tỉnh thành phố Bảng 1.5 Cây chuyển gen mang gen P5CS 29 Bảng 2.1 Thành phần dung dịch ñệm tách chiết 45 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 46 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng OE -PCR 46 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng 47 Bảng 2.5 Thành phần hoá chất tách plasmid 48 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng colony - PCR 49 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt rd29A vector pBI 101 50 BamHI HindII Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A :: pBI 101 50 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt rd29A:: P5CSM BamHI SacI 50 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A:: pBI 101 51 Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt plasmid rd29A :: pBI101 ::P5CSM 52 Bảng 3.1 Các giống ñậu tương ñịa phương sưu tập tỉnh Sơn La 53 Bảng 3.2 Chỉ số chịu hạn tỷ lệ tăng hàm lượng prolin giống ñậu 57 tương nghiên cứu Bảng 3.3 Vị trí trình tự nucleotid mồi ñặc hiệu gen P5CS 58 Bảng 3.4 Vị trí sai khác trình tự nucleotid gen P5CS giống 64 ñậu tương Bảng 3.5 Vị trí sai khác trình tự axit amin gen P5CS giống 65 ñậu tương Bảng 3.6 Vị trí trình tự nucleotid mồi ñặc hiệu gen P5CS 69 Bảng 3.7 Hàm lượng prolin tích lũy dòng thuốc nghiên cứu 82 (µmol/g) Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bảng 3.8 Ảnh hưởng thời gian khử trùng javen ñến khả 85 nảy mầm ñậu tương DT84 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian khử trùng khí clo ñến khả 86 nảy mầm ñậu tương DT84 Bảng 3.10 Ảnh hưởng BAP tới khả tạo ña chồi 88 Bảng 3.11 Ảnh hưởng GA3 ñến khả kéo dài chồi 90 Bảng 3.12 Ảnh hưởng IBA ñến khả tạo rễ 92 Bảng 3.13 Tỷ lệ tái sinh/ sống sót mẫu qua giai ñoạn 97 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Chu trình sinh tổng hợp prolin thực vật bậc cao 22 Hình 1.2 Cơ chế tác nhân ñiều hòa trình trao ñổi prolin 23 thực vật Hình 1.3 Vai trò prolin ñối với tính chống chịu 25 Hình 2.1 Sơ ñồ thí nghiệm tái sinh ñậu tương 42 Hình 2.2 Sơ ñồ chuyển gen vào ñậu tương qua nách mầm 43 Hình 2.3 Tạo vector chuyển gen mang promoter rd 29A 49 Hình 3.1 ðồ thị biểu diễn khả chịu hạn tương ñối số giống 56 ñậu tương ñịa phương giống DT84 Hình 3.2 Sản phẩm tách RNA 59 Hình 3.3 Kết nhân hai ñoạn gen P5CS từ giống ñậu tương DT84 59 SL5 Hình 3.4 Kết PCR ghép nối hai ñoạn gen P5CS từ giống ñậu 60 tương DT84 SL5 Hình 3.5 Kết tách dòng gen P5CS từ giống ñậu tương DT84 62 SL5 Hình 3.6 Trình tự nucleotid gen P5CS giống ñậu tương 64 Hình 3.7 Trình tự axit amin Protein gen P5CS mã hóa giống 67 ñậu tương Hình 3.8 Mức ñộ tương ñồng axit amin gen P5CS mã hóa 68 giống ñậu tương Hình 3.9 Sơ ñồ phát sinh chủng loại so sánh mức ñộ tương ñồng 68 axit amin protein gen P5CS giống ñậu Hình 3.10 ðiện di sản phẩm PCR 70 Hình 3.11 Phản ứng nối hai ñoạn gen theo phương pháp OE-PCR với 70 cặp mồi BamHI-P5CS Sacl -P5CS Hình 3.12 ðiện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzym cắt giới 71 hạn BamHI Hình 3.13 Phân tích, so sánh trình tự nucleotid phát ñột biến vị trí nucleotid 374 gen P5CS Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 71 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 3.14 Kết nuôi cấy invitro Arabidopsis thaliana 72 Hình 3.15 ðiện di sản phẩm PCR cắt hạn chế vector pBT/rd29A 73 Hình 3.16 Phân tích trình tự promoter rd29A 74 Hình 3.17 Sơ ñồ thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A 75 Hình 3.18 ðiện di sản phẩm PCR cắt hạn chế vector pBI101/rd29A 75 Hình 3.19 Một số hình ảnh chuyển cấu trúc promoter rd29A vào thuốc 76 Hình 3.20 Biểu gen GUS chuyển gen 77 Hình 2.21 Hoạt tính enzym GUS dòng thuốc chuyển gen mang promoter rd29A ñiều kiện hạn nhân tạo 78 Hình 3.22 Các sản phẩm cắt ñồng thời enzym BamHI SacI 79 Hình 3.23 ðiện di sản phẩm cloning PCR cắt hạn chế vector pBT 80 rd29A::/P5CSM Hình 3.24 Kết colny PCR chọn dòng A tumefaciens 81 Hình 3.25 Kết PCR dòng chuyển gen cặp mồi rd29A 82 for/rd29Arev Hình 3.26 Hàm lượng prolin tích lũy thời gian gây hạn nhân tạo 83 Hình 3.27 Các dòng thuốc sau 20 ngày hạn nhân tạo (A) sau 84 phục hồi (B) Hình 3.28 Hạt nảy mầm phương pháp khử trùng khác 87 Hình 3.29 Cụm chồi hình thành môi trường có nồng ñộ BAP khác 89 Hình 3.30 Chồi kéo dài môi trường có nồng ñộ GA3 khác 90 Hình 3.31 Ảnh hưởng IBA tới việc hình thành rễ in vitro 93 Hình 3.32 Huấn luyện cây, trồng nhà lưới thu hoạch 94 Hình 3.33 Biểu gen GUS 95 Hình 3.34 Sơ ñồ hoàn chỉnh chuyển gen vào ñậu tương qua nách 96 mầm Hình 3.35 Hình ảnh minh họa trình chuyển gen 97 Hình 3.36 Kiểm tra ñậu tương T0 chuyển gen PCR 98 Hình 3.37 Cây ñậu tương T0 chuyển gen 98 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn MỞ ðẦU ðặt vấn ñề Cây ñậu tương (Glycine max L Merrill) trồng quan trọng không Việt Nam mà ñối với nhiều quốc gia giới Hạt ñậu tương ñược dùng làm nguồn thức ăn giàu ñạm cho người nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến ðậu tương loại trồng ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao sử dụng làm thương phẩm, ñược sử dụng cho mục ñích cải tạo ñất Bên cạnh ñó, ñậu tương dễ canh tác, có khả thích nghi với nhiều vùng sinh thái, khí hậu khác ñược trồng nhiều vùng quốc gia vùng lãnh thổ với sản lượng năm 2009 222 triệu [107] Tại Việt Nam, ñậu tương giữ vai trò quan trọng cấu trồng nhiều ñịa phương, với sản lượng trung bình từ 2001 - 2009 239,1 nghìn Theo thống kê năm 2009 cho thấy, ñậu tương ñược canh tác có hệ thống diện tích 146,2 nghìn 28 tỉnh thành trải ñều từ Bắc vào Nam, tập trung chủ yếu miền Bắc với sản lượng nước 213,6 nghìn [107] Trong khu vực ASEAN, suất ñậu tương năm 2009 Việt Nam ñứng thứ số nước trồng ñậu tương Campuchia, Lào, Myanmar, Philipin, Thái Lan Việt Nam Tuy nhiên so với trung tâm sản xuất ñậu tương giới Argentina, Brazil Hoa Kỳ sản lượng ñậu tương nước ta thấp [107] Vì thế, ñể ñáp ứng ñủ nhu cầu nước nên phải nhập ñậu tương với số lượng lớn từ quốc gia bên ñặc biệt Hoa Kỳ Tình trạng hạn hán ảnh hưởng tới tình hình sản xuất ñậu tương không Việt Nam mà nước sản xuất ñậu tương hàng ñầu giới Argentina Thống kê cho thấy, sản lượng ñậu tương Argentina vào vụ mùa năm 2009 giảm từ 34,5 triệu so với thời ñiểm năm 2008 46,2 triệu Ở Việt Nam, tình hình thiếu nước trầm trọng ñịa phương làm cho sản lượng ñậu tương năm 2009 giảm xuống 213,6 nghìn so với năm 2007 275,2 nghìn năm 2008 267,6 nghìn [106] ðậu tương trồng thuộc nhóm có khả Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ Kết luận 1.1 16 giống ñậu tương ñịa phương sưu tập ñược có ña dạng phong phú hình thái, kích thước khối lượng hạt Phân tích tiêu hóa sinh cho thấy giống ñậu tương ñịa phương có chất lượng khả chịu hạn cao so với giống ñối chứng ðã xác ñịnh ñược mối liên quan tỷ lệ tăng hàm lượng prolin khả chịu hạn giống ñậu tương phạm vi nghiên cứu 1.2 Trình tự gen P5CS hai giống ñậu tương DT84 SL5 ñã ñược phân lập gồm có 2148 nucleotid, mã hóa 715 axit amin 1.3 ðã tạo ñột biến ba có vị trí thứ 125 gen P5CS giống SL5, thay Asp Ala trình tự protein 1.4 Promoter rd29A ñã ñược phân lập thành công từ A.thaliana Promotor rd29A có chiều dài 1298bp mang trình tự ñặc trưng gồm nhân tố cis thuộc nhóm MYB, DRE, AMY box nhân tố ñặc trưng promoter nhân tố cảm ứng ñiều kiện khô hạn 1.5 Khả hoạt ñộng promtor rd29A ñã ñược ñánh giá thuốc chuyển gen Trong ñiều kiện thiếu nước, promoter rd29A ñã ñiều khiển gen thị GUS biểu mạnh rõ ràng dòng thuốc chuyển gen ñược xử lý hạn nhân tạo so với dòng chuyển gen không xử lý ñối chứng 1.6 ðối với dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM, có tượng tăng cao hàm lượng prolin sau gây hạn nhân tạo, dẫn ñến khả sống sót cao ñối chứng (không chuyển gen) Khả phục hồi dòng chuyển gen nhanh ñối chứng 99 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.7 Tối ưu ñược quy trình tái sinh chuyển gen thông qua mô nách mầm ñậu tương Bước ñầu chuyển thành công cấu trúc gen rd29A::P5CSM vào giống ñậu tương DT84, thu ñược số dòng dương tính PCR ñối với gen chuyển ðề nghị - Tiếp tục nghiên cứu, phân tích dòng ñậu tương chuyển gen chịu hạn phục vụ cho chọn tạo giống - Mở rộng sử dụng cấu trúc promoter rd29A::GUS rd29A::P5CSM vào ñối tượng trồng khác 100 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ðà CÔNG BỐ LIÊN QUAN ðẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Hà Tấn Thụ, ðinh Thị Kim Phương, Trần Thị Trường (2006), “Sưu tập, phân loại ñánh giá chất lượng hạt số giống ñậu tương ñịa phương tỉnh Sơn La” Tạp chí Nông nghiệp phát triển Nông thôn số 11 kỳ I tháng 6/2006 28-32 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thuý Hường (2006), “Thành phần axit amin khả chịu hạn số giống ñậu tương ñịa phương tỉnh Sơn La” Tạp chí Nông nghiệp phát triển Nông thôn số 20 kì II tháng 10/2006 22-26 Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008) ðánh giá khả chịu hạn phân lập gen P5CS số giống ñậu tương (Glycine max L.Merrili) Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4): 459-466 Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009) Phát triển hệ thống tái sinh invitro ñậu tương (Glycine max L.Merrili) phục vụ chuyển gen Tạp chí Khoa học Công nghệ ðại học Thái Nguyên 52(4): 82-88 Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2009) Tạo gen mã hóa enzym P5CS (Pyroline - carboxylate synthase) mang ñột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi kỹ thuật PCR Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009: 191 - 193 Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010) Tách dòng ñánh giá hoạt ñộng promoter cảm ứng khô hạn RD29A từ Arabidopsis thaliana Tạp chí Công nghệ sinh học 8(4): 1805-1810 Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010) Tạo thuốc chuyển gen P5CS ñột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngược, làm tăng hàm lượng protein khả chống chịu khô hạn Hội nghị toàn quốc khoa học sống Bio-Hà Nội 2010 Tạp chí Công nghệ sinh học (3A): 539-544 Chu Hoang Mau, Nguyen thi Thuy Huong, Nguyen Tuan Anh, Chu Hoang Lan, Le van Son, Chu Hoang Ha ( 2010) Characteristic of the gene encoding pyrroline – – carboxylate synthase (P5CS) in Vietnamese sobean cultivar ( Glycine max L.Merrill) 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010): 319-323 101 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Lê Trần Bình, Hỗ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng NXB Nông Nghiệp Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa NXB ðại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, ðinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), “Mối tương quan hàm lượng prolin tính chống chịu lúa′′ Tạp chí công nghệ sinh học, 1(1): 85-95 Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành hóa sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi, Nguyễn Thị Tỵ (1998), “Xác ñịnh thành phần axit amin phương pháp dẫn xuất hoá với 0-phthalñialehyd 9-fluorenlmthyl chlorofomat hệ HP aminoquan series II”, kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học 1997 NXB khoa học kỹ thuật H, 454-461 Ngô Thế Dân, Trần ðình Long, Trần Văn Lài, ðỗ Thị Dung, Phạm Thị ðào (1999), Cây ñậu tương NXB Nông Nghiệp Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005) Sinh học phân tử NXB Giáo Dục.101-112 Trần Văn ðiền (2007), Giáo trình ñậu tương NXB Nông Nghiệp Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả ñáp ứng chuyển nạp gen giống ñậu tương trồng Việt Nam“ Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn 18: 11-16 10 Nguyễn Như Khanh(2008), Sinh học phát triển thực vật NXB Giáo dục 11 Nguyễn Như Khanh, Cao Phi Bằng (2008), Sinh lý học thực vật 2008, NXB Giáo dục 102 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 12 Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu ñặc tính hoá sinh sinh học phân tử số giống ñậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học Viện Công nghệ sinh học: Hà Nội 13 Trần Thị Phương Liên (2010) Protein tính chống chịu thực vật, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ :82-140 14 Trần ðình Long, ðoàn Thị Thanh Nhàn (1995) Kết nghiên cứu giống ñỗ tương M103, Kết nghiên cứu khoa học ñậu ñỗ 1991-1995:52-56 15 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp ñột biến thực nghiệm ñể tạo dòng ñậu tương ñậu xanh thích hợp cho miền núi ðông bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội 16 ðinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật Luận án tiến sỹ sinh học, Hà Nội 17 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết nghiên cứu thực nghiệm nông lâm ngư nghiệp máy vi tính, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 18 Nguyễn ðức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội 19 Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2009) “Cây thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng ñồng thời hai loại virus gây bệnh khảm” Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(2): 193- 201 Tài liệu tham khảo tiếng Anh 20 Armengaud P, Thiery L, Buhot N, Grenier-de March G, Savouré A (2004) “Transcriptional regulation of prolin biosynthesis in Medicago truncatula reveals developmental and environmental specific features“ Physiologia plantarum 120(3), 442-450 21 Bates LS (1973), Rapid determination of free prolin for water stress studies Plant Soil 39: 205-207 103 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 22 Baucher M, Andree BVM , Chabbert B, Michel BJ, Opsomer C, Van MM and Botterman J (1999) “Down-regulation of cinnamyl alcohol dehydrogenase in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) and the effect on lignin composition and digestibility” Plant Molecular Biology 39: 437-447 23 Boggess SF and Stewart CR (1976), “Effect of water stress on prolin synthesis from radioactive precursors” Plant Physiol 58(3): 398-401 24 Borsani O, Zhu J, Verslues PE, Sunkar R, and Zhu JK (2005) “Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis” Cell 123: 1279–1291 25 Close T.J.(1997), “Dehydrin: Emergence biochemical role family plant dehydrin proteins’’, Physiol.Plant , 795-803 26 Csonka LN, Gelvin SB, Goodner BW, Orser CS, Siemieniak D, and Slightom JL (1988), “Nucleotid sequence of a mutation in the proB gene of Escherichia coli that confers prolin overproduction and enhanced tolerance to osmotic stress” Gene 64(2): 199-205 27 Curtis J, Shearer G, and Kohj DH (2004), “Bacteroid prolin catabolism affects N(2) fixation rateof drought- stressed soybeans” Plant Physiol 136(92): 3313-3318 28 Chen JB, Wang SM, Jing RL, and Mao XG (2009), “Cloning the PvP5CS gene from common bean (Phaseolus vulgaris) and its expression patterns under abiotic stresses” J Plant Physiol, 166(1): 12- 19 29 Choudhary NL, Sairam RK, and Tyagi A (2005), “Expression of ∆1 Pyrroline - - carboxylate synthetase gene during droght in rice (Oryzasativa L)” Indian J Biochem Bio, 42: 366-370 30 Delauney AJ, Hu CAA, and Kishor PB, Verma, D P S (1993) “Cloning of ornithine δ- aminotransferase cDNA from Vigna aconitifolia by transcomplementation in Escherichia coli and regulation of prolin biosynthesis” J Biol Chem, 268: 18673-18678 31 Dix PJ, (1986) “Plant cell culture technology” Yeoman M.M (eds), Oxford, Blackwell Scientific Publications 143-201 104 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 32 Do TH, Jacob M, Angenon G, Hermans C, Tran TT, Le VS, and Roosens NH (2003), “Prolin accumulation and ∆1 - Pyrroline - - carboxylate synthetase gene properties in three rice cultivars differing in salinity and drought tolerance” Plant Sci 165: 1059-1068 33 Fior S, Vianelli A, and Gerola PD (2009), “A novel method for fluorometric continuous measurement of β-glucuronidase (GUS) activity using 4-methylumbelliferyl-β-d-glucuronide (MUG) as substrate” Plant Sci 176(1): 130135 34 Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J (2005) “EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem, regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis” The Plant Journal 43(4): 553-567 35 Hai L, Qingyin Z, Yan LZ, Shasheng W, Xiangning J (2003), “Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco” Plant Growth Regulation 41: p 279-286 36 HamiltonIIIEW,HeckathornSA(2001)MitochondrialadaptationstoNaCl.Com plexIisprotectedoxidantsandsmallheatshockproteins,whereascomplexIIisprot ectedby prolineandbetaine.PlantPhysiol126:1266–1274 37 Hawkins S, Samaj J, Lauvergeat V, Boudet A, Grima-Pettenati J(1997), Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase: Identification of New Sites of Promoter Activity in Transgenic Poplar Plant Physiol, 113(2): p 321-325 38 Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumasho T (1994) “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries the T-DNA”, The Plant J (271-282) 39 Hirasawa, T Tanaka K., Miyamoto D., Takei, M and Ishihara K (1994) “Effects of preflowering moisture deficits on dry matter production and ecophysiological characteristics in soybean plants under drought conditions during grain filling” Jpn J Crop Sci 63: 721-730 105 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 40 Hiroaki Fujii and Jian-Kang Zhu (2009) An Autophosphorylation Site of the Protein Kinase SOS2 Is Important for Salt Tolerance in Arabidopsis Molecular Plant, doi:10.1093/mp/ssn087 41 Hong HP, Zhang H, Olhoft P, Hill S, Wiley H, Toren E, Hillebrand H, Jones T, Cheng M (2007),“Organogenic callus as the target for plant regeneration and transformation via Agrobacterium in soybean (Glycine max (L.) Merriill” In vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 43: 558-568 42 Hong Z, Lakkineni K, Zhang Z, Verma DPS (2000) Removal of feedback inhibition of -pyrroline -5- carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress” Plant Physiol, 122: p 1129-1136 43 Hoogenboom G.Peterson, CM, Huck, MG (1987) “Shoot growth rate of soybeans as affected by drought stress” Agron J 79: 598-607 44 Hu CA, Delauney AJ, Verma DPS (1992) “A bifunctional D1-enzymepyrroline-5-carboxylate synthetase catalyzes the first two steps in prolin biosynthesis in plants” Proc Natl Acad Sci USA 89:9354– 9358 45 Hua X, Van De Cotte B, Van Montagu, M., Verbruggen N (1999) “A 69 bp fragment in the pyrroline-5-carboxylate reductase promoter of Arabidopsis thaliana activates minimal CaMV 35S promoter in a tissue-specific manner” FEBS Lett 458:193–196 46 Hua X-J, Van De Cotte B, Van Montagu M, Verbruggen N (1997) Developmental regulation of pyrroline-5-carboxylate reductase gene expression in Arabidopsis Plant Physiol 114: 1215–1224 47 Huck MG, Ishihara K, Peterson C.M and Ushijima T (1983) “Soybean adaptation to water stress at selected stages of growth” Plant Physiol 73: 422-427 48 Hufstetler EV, Boerma, HR, Carter TE, Earl HG (2007) “Genotypic variation for three physiological traits affecting drought tolerance in soybean” Crop Sci 47: 25-35 106 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 49 James AT, Lawn RJ, Cooper M (2008a) “Genotypic variation for drought stress response traits in soybean I Variation in soybean and wild Glycine spp for epidermal conductance, osmotic potential, and relative water content” Aus J Agri Res 59: 656-669 50 James AT, Lawn RJ, Cooper M (2008b) “Genotypic variation for drought stress response traits in soybean II Inter-relations between epidermal conductance, osmotic potential, relative water content, and plant survival” Aus J Agri Res 59: 670-678 51 Jefferson RA, Kavanagh TA, and Bevan MW (1987), “GUS fusion: βglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants” EMBO 6: 3901-3907 52 Jovanovi Z, Proki L, Stiki R, Peki S (1996) “Cuticular characteristics in maize lines differing in drought resistance and maturity grouping” J Exp Bot 47: 59-60 53 Jun SS, Choi HJ, Yang JY, Hong YN (2001), “Photosynthetic response to dehydration and high temperature in trehalose-producing transgenic tobacco In PS2001 Proceedings, 12th International Congress on Photosynthesis” CSIRO Publishing, Canberra, S35-017 54 Kaspar TC, Taylor HM, Shibles RC (1984) “Taproot elongation rates of soybean cultivars in the glasshouse and their relation to filed rooting depth” Crop Sci 24: 916-920 55 Kavi Kishor PB, Hong Z, Miao G, Hu C, Verma DPS (1995) Overexpression of D1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline overproduction and confers osmoto lerance intransgenic plants Plant Physiol 108: 1387–1394 56 King CA, Purcell LC (2005) “Inhibition of N2 fixation in soybean is associated with elevated ureides and aminoacids” Plant Physiol 137: 13891396 107 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 57 Kishor PBK, Sangam S, Amrutha RN, Sri Laxmi P, Naidu KR, Rao K R S S, Sreenath Rao, Reddy K J, Theriappan P, Sreenivasulu N (2005) “Regulation of prolin biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: Its implications in plant growth and abiotic stress tolerance” Current Science 88:3 424 – 438 58 Kodym A, Afza R (2003) “Physical and chemical mutagenesis, plant functional genomics Erich Grotewold (Ed.)”, Humana Press 189-204 59 Kohl DH, Schubert KR, Carter MB, Hagedorn CH, Shearer G (1988) Proline metabolism in N2-fixing root nodules: energy transfer and regulation of purine synthesis Proc Natl Acad Sci USA 85: 2036–2040 60 Lambert N, Yarwood JN (1992), Engineering legume seed storage protein, in Plant Protein Engineering Cambridge University press, 167-187 61 Liu F, Andersen MN, Jensen CR (2003) “Loss of pod set caused by drought stress is associated with water status and ABA content of reproductive structures in soybean” Funct Plant Biol 30: 271-280 62 Liu Y, Gai JY, Lu HN, Wang Y J, Chen SY (2005) “Identification of drought tolerant germplasm and inheritance and QTL mapping of related root traits in soybean [Glycine max (L.) Merr.]” Yi Chuan Xue Bao 32: 855863 63 Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (November 1951) "Protein measurement with the Folin phenol reagent" J Biol Chem 193 (1): 265–75 64 Marino D, Frendo P, Ladrera R, Zabalza A, Puppo A, Arrese-Igor C (2007) “Nitrogen fixation control under drought stress Localized or systemic?” Plant Physiol 143: 1968–1974 65 Mattioli R, Falasca G, Sabatini S, Altamura MM, Costantino P, and Trovato M (2009) “The prolin biosynthetic genes P5CS1 and P5CS2 play 108 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn overlapping roles in Arabidopsis flower transition but not in embryo development” Physiologia Plantarum 137: 72–85 66 Matysik J, Ali Bhalu,B, Mohanty P (2002) “Molecular mechanism of quenching of reactive oxygen species by prolin under water stress in plants” - Curr Sci 82: 525-532 67 Murakeozy EP, Nagy Z, Duhaz C, Buchereau A, Tuba Z (2003) “Seasonal changes in the levels of compatible osmolytes in three halophytic species of inland saline vegetation in Hungary” J Plant Physiol 160:395–401 68 Nguyen HT, Babu RCBlum, A (1997) “Breeding for drought resistance in rice: physiology and molecular genetics considerations” Crop Sci 37: 1426-1434 69 Olhoft PM, Lin K, Galbraith J, Nielsen NC, Somers DA (2001), “The role of thiol compound in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells” Plant Cell Rep 20: 731-737 70 Olhoft PM (2007), “A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primarynode explants from seedlings” In Vitro Cell Dev Biol.-Plant 43: 536-549 71 Olhoft PM, Somers DA (2001), “L-Cysteine increases Agrobacteriummediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells” Plant Cell Rep, 20: 706-711 72 Paz1 MM, Shou H, Guo Z, Zhang Z, Banerjee AK, Wang K (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant” Euphytica 136: 167179 73 Peng Z, Lu Q, Verma DPS (1996) Reciprocal regulation of D1- pyrroline5-carboxylate synthetase and proline dehydrogenase genes control levels during and after osmotic stress in plants.Mol Gen Genet 253: 334–341 74 Porcel R, azconR,Ruiz- Lozano JM (2005), “Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins (LEA D-11) during drought stress in 109 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativaplants” J Exp Bot.,56(417):1933-42 75 Purcell LC, King CA (1996) “Drought and nitrogen source effects on nitrogen nutrition, seed growth, and yield in soybean” J Plant Nutr 19: 969-993 76 Ren-Gao X, Hong-Feng X, Zhang B (2006), “A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells” Biotechnol Lett, 28: 1551-1557 77 Riederer M, Schreiber L (2001) “Protecting against water loss: Analysis of the barrier properties of plant cuticles” J Exp Bot 52: 2023-2032 78 SabehatA,LurieS,WeissD(1998)Expressionofsmallheatshockproteinsatlowte mperatures.PlantPhysiol117:651–658 79 Sairam RV, Franklin G, Hassel R, Smith B, Meeker K N K, Parani M, Abed DA, Ismail S, Berry K, Goldman SL (2003),” A study on the effect of genotypes, plant growth regulators and sugars in promoting plant regeneration via organogenesis from soybean cotyledonary nodal callus” Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 75: 79-85 80 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 81 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol 1, 2, and Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 82 Samoylov VM, Tucker DM, Thibaud-Nissen F, Parrott WA (1998), “A liquid-medium-based protocol for rapid regeneration from embryogenic soybean cultures” Plant Cell Reports, 18: 49-54 83 Satoh R, Nakashima K, Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2002) “ACTCAT, a novel cis-acting element for prolin-and hypoosmolarity-responsive expression of the ProDH gene encoding prolin dehydrogenase in Arabidopsis” Plant Physiol 130, 709–719 110 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 84 Shinozaki K, Yamamguchi-Shinozaki K (2007), “Gene expression and signal transduction in water-stress response” Plant Physiol 115: 327-334 85 Sinclair TR, Ludlow MM (1986) “Influence of soil water supply on the plant water balance of four tropical grain legumes” J Plant Physiol 13: 329-341 86 Sinclair TR., Purcell L.C, King CA., Sneller CH., Chen P, Vadez V (2007) “Drought tolerance and yield increase of soybean resulting from improved symbiotic N fixation” Field Crops Res 101: 68-71 87 Specht JE, Williams JH (1985) Breeding for drought and heat resistance: Prerequisites and examples In: World Soybean Research Conference III Proceedings Edited by Shibles, R pp.468–475 Westview Press, Boulder, Colarado 88 Sun XH, Chen MJ (2002) “A brief account of promoter cloning” Acta Edulis Fungi 9(3): 57-62 89 Szabados L, AouldSavoure (2009) “ Prolin: amultifunctionalaminoacid ”Trends in PlantScience 15 (2): 89-97 90 Szekely G, Abraham E, Cseplo A, Rigo G, Zsigmond L, Csiszar J, Ayaydin F, Strizhov N, Jasik J, Schmelzer E (2008): “Duplicated P5CS genes of Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and developmental control of prolin biosynthesis” Plant Journal , 53(1):11-28 91 Tae-Seok K and Korban SS (2004), “Enhancing the frequency of somatic embryogenesis following Agrobacterium-mediated transformation of immature cotyledons of soybean [ Glycine max(L.) Merrill.]” In Vitro Cell Dev Biol-Plant 40: p 552-558 92 Taji T, Seki M, Satou M, Sakurai T, Kobayashi M, Ishiyama K, Narusaka Y, Narusaka M, Zhu JK, Shinozaki K (2004) “Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray” Plant Physiol 135:1697–1709 93 Taylor HM Burnett E, Booth GD (1978) “Taproot elongation rates of soybeans” Z Acker-und Pflanzenbau Bd 146 111 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 94 ThomashowMF(1998)Roleofcoldresponsivegenesinplantfreezingtolerance.P lantPhysiol118:1–7 95 Topping JF (1988), Tobacco transformation Methods Mol Biol, 81: 365 96 Turner NC, Wright GC, Siddique KHM (2001) “Adaptation of grain legumes (pulses) to water limited environments” Adv Agron 71: 193-23 97 Umezawa T, Yoshida R, Maruyama K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K and Thomashow MF (2004) SRK2C, a SNF1-Related protein kinase 2, improves drought tolerance by controlling stress-responsive gene expression in Arabidopsis thaliana PNAS 101 (49):17306-17311 98 Valliyodan B and Nguyen HT (2006) “Understanding regulatory networks and engineering for enhanced drought tolerance in plants” Curr Opin Plant Biol 9: 189 99 VierlingE,KimpelJA(1992)Plantresponsestoenvironmentalstress.CurrOpinB iotech3:164–170 100 Wu Y ZH, Que YX, Chen RK, Zhang MQ (2008) “Cloning and identification of promoter Prd29A and its application in sugarcane drought resistance” Sugar Tech.10(1): 36-41 101 Xu Q , Wen XP and Deng XX (2004) “A simple protocol for isolating genomic DNA from chestnut rose (Rosa roxburghii Tratt ) for RFLP and PCR Analyses” Plant Molecular Biology Reporter 22: 301a-301g 102 Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1993) “The plant hormone abscisic acid mediates the drought-induced expression but not the seed-specific expression of rd22, a gene responsive to dehydration stress in Arabidopsis thaliana” Mol.Gen.Genet 2: p 17-25 103 Zhang CS, Lu Q, Verma DPS (1995) “Removal of feedback inhibition of D1 -pyrroline-5-carboxylate synthetase, a bifunctional enzyme catalyzing the first two steps of prolin biosynthesis in plants” J Biol Chem 270:20491– 20496 112 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 104 Zhang C-S, Lu Q, Verma DPS (1997) “Characterization of ∆1 – pyrroline 5-carboxylate synthetase gene promoter in trangsgenic Arabidopsis thailana subjected to water stress” Plant Scicnce 129 : 81-89 105 Zhang N, Si HJ, and Wang D (2005), “Cloning of rd29A gene promoter from Arabidopsis thaliana and its application in stress-resistance transgenic potato” Acta Agronomica Sinica 31(2): 159-164 Tài liệu trang Web 106 .http://www.gso.gov.vn 107 http://faostat.fao.org 108.http://www.vi.wikipedia.org/wiki/Promoter 113 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn [...]... Phân lập, tạo ñột biến ñiểm ở gen P5CS liên quan ñến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây ñậu tương Việt Nam 2 Mục tiêu nghiên cứu 2.1 So sánh trình tự gen mã hóa P5CS của giống ñịa phương thuộc nhóm chịu hạn tốt và giống ñậu tương DT84 Tạo ñược ñột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi bởi prolin 2.2 Tạo ñược vector chuyển gen mang cấu trúc liên quan ñến tính chịu hạn ở cây ñậu tương 2.3 Tạo. .. inhibition) bởi prolin bằng phương pháp tạo ñột biến ñiểm 3.4 Phân lập promoter cảm ứng dưới ñiều kiện khô hạn rd29A từ cây Arabidopsis thaliana Phân tích hoạt ñộng của promoter dựa vào hoạt ñộng của gen GUS ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen 3.5 Thiết kế cấu trúc mang gen P5CS ñột biến ñược ñiều khiển bởi promoter rd29A và chuyển cấu trúc này vào cây thuốc lá 3.6 Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh và khả năng... [103]; Hong và ñtg, 2000 [42]) Tính chịu hạn là tính trạng ña gen, ñòi hỏi những nghiên cứu tổng thể về mặt sinh lý, hóa sinh kết hợp với sinh học phân tử, lập bản ñồ gen dựa vào các chỉ thị phân tử ñồng thời với việc phân lập các gen liên quan ñến tính chịu hạn trên từng ñối tượng cây, trong ñó, việc nghiên cứu sâu hơn về protein liên quan ñến tính chống chịu vẫn luôn cần thiết (Trần thị Phương Liên, 2010)... 1.1.1 Nguồn gốc và phân loại Cây ñậu tương là một trong những loài cây trồng ñược biết ñến từ rất sớm Các bằng chứng về lịch sử, ñịa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng ñậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc Cây ñậu tương ñược thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm ở Trung Quốc vào khoảng thế kỉ XVII trước công nguyên Cây ñậu tương ñược truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ VIII, du nhập vào nhiều nước... hẳn ở cây ñậu tương ñược tưới nước (Huck và ñtg, 1983) [47] Ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương quan rất chặt chẽ ñối với nhiều tính trạng rễ như khối lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ nhánh ở các giống chịu hạn Những tính trạng này thường ñược dùng như các chỉ tiêu quan trọng ñể ñánh giá và nhận dạng các giống ñậu tương có tính chịu hạn Quá trình sinh trưởng và phát... khoa học trên thế giới ứng dụng và ñạt ñược những kết quả rất có triển vọng trên cây ñậu tương Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa tại Viện nghiên cứu lúa ðồng bằng sông Cửu Long ñã thành công trong việc tạo ra các giống ñậu tương mới mang tính kháng sâu bệnh [9] Tuy nhiên, cho ñến nay công trình nghiên cứu về chuyển gen chịu hạn vào cây ñậu tương vẫn chưa ñược quan tâm ñúng mức Xuất phát... hưởng ñến sản lượng ñậu tương của cả thế giới (Bảng 1.3) Ở Việt Nam: ðậu tương ñược gieo trồng từ lâu ñời, trước cây ñậu xanh và ñậu ñen Tuy nhiên, với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ giống có năng suất thấp, sản xuất nhỏ lẻ, giá thành ñậu tương trong nước không có khả năng cạnh tranh với ñậu tương nhập khẩu là lý do khiến cho nông dân không mặn mà với cây ñậu tương Diện tích trồng ñậu tương. .. ñậu tương 2.3 Tạo cây ñậu tương mang cấu trúc gen liên quan ñến ñặc tính chịu hạn 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân tích ñặc ñiểm sinh lý, hóa sinh của một số giống ñậu tương trồng tại khu vực miền Bắc 2 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.2 Phân lập và xác ñịnh trình tự gen mã hóa enzyme pyroline-5 carboxylate synthetase (P5CS) 3.3 Tạo ñột biến loại bỏ hiệu... dòng cây ñậu tương có khả năng tích lũy nitơ tốt hơn trong ñiều kiện khô hạn Bằng việc sàng lọc số lượng lớn (>3000) dòng ñậu tương dựa vào chỉ tiêu này, 8 dòng ñậu tương có khả năng cố ñịnh nitơ tốt mang tính chịu hạn tốt hơn Nghiên cứu sâu hơn các dòng ñậu tương này, Sinclair và ñtg (2007) [86] tìm ra rằng quá trình dị hóa ure không phụ thuộc vào Mn tồn tại ở 6 trong số 8 dòng nghiên cứu Giống ñậu tương. .. bản chất phân tử các nhân tố hạn chế và ñiều hòa quá trình cố ñịnh nitơ trong ñiều kiện hạn ở cây ñậu tương 1.2.2 Các tính trạng liên quan ñến sự thích ứng của lá cây ñậu tương trong ñiều kiện hạn 1.2.2.1 Cường ñộ thoát hơi nước của khí khổng Cường ñộ thoái hơi nước của khí khổng là một trong những tính trạng sinh lý của lá có liên quan chặt chẽ ñến khả năng sử dụng nước của cơ thể thực vật khi cây gặp