Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương việt nam

Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương việt nam

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ABA Abcisis acid DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid ATP Adenozin triphosphata ATP-ase Enzym phân giải ATP cDNA Sợi DNA bổ sung được tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngược (Complementary DNA) AS Acetosyringone A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-benzyladenine bar gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase bp Base pair CCM Cocultivation medium - DEPC Diethyl pyrocarbonate đtg đồng tác giả dNTP deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E. coli Escherichia coli GA 3 Gibberellic acid GM Germination medium – môi trường nảy mầm hạt GUS β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside kb kilo base LB Luria Bertani LSD Least significant difference = độ lệch chuẩn LEA Late embryogenesis abundant MES 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid MS Môi trường muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid nptII Neomycin phosphotransferase gene OD Optical density P5CS pyroline-5-carboxylate synthetase P5CDH Pyrroline 5 carboxylate dehydrogenase P5CR Pyrroline 5 carboxylate reductase PDH Pyrroline dehydrogenase 1 rd29A Responsive Dehydration PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase RM Rooting medium – môi trường ra rễ SDS Sodium dodecylsulfat SIM Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi SEM Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi Taq Thermus aquaticus DNA T-DNA Transfer –DNA = đoạn ADN được chuyển Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u TBE Tris - Boric acid - EDTA TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA v/p vòng/phút X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase YEP Yeast extract peptone MỤC LỤC MỞ ĐẦU 0 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 4 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học 4 1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương 5 1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam 6 1.2. CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 10 1.2.1. Khả năng thích nghi của bộ rễ trong điều kiện hạn 11 1.2.1.1.Sự phát triển của bộ rễ 11 1.2.1.2. Khả năng cố định nitơ của cây đậu tương trong điều kiện hạn 13 1.2.2. Các tính trạng liên quan đến sự thích ứng của lá cây đậu tương trong điều kiện hạn 14 1.2.2.1. Cường độ thoát hơi nước của khí khổng 14 1.2.2.2. Cường độ thoát hơi nước của biểu bì 15 1.2.2.3. Mật độ lông tơ của lá 16 1.2.2.4. Hiệu quả sử dụng nước 17 1.2.3. Đáp ứng về phương diện hóa sinh của cây đậu tương trong điều kiện hạn 18 1.2.4. Một số gen liên quan đến tính chịu hạn 19 1.3. PROLIN VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYME P5CS TRONG CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP PROLIN 21 1.3.1. Quá trình sinh tổng hợp prolin 21 1.3.2. Điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật 23 1.3.3. Vai trò của sự tích lũy prolin đối với tính chống chịu của cây 25 1.3.4. Vai trò của enzym pyrroline-5-carboxylate synthetase đối với tính chống chịu của cây trồng 27 1.4. PROMOTER VÀ VAI TRÒ ĐIỀU KHIỂN HOẠT ĐỘNG CỦA GEN DƯỚI ĐIỀU KIỆN KHÔ HẠN 29 1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter 29 1 1.4.2. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học 30 1.4.3. Promoter rd29A 32 1.5. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 32 1.5.1. Nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm 32 1.5.2. Sử dụng công nghệ tế bào thực vật trong chọn dòng đậu tương chịu hạn 33 1.5.3. Sử dụng kỹ thuật chuyển gen để nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương 35 1.5.3.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật 35 1.5.3.2. Tiềm năng của phương pháp chuyển gen ở thực vật trong nghiên cứu tạo cây đậu tương chịu hạn 37 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 38 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.2.1. Phương pháp sinh lý, hoá sinh 39 2.2.1.1. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn 39 2.2.1.2. Định lượng protein, lipit, hàm lượng và thành phần axit amin trong hạt 39 2.2.1.3. Xác định hàm lượng prolin 40 2.2.1.4. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 40 2.2.2. Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro 40 2.2.2.1. Arabidopsis 40 2.2.2.2. Thuốc lá 40 2.2.2.3. Đậu tương 41 2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử 44 2.2.3.1. Thiết kế mồi 44 2.2.3.2. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA 44 2.2.3.3. Phương pháp tổng hợp cDNA 45 2.2.3.4. Phản ứng PCR 45 2.2.3.5. Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention) 46 2.2.3.6. Phương pháp tách dòng 46 2.2.3.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 49 2.2.2.8. Thiết kế cấu trúc rd29A::GUS và rd29A::P5CSM……… ……………49 2.2.3.9. Các phương pháp phân tích cây biến nạp 52 2 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1. KẾT QUẢ SƯU TẬP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG CỦA TỈNH SƠN LA 53 3.1.1. Đặc điểm hình thái, hóa sinh của hạt đậu tương 53 3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu 55 3.2. PHÂN LẬP GEN P5CS VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM LOẠI BỎ ỨC CHẾ NGƯỢC 58 3.2.1. Kết quả phân lập gen P5CS 58 3.2.2. Kết quả khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen P5CS 58 3.2.3. Tạo đột biến điểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược P5CS phân lập từ cây đậu tương 69 3.3. PHÂN LẬP VÀ KIỂM TRA HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN rd29A 72 3.3.1. Phân lập promoter rd29A 72 3.3.2. Phân tích trình tự promoter rd29A 73 3.3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A 75 3.3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A :: GUS 75 3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC rd29A::P5CSM 78 3.4.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM 78 3.4.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM 81 3.4.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen 82 3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN 84 3.5.1. Kết quả tái sinh tạo đa chồi ở giống đậu tương DT84 84 3.5.1.1. Tối ưu thời gian khử trùng hạt 84 3.5.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi từ lá mầm hạt chín 87 3.5.1.3. Ảnh hưởng của hocmon sinh trưởng GA 3 tới khả năng kéo dài chồi 89 3.5.1.4. Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả tạo rễ 91 3.5.1.5. Xác định giá thể thích hợp cho ra cây in vitro 93 3.5.2. Kết quả bước đầu chuyển gen GUS vào cây đậu tương DT84 94 3.5.3. Kết quả chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào đậu tương 96 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 3 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Diện tích sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 7 Bảng 1.2 Sản lượng đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 7 Bảng 1.3 Năng suất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 8 Bảng 1.4 Sản lượng đậu tương tại các tỉnh và thành phố 9 Bảng 1.5 Cây chuyển gen mang gen P5CS 29 Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết 45 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 46 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng OE -PCR 46 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng 47 Bảng 2.5 Thành phần hoá chất tách plasmid 48 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng colony - PCR 49 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt rd29A và vector pBI 101 bằng BamHI và HindII 50 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A :: pBI 101 50 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt rd29A:: P5CSM bằng BamHI và SacI 50 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A:: pBI 101 51 Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt plasmid rd29A :: pBI101 ::P5CSM 52 Bảng 3.1 Các giống đậu tương địa phương sưu tập tại tỉnh Sơn La 53 Bảng 3.2 Chỉ số chịu hạn và tỷ lệ tăng hàm lượng prolin của 7 giống đậu tương nghiên cứu 57 Bảng 3.3 Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi đặc hiệu gen P5CS 58 Bảng 3.4 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống đậu tương 64 Bảng 3.5 Vị trí sai khác trong trình tự axit amin của gen P5CS ở 3 giống đậu tương 65 Bảng 3.6 Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi đặc hiệu gen P5CS 69 Bảng 3.7 Hàm lượng prolin tích lũy trong các dòng thuốc lá nghiên cứu (µmol/g) 82 4 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến khả năng nảy mầm đậu tương DT84 85 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí clo đến khả năng nảy mầm đậu tương DT84 86 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo đa chồi 88 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của GA 3 đến khả năng kéo dài chồi 90 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 92 Bảng 3.13 Tỷ lệ tái sinh/ sống sót của các mẫu qua các giai đoạn 97 5 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Chu trình sinh tổng hợp prolin ở thực vật bậc cao 22 Hình 1.2 Cơ chế và các tác nhân điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật 23 Hình 1.3 Vai trò của prolin đối với tính chống chịu của cây 25 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tái sinh cây đậu tương 42 Hình 2.2 Hình 2.3 Sơ đồ chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm Tạo vector chuyển gen mang promoter rd 29A 43 49 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả năng chịu hạn tương đối của một số giống đậu tương địa phương và giống DT84 56 Hình 3.2 Sản phẩm tách RNA 59 Hình 3.3 Kết quả nhân hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và SL5 59 Hình 3.4 Kết quả PCR ghép nối hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và SL5 60 Hình 3.5 Kết quả tách dòng gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và SL5 62 Hình 3.6 Trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống đậu tương 64 Hình 3.7 Trình tự axit amin của Protein do gen P5CS mã hóa ở 3 giống đậu tương 67 Hình 3.8 Mức độ tương đồng của các axit amin gen P5CS mã hóa của các giống đậu tương. 68 Hình 3.9 Sơ đồ cây phát sinh chủng loại so sánh mức độ tương đồng của các axit amin của protein do gen P5CS của các giống đậu 68 Hình 3.10 Điện di sản phẩm PCR 70 Hình 3.11 Phản ứng nối hai đoạn gen theo phương pháp OE-PCR với cặp mồi BamHI-P5CS và Sacl -P5CS 70 Hình 3.12 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym cắt giới hạn BamHI 71 Hình 3.13 Phân tích, so sánh trình tự nucleotid và phát hiện đột biến tại vị trí nucleotid 374 của gen P5CS 71 6 Hình 3.14 Kết quả nuôi cấy invitro cây Arabidopsis thaliana 72 Hình 3.15 Điện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBT/rd29A 73 Hình 3.16 Phân tích trình tự promoter rd29A 74 Hình 3.17 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A 75 Hình 3.18 Điện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBI101/rd29A 75 Hình 3.19 Một số hình ảnh chuyển cấu trúc promoter rd29A vào thuốc lá 76 Hình 3.20 Biểu hiện gen GUS trên cây chuyển gen 77 Hình 2.21 Hoạt tính của enzym GUS ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen mang promoter rd29A dưới điều kiện hạn nhân tạo 78 Hình 3.22 Các sản phẩm cắt đồng thời bằng enzym BamHI và SacI 79 Hình 3.23 Điện di sản phẩm cloning PCR và cắt hạn chế vector pBT rd29A::/P5CSM 80 Hình 3.24 Kết quả colny PCR chọn dòng trong A. tumefaciens 81 Hình 3.25 Kết quả PCR các dòng chuyển gen bằng cặp mồi rd29A for/rd29Arev 82 Hình 3.26 Hàm lượng prolin tích lũy trong các thời gian gây hạn nhân tạo 83 Hình 3.27 Các dòng cây thuốc lá sau 20 ngày hạn nhân tạo (A) và sau phục hồi (B) 84 Hình 3.28 Hạt nảy mầm bằng các phương pháp khử trùng khác nhau 87 Hình 3.29 Cụm chồi hình thành trên môi trường có nồng độ BAP khác nhau 89 Hình 3.30 Chồi kéo dài trên môi trường có nồng độ GA 3 khác nhau 90 Hình 3.31 Ảnh hưởng của IBA tới việc hình thành rễ cây in vitro 93 Hình 3.32 Huấn luyện cây, trồng ở nhà lưới và thu hoạch quả 94 Hình 3.33 Hình 3.34 Biểu hiện của gen GUS Sơ đồ hoàn chỉnh chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm 95 96 Hình 3.35 Hình ảnh minh họa quá trình chuyển gen 97 Hình 3.36 Kiểm tra cây đậu tương T0 chuyển gen bằng PCR 98 Hình 3.37 Cây đậu tương T0 chuyển gen 98 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây đậu tương (Glycine max L. Merrill) là một trong những cây trồng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Hạt đậu tương có thể được dùng làm nguồn thức ăn giàu đạm cho con người và là nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến. Đậu tương là loại cây trồng ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao khi sử dụng làm thương phẩm, và được sử dụng cho mục đích cải tạo đất. Bên cạnh đó, đậu tương rất dễ canh tác, có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái, khí hậu khác nhau và được trồng ở nhiều vùng quốc gia và vùng lãnh thổ với sản lượng năm 2009 là trên 222 triệu tấn [107]. Tại Việt Nam, cây đậu tương cũng giữ vai trò rất quan trọng trong cơ cấu cây trồng ở nhiều địa phương, với sản lượng trung bình từ 2001 - 2009 là 239,1 nghìn tấn. Theo thống kê năm 2009 cho thấy, cây đậu tương được canh tác có hệ thống trên diện tích là 146,2 nghìn ha ở 28 tỉnh thành trải đều từ Bắc vào Nam, nhưng tập trung chủ yếu vẫn là ở miền Bắc với sản lượng của cả nước là 213,6 nghìn tấn [107]. Trong khu vực ASEAN, năng suất đậu tương năm 2009 của Việt Nam đứng thứ 3 trong số 6 nước trồng đậu tương là Campuchia, Lào, Myanmar, Philipin, Thái Lan và Việt Nam. Tuy nhiên so với các trung tâm sản xuất đậu tương của thế giới là Argentina, Brazil và Hoa Kỳ thì sản lượng đậu tương của nước ta còn khá thấp [107]. Vì thế, để đáp ứng đủ nhu cầu trong nước nên chúng ta phải nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn từ các quốc gia bên ngoài đặc biệt là Hoa Kỳ. Tình trạng hạn hán ảnh hưởng tới tình hình sản xuất đậu tương không chỉ ở Việt Nam mà ngay cả những nước sản xuất đậu tương hàng đầu thế giới như Argentina. Thống kê cho thấy, sản lượng đậu tương của Argentina vào vụ mùa năm 2009 giảm từ 34,5 triệu tấn so với cùng thời điểm năm 2008 là 46,2 triệu tấn. Ở Việt Nam, tình hình thiếu nước trầm trọng tại các địa phương làm cho sản lượng đậu tương của năm 2009 giảm xuống chỉ còn 213,6 nghìn tấn so với năm 2007 là 275,2 nghìn tấn và năm 2008 là 267,6 nghìn tấn [106]. Đậu tương là cây trồng thuộc nhóm cây có khả [...]... u tương m i mang tính kháng sâu b nh [9] Tuy nhiên, cho nghiên c u v chuy n gen ch u h n vào cây u tương v n chưa ư c quan tâm úng m c Xu t phát t nh ng lý do trên, chúng tôi ti n hành l p, t o t bi n i m chuy n vào cây n nay công trình gen P5CS liên quan tài lu n án ti n sĩ là: Phân n tính ch u h n và th nghi m u tương Vi t Nam 2 M c tiêu nghiên c u 2.1 So sánh trình t gen mã hóa P5CS c a gi ng và. .. loài cây tr ng ư c bi t Các b ng ch ng v l ch s , g c t Trung Qu c Cây a lý và kh o c h c ch ra r ng n t r t s m u tương có ngu n u tương ư c thu n hóa và tr ng làm cây th c ph m Trung Qu c vào kho ng th k XVII trư c công nguyên Cây u tương ư c truy n bá sang Nh t B n vào kho ng th k th VIII, du nh p vào nhi u nư c Châu Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, Cây u tương ư c tr ng Cây n , Vi t Nam, …... 1993 [30]) Gen P5CS ã ư c s d ng cho bi n n p làm tăng kh năng ch ng ch u khô h n và m t nư c m t s lo i cây tr ng (Zhang và tg, 1995 [103]; Hong và tg, 2000 [42]) Tính ch u h n là tính tr ng a gen, òi h i nh ng nghiên c u t ng th v m t sinh lý, hóa sinh k t h p v i sinh h c phân t , l p b n ng th i v i vi c phân l p các gen liên quan gen d a vào các ch th phân t n tính ch u h n trên t ng cây, trong ó,... ng u tương DT84 T o ư c a phương thu c nhóm ch u h n t t t bi n lo i b hi u ng c ch ph n h i b i prolin 2.2 T o ư c vector chuy n gen mang c u trúc liên quan n tính ch u h n cây u tương 2.3 T o cây u tương mang c u trúc gen liên quan n c tính ch u h n 3 N i dung nghiên c u 3.1 Phân tích c i m sinh lý, hóa sinh c a m t s gi ng mi n B c 2 u tương tr ng t i khu v c 3.2 Phân l p và xác nh trình t gen mã... thu c lá 3.6 Phân tích các ch tiêu hóa sinh và kh năng ch ng ch u c a các dòng thu c lá trong i u ki n gây h n nhân t o 3.7 Bi n n p c u trúc mang gen P5CS vào cây u tương thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens Phân tích s có m t c a gen bi n n p 3 Chương 1 T NG QUAN TÀI LI U 1.1 CÂY U TƯƠNG (GLYCINE MAX L MERRILL), GIÁ TR KINH T VÀ GIÁ TR S D NG 1.1.1 Ngu n g c và phân lo i Cây u tương là m t... c ch vào ban ngày và ư c ho t hóa vào bu i ng c a gen ngư c v i ho t 24 ng c a gen P5CS1 Phân tích promoter c a gen PDH1 ã xác nh ư c nhân t c m ng v i tr ng thái th m th u và prolin, và nhân t gi vai trò r t quan tr ng i v i quá trình ho t hóa c a gen (Satoh và tg, 2002) [83] Y u t phiên mã liên k t v i nhân t trên là h protein giàu leucine (Leucine Zipper Protein) Phân tích ho t r ty u ng c a gen. .. n khác nhau Arabidopsis, gen P5CS2 là m t gen “gi nhà” (housekeeping), ho t ch y u các mô phân sinh như u r và nh ch i, (Székely và tg, 2008) [90] C hai gen P5CS hoa, ch y u u ho t cây ng c a gen này hoa và các t bào nuôi c y ng các mô phân sinh c a cung c p prolin cho quá trình phát tri n c a hoa (Mattioli và tg, 2009) [65] Gen P5CS1 c a cây Arabidopsis ho t 23 ng r t m nh và ư c c m ng b i các y u... synthetase (P5CS) 3.3 T o t bi n lo i b hi u ng c ch ph n h i (feedback inhibition) b i prolin b ng phương pháp t o t bi n i m 3.4 Phân l p promoter c m ng dư i i u ki n khô h n rd29A t cây Arabidopsis thaliana Phân tích ho t ng c a promoter d a vào ho t ng c a gen GUS các dòng cây thu c lá chuy n gen 3.5 Thi t k c u trúc mang gen P5CS t bi n ư c i u khi n b i promoter rd29A và chuy n c u trúc này vào cây. .. trình ch n l c các gen liên quan n các tính tr ng v r bao g m các nghiên c u sàng l c gen t các cơ s d li u, thi t k m i phát tri n phương pháp phân tích h gen, xác này ã thành công trong vi c xác nghiên c u các tính tr ng v r nhân b n gen, xác nh s a d ng, nh qu n th nghiên c u Phương pháp nh nhi u gen quý quy nh các tính tr ng r lúa trong i u ki n h n (Valliyodan và tg, 2006) [98] Thêm vào ó, vi c hi... nông nghi p: Toàn b cây làm th c ăn cho gia súc u tương c khi tươi và khô u tương có vai trò quan tr ng trong c i t o u tương n u sinh trư ng và phát tri n t t s v i hàm lư ng canh m cao có th dùng l i trong bón cho t thay cho phân h u cơ Vi c luân u tương trên th gi i và t tr ng h u hi u Vi t Nam Trên th gi i: V i nh ng giá tr kinh t và s d ng c a cây xem là m t trong nh ng lo i cây tr ng chi n lư . sĩ là: Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. So sánh trình tự gen mã hóa P5CS của. nhóm chịu hạn tốt và giống đậu tương DT84. Tạo được đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi bởi prolin. 2.2. Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương. . sinh cây đậu tương 42 Hình 2.2 Hình 2.3 Sơ đồ chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm Tạo vector chuyển gen mang promoter rd 29A 43 49 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả năng chịu hạn tương