PHÂN LẬP, TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM Ở GEN P5CS LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG VIỆT NAM

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG PHÂN LẬP, TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM Ở GEN P5CS LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2011 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Hà Tấn Thụ, Đinh Thị Kim Phương, Trần Thị Trường (2006), “Sưu tập, phân loại đánh giá chất lượng hạt số giống đậu tương địa phương tỉnh Sơn La”, Tạp chí Nông nghiệp phát triển Nông thôn, số 11 kỳ I tháng 6/2006 28-32 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thuý Hường (2006), “Thành phần axit amin khả chịu hạn số giống đậu tương địa phương tỉnh Sơn La”, Tạp chí Nông nghiệp phát triển Nông thôn, số 20 kì II tháng 10/2006 2226 Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008), "Đánh giá khả chịu hạn phân lập gen P5CS số giống đậu tương (Glycine max L.Merrili)", Tạp chí công nghệ sinh học, 6(4): 459-466 Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), "Phát triển hệ thống tái sinh invitro đậu tương (Glycine max L.Merrili) phục vụ chuyển gen", Tạp chí khoa học công nghệ Đại học Thái Nguyên 52 (4): 82-88 Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2009), "Tạo gen mã hóa Enzym P5CS (Pyroline - - carboxylate synthase) mang đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi kỹ thuật PCR" Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009: 191 - 193 Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010), "Tách dòng đánh giá hoạt động promoter cảm ứng khô hạn rd29A từ Arabidopsis thaliana", Tạp chí Công nghệ sinh học 8(4): 1805-1810 Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010), "Tạo thuốc chuyển gen P5CS đột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngược, làm tăng hàm lượng protein khả chống chịu khô hạn Hội nghị toàn quốc khoa học sống Bio-Hà Nội 2010", Tạp chí công nghệ sinh học, (3A): 539-544 Chu Hoang Mau, Nguyen thi Thuy Huong, Nguyen Tuan Anh, Chu Hoang Lan, Le van Son, Chu Hoang Ha ( 2010) Characteristic of the gene encoding pyrroline - - carboxylate synthase (P5CS) in Vietnamese sobean cultivar (Glycine max L.Merrill) 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010) IEEE: 319-323 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) trồng quan trọng không Việt Nam mà nhiều quốc gia giới Tình trạng hạn hán ảnh hưởng tới tình hình sản xuất đậu tương không Việt Nam mà nước sản xuất đậu tương hàng đầu giới Đậu tương trồng thuộc nhóm có khả chịu hạn Ở Việt Nam, nhiều giống đậu tương có khả chống chịu hạn chọn tạo thành công triển khai canh tác số địa phương Tuy nhiên phương pháp chọn giống truyền thống tốn nhiều thời gian, phức tạp cần phải có quần thể đủ lớn không ổn định Những nhược điểm phương pháp truyền thống khắc phục việc áp dụng kỹ thuật công nghệ sinh học Kỹ thuật chuyển gen thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhà khoa học giới ứng dụng đạt kết có triển vọng đậu tương Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu Trần Thị Cúc Hòa Viện Nghiên cứu lúa Đồng Sông Cửu Long thành công việc tạo giống đậu tương mang tính kháng sâu bệnh, nhiên công trình nghiên cứu chuyển gen chịu hạn vào đậu tương chưa quan tâm mức Xuất phát từ lý tiến hành đề tài luận án tiến sĩ là: “Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu 2.1 So sánh trình tự gen mã hóa P5CS giống địa phương thuộc nhóm chịu hạn tốt chịu hạn Tạo đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi prolin 2.2 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc liên quan đến tính chịu hạn đậu tương 2.3 Tạo đậu tương mang cấu trúc gen liên quan đến đặc tính chịu hạn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân tích đặc điểm sinh lý, hóa sinh số giống đậu tương trồng khu vực miền Bắc 3.2 Phân lập xác định trình tự gen mã hóa enzyme 1-pyrroline-5 carboxylate synthetase (P5CS) 3.3 Tạo đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi (feedback inhibition) prolin phương pháp tạo đột biến điểm 3.4 Phân lập promoter cảm ứng điều kiện khô hạn rd29A từ Arabidopsis thaliana Phân tích hoạt động promoter dựa vào hoạt động gen GUS dòng thuốc chuyển gen 3.5 Thiết kế cấu trúc mang gen P5CS đột biến điều khiển promoter rd29A chuyển cấu trúc vào thuốc 3.6 Phân tích tiêu hóa sinh khả chống chịu dòng thuốc điều kiện gây hạn nhân tạo 3.7 Biến nạp cấu trúc mang gen P5CS vào đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phân tích có mặt gen biến nạp Những đóng góp luận án 4.1 Gen P5CS phân lập đọc trình tự từ hai giống đậu tương Việt Nam (DT84 SL5), có kích thước 2148 nucleotit, mã hóa 715 axit amin 4.2 Đã tạo đột biến điểm định hướng ba có vị trí thứ 125 gen P5CS giống SL5, thay Asp Ala trình tự protein, loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi (feedback inhibition) 4.3 Promoter rd29A phân lập thành công từ A.thaliana, có kích thước 1298bp mang trình tự đặc trưng gồm nhân tố cis thuộc nhóm MYB, DRE, AMYBOX nhân tố đặc trưng promoter nhân tố cảm ứng điều kiện khô hạn 4.4 Thiết kế thành công cấu trúc promtor rd29A :: GUS cấu trúc rd29A::P5CSM Các cấu trúc đánh giá thuốc điều kiện hạn 4.5 Tối ưu quy trình tái sinh chuyển gen thông qua mô nách mầm đậu tương Bước đầu chuyển thành công cấu trúc gen Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn rd29A::P5CSM vào giống đậu tương DT84 thu số dòng dương tính PCR gen chuyển Ý nghĩa khoa học thực tiễn 5.1 Về khoa học, luận án công trình Việt Nam đánh giá khả chống chịu hạn giống đậu tương điều kiện gây hạn nhân tạo, phân lập thay đổi cấu trúc gen P5CS dựa vào phương pháp gây đột biến có định hướng phản ứng PCR Các kết phân tích gen P5CS khẳng định khác khả chịu hạn giống đậu tương khác nhiều yếu tố quy định, nhiên hoạt động gen P5CS giữ vai trò quan trọng tính chịu hạn trồng 5.2 Về thực tiễn, kết đánh giá hoạt động cấu trúc chuyển gen mang promoter rd29A điều khiển hoạt động gen P5CS bị gây đột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi prolin thuốc khẳng định ý nghĩa thực tiễn luận văn Khả chống chịu cải thiện rõ rệt dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc đảm bảo tính khả thi việc ứng dụng cấy trúc chuyển gen đối tượng trồng khác nhằm cải thiện tính trạng quan trọng chống chịu hạn Kết ban đầu việc thiết lập quy trình chuyển gen đậu tương tiền đề quan trọng tiến trình tạo giống đậu tương có tính chịu hạn cao Cấu trúc luận án Luận án gồm 113 trang, chia thành phần: Phần Mở đầu gồm có trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 34 trang; Chương 2: Vật liệu Phương pháp, 15 trang; Chương 3: Kết Thảo luận, 46 trang; Phân Kết luận Đề nghị: trang; Các công trình công bố tác giả: trang Tài liệu tham khảo: 11 trang; Luận án có 29 bảng số liệu, 43 hình 108 tài liệu tham khảo tiếng Việt tiếng Anh Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 64 tài liệu, có 10 tài liệu tiếng việt, 51 tài liệu tiếng Anh địa trang web vấn đề liên quan, : (1) Giới thiệu đậu tương (Glycine max (L.) Merill), Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn giá trị kinh tế giá trị sử dụng đậu tương; (2) Cơ sở sinh lý, hóa sinh đặc tính chống chịu hạn đậu tương; (3) Prolin vai trò enzym P5CS đường sinh tổng hợp prolin; (4) Promoter vai trò điều khiển hoạt động gen điều kiện hạn; (5) Những nghiên cứu nâng cao khả chịu hạn đậu tương Prolin biết đến chất đóng vai trò quan trọng trình điểu chỉnh áp suất thẩm thấu thể thực vật sống điều kiện bất lợi hạn, mặn (Delauney and Verma, 1993) Tác dụng bảo vệ cấu trúc nội bào đại phân tử tế bào gặp điều kiện bất lợi áp suất thẩm thấu; bảo vệ cấu trúc protein nâng cao hoạt tính nhiều loại enzyme khác nhau; chống oxy hóa với chức phân cắt gốc oxy phản ứng (reactive oxygen residues) bất hoạt gốc oxy tự (singlet oxygen quencher) (Szavados đtg, 2009) Ở thực vật, trình sinh tổng hợp prolin kiểm soát hoạt tính hai gen mã hóa cho enzym P5CS Hai gen có độ tương đồng cao trình tự mã hóa biểu lại khác điều kiện khác Cả hai gen P5CS hoạt động mô phân sinh hoa, chủ yếu để cung cấp prolin cho trình phát triển hoa (Mattioli đtg, 2009) Nghiên cứu Arabidopsis nhà khoa học chứng minh mối quan hệ chặt chẽ hoạt động enzme P5CS tích lũy prolin điều kiện bị xử lý mặn; hiệu ứng ức chế ngược prolin tới hoạt tính P5CS bị ảnh hưởng điều kiện bất lợi Khi chuyển gen P5CS bị gây đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược prolin vào thuốc nhà khoa học nhận dòng thuốc chuyển gen tăng cường tích lũy prolin nhiều gấp lần so với dòng thuốc chuyển gen P5CS kiểu dại Gần đây, gen P5CS phân lập thành công từ lúa chuyển trở lại lúa nhằm tăng cường hoạt động gen nhà khoa học nhận thấy tính chịu mặn chịu lạnh cải thiện rõ rệt Promoter rd29A trình tự bị cảm ứng biểu điều kiện bất lợi khô hạn, mặn, lạnh nhiều nhà khoa học quan tâm Một số nghiên cứu phát trình tự promoter rd29A chứa vùng có hoạt tính cis vùng cảm ứng ABA (ABRE) vùng cảm ứng Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn nước (DRE)/C repeat (CRT) Cả vùng liên quan đến biểu gen biểu điều kiện bất lợi môi trường (Yamaguchi-Shinozaki Shinozaki, 1993) Nhiều phòng thí nghiệm giới phân lập kiểm tra hoạt động promoter rd29A nhiều loài A thaliana, thuốc lúa mì (Sun Chen, 2002) Cấu trúc promoter RD29A điều khiển gen thị GUS chuyển vào khoai tây, mía Hoạt tính GUS phát chuyển gen điều kiện bất lợi môi trường nuôi cấy (Zhang et al., 2005) Có nhiều biện pháp cải thiện khả chịu hạn trồng, áp dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng cường khả chịu hạn thực vật quan tâm nghiên cứu Có thể nhận định tính khả thi tiềm ứng dụng phương pháp chuyển gen thực vật biện pháp nâng cao khả chịu hạn đậu tương Việt Nam cao Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị Vật liệu thực vật: 16 giống địa phương DT84; giống thuốc 326 (Nicotiana tabacum), Arabidopsis thaliana Hóa chất nghiên cứu: Vector tách dòng pBT, vector pBI101 dùng mục đích thiết kế vector chuyển gen, vector pTN 289 dùng để chuyển gen Các cặp mồi dùng để nhân gen P5CS promoter RD29A thiết kế dựa trình tự gen P5CS promoter RD29A đăng kí GeneBank với mã số: AY492005, AB428730 Các loại hóa chất dùng cho thí nghiệm nuôi cấy mô sinh học phân tử mua từ hãng hóa chất: Merk, Bioneer, Fermentas Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp sinh lý, hoá sinh - Đánh giá nhanh khả chịu hạn theo phương pháp Lê Trần Bình đồng tác giả năm 1998 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - Định lượng protein tan thực theo phương pháp Lowry Định lượng lipit mô tả tài liệu Phạm Thị Trân Châu Hàm lượng thành phần axit amin hạt theo Phạm Văn Chi đtg (1997) - Hàm lượng prolin xác định phương pháp Bates đtg (1973) - Phương pháp tính toán xử lý số liệu theo Nguyễn Hải Tuất Ngô Kim Khôi (1996) 2.2.2 Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro Arabidopsis, thuốc theo Topping ,1988 Đối với đậu tương tái sinh qua đa chồi từ nách mầm hạt chín quy trình chuyển gen vào nách mầm hạt chín tiến hành dựa phương pháp Olhoft đtg (2001) có cải tiến 2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử Thiết kế mồi dựa vào trình tự công bố GenBank Quy trình tách chiết DNA tổng số (đối với Arabidopsic thuốc lá) Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Sử dụng kit Trizol Regents (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ mẫu đậu tương theo dẫn nhà sản xuất Phương pháp tách chiết, tinh DNA RNA - Phương pháp tổng hợp cDNA RNA tổng số sử dụng để nhân gen phương pháp tổng hợp cDNA, cDNA tổng hợp theo quy trình RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) - Phản ứng PCR Chu trình nhiệt phản ứng PCR: Gen P5CS khuếch đại kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo chu trình nhiệt sau: 94ºC/5 phút;: 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 35 chu kì Tiến hành phản ứng PCR với nhiệt độ khác (từ 50 620C) để tìm nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu - Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention) Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, chu kì Sau chu kỳ lấy sản phẩm Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn đặt vào đá bổ sung 1µl BamHI 1µl SaclI thực tiếp phản ứng theo chu trình nhiệt sau: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 30 chu kì - Phương pháp tách dòng: Tách chiết plasmid tái tổ hợp thực theo Sambrook đtg (2001) tinh Plasmid Miniprep Kit (Qiagen) Phương pháp sử dụng enzym cắt hạn chế thực theo Sambrook đtg (2001) - Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) - Thiết kế cấu trúc rd29A :: GUS rd29A :: P5CSM - Các phương pháp phân tích biến nạp Kiểm tra có mặt gen chuyển phương pháp hóa sinh Cây thuốc chuyển gen sau sống nhà kính xử lý hạn nhân tạo PEG (Jun đtg 20001) Hàm lượng enzym Gus tiếp tục xác định phương pháp Tefferson đtg (1987) Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết sưu tập đánh giá giống đậu tương địa phương tỉnh Sơn La 3.1.1 Đặc điểm hình thái, hóa sinh hạt đậu tương Phát 16 giống đậu tương địa phương huyện 11 huyện thị khác tỉnh Sơn La Hàm lượng protein giống dao động khoảng 29,72%-52,75% protein/khối lượng khô Hàm lượng lipit dao động từ 9,9% - 18,65% Giống DT84 cho hàm lượng lipit cao 18,65%, đến SL3 (17,34%) 3.1.2 Kết đánh giá khả chịu hạn giống đậu tương nghiên cứu Đối với giống SL5 hàm lượng prolin tăng cao sau gây hạn ngày (tăng 377,44%) Giống DT84 có tỷ lệ tăng hàm lượng prolin ba thời điểm thấp (101,06; 129,26 146,81%) Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu tác giả loài trồng khác lúa (Nguyễn Hữu Cường đtg), (Do đtg ), Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn (Choudhary đtg 2005), họ đậu (Curtis đtg 2004), (Chen đtg 2009) 3.2 Phân lập gen P5CS đột biến điểm loại bỏ ức chế ngược 3.2.1 Kết phân lập gen P5CS 3.2.2 Kết khuếch đại, tách dòng xác định trình tự gen P5CS RNA tổng số tách chiết tổng hợp cDNA từ SL5 DT84 Bốn đoạn gen P5CS nhân lên PCR kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Kết hình 3.3 cho thấy, đoạn thu có kích thước tương ứng với kích thước tính toán theo lý thuyết Để thu gen P5CS hoàn chỉnh, hai sản phẩm PCR trộn lẫn sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi P5CSfor/P5CSrev theo phương pháp OE-PCR Sản phẩm PCR thu có kích thước khoảng 2100 bp ( Hình 3.4) M M 4 2100bp 1500bp 1000bp Hình 3.3 Kết nhân hai đoạn gen P5CS từ giống đậu tương DT84 SL5 1, 3: giống DT84; 2, 4: giống SL5; M: Thang DNA chuẩn kb Hình 3.4 Kết PCR ghép nối hai đoạn gen P5CS từ giống đậu tương DT84 SL5 1, 3: giống DT84; 2, 4: giống SL5; M: Thang DNA chuẩn kb Kết đọc trình tự gen cho thấy, sản phẩm gen tách dòng từ mẫu nghiên cứu có kích thước 2148 nucleotide, mã hoá 715 axit amin Ở vị trí 125 128 P5CS ba giống axit amin Asp Phe Đây hai vị trí gây ức chế hoạt động enzym P5CS tăng hàm lượng prolin tế bào (Zhang đtg 1995), (Hong đtg 2000) Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.2.3 Tạo đột biến điểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược P5CS phân lập từ đậu tương Kết hình 3.10 cho thấy, đoạn thu có kích thước tương ứng với kích thước tính toán theo lý thuyết Sản phẩm OE-PCR thu có kích thước khoảng 2100bp (hình 3.11) Kích thước tương ứng với kích thước gen P5CS gốc M M A B 2100bp 1800bp 400bp Hình 3.10 Điện di sản phẩm PCR Với cặp mồi P5CS M125for2/SacI-P5C; Với cặp mồi P5CS for / P5CS rev ; M : Thang DNA chuẩn kb Hình 3.11 Phản ứng nối hai đoạn gen theo phương pháp OE-PCR với cặp mồi BamHI-P5CS Sacl P5CS A, B : 1+2, M:thang DNA chuẩn kb Nhưng để biết xác gen có tạo đột biến điểm hay không cần phải đọc trình tự gen Kết thể hình 3.13 310 320 330 340 350 360 370 380 | | | | | | | | | | | | | | | | MSL5 AACAGCCTTATGGCTCTTTATGATGTTTTGTTTAGTCAGCTGGATGTGACATCTGCTCAGCTTCTTGTGACGGCCAATGA N SL5 S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T A N D A N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T D N D Hình 3.13 Phân tích, so sánh trình tự nucleotit phát đột biến vị trí nucleotit 374 gen P5CS Trình tự gen mã hoá cho protein P5CS đậu tương, qua kết đọc trình tự nhận thấy nucleotit A vị trí 374 mã ba GAC Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn thay nucleotit C mã ba GCC tương ứng trình tự protein axit amin vị trí 125 Asp thay Ala 3.3 Phân lập kiểm tra hoạt động promotor rd29A cảm ứng khô hạn 3.3.1 Phân lập promoter rd29A Trên sở trình tự gen rd29A công bố ngân hàng gen giới, cặp mồi rd29A -HindIII / rd29A -BamHI thiết kế có trình tự bảng 3.7 Cặp mồi tách promoter có kích thước 1290 bp, nằm trước codon mở đầu gen chức rd29A Bằng kỹ thuật PCR, promoter rd29A phân lập từ A thaliana sử dụng cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm kiểm tra gel agarose cho thấy có băng với kích thước khoảng 1300 bp, tương đương kích thước tính toán theo lý thuyết Hình 3.15 Điện di sản phẩm PCR cắt hạn chế vector pBT/ rd29A M) Marker; 1) sản phẩm PCR; 2) sản phẩm cắt BamHI/HindIII Sản phẩm PCR gắn vào vector tách dòng pBT biến nạp vào E coli DH5α Kết chọn dòng colony-PCR cắt plasmid enzym hạn chế BamHI/HindIII cho thấy sản phẩm có kích thước tương đương kích thước tính toán theo lý thuyết (hình 3.15) Như sản phẩm PCR ghép nối thành công vào vector tách dòng pBT 10 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.3.2 Phân tích trình tự promoter rd29A Để biết xác sản phẩm PCR tiến hành đọc trình tự nucleotide Kết thu so sánh với trình tự gen Ngân hàng gen cho thấy sản phẩm promoter rd29A A.thaliana Khi phân tích trình tự thu cho thấy promoter phân lập có chiều dài 1290 bp, chứa box trình tự cần thiết cho promoter điều hòa biểu gen TATA; CCAAT box- vùng giàu GC (GGGCCAATAG), Cap signal vùng liên quan trình phiên mã (-10 -35) Ngoài chứa vùng liên quan đến cảm ứng điều kiện khô hạn DRE, ABRE (hình 3.16) Kết phù hợp với công bố Wu đtg (2008) Shinozaki đtg (2007) Sau tách dòng xác định trình tự promoter rd29A sử dụng phần mềm chuyên dụng để phân tích trình tự đoạn promoter tách dòng Kết nhận thấy đoạn trình tự promoter rd29A phân lập nghiên cứu có chứa nhân tố cis thuộc nhóm MYB, DRE, AMYBOX Các nhân tố cis khẳng định đặc hiệu cho promoter điều khiển biểu gen điều kiện bất lợi hạn, nước mặn.Đã phân lập thành công promoter rd29A, đoạn gen dài 1290bp chứa nhân tố cis đặc hiệu, sử dụng đoạn gen để thiết kế vector phân tích trình biểu promoter điều kiện hạn gaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaac -10 agccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccga CCAAT box vùng giàu GC ctactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcaTACCGACATcag DRE-1 ttttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatacTACCGACATg -35 DRE-2 agttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacg cttcatACGTGTCcctttatctct ABRE ctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcacaaatatgca Cap signal TATA box aactagaaaacaatcatcaggaataaagggtttgattacttctattgga Hình 3.16 Phân tích trình tự promoter rd29A 11 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A Để kiểm tra khả điều khiển promoter thu được, promoter rd29A thiết kế vào vector pBI101 điều khiển biểu gen thị GUS Kết kiểm tra PCR cắt enzym hạn chế BamHI/SacI cho thấy vector tái tổ hợp thu chứa đoạn promoter rd29A (hình 3.18) có kích thước mong muốn Hình 3.18 Điện di sản phẩm PCR cắt hạn chế vector pBI101/ rd29A M) Marker; 1-2) sản phẩm PCR; 3-4) sản phẩm cắt BamHI/SacI Vector tái tổ hợp thu biến nạp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium C58, nguyên liệu cho chuyển gen vào thực vật, để đánh giá khả điều khiển promoter mức độ biểu GUS điều kiện xử lý hạn 3.3.4 Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc rd29A :: GUS Mảnh thuốc môi Mảnh ngâm Mảnh môi trường cảm ứng GM sau dịch huyền trường cộng sinh ngày phù vi khuẩn sau ngày 12 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Mảnh môi trường GM + 50 mg/l Kanamycine + 400 mg/l Cefotaxime sau tháng Cụm chồi Cây môi môi trường GM + trường RM + 50 50 mg/l mg/l Kanamycine + Kanamycine + 400 400 mg/l mg/l Cefotaxime sau Cefotaxime tháng sau tháng Ra bầu trấu: cát Trong bầu đất Ra nhà lưới Hình 3.19 Hình ảnh chuyển cấu trúc promotor rd29A vào thuốc Đánh giá hoạt động promtor RD29A thuốc chuyển gen Kết thu 51 dòng thuốc tái sinh môi trường chứa kanamycin Kiểm tra 22 dòng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu rd29A -HindIII/ rd29A -BamHI cho thấy có 21 dòng mang gen chuyển rd29A Để đánh giá hoạt động điều khiển biểu gen GUS promoter rd29A, chọn ngẫu nhiên dòng dương tính với PCR tiến hành xử lý hạn nhân tạo 10% PEG (polyethylene glycol) Kết cho thấy điều kiện thiếu nước biểu GUS dòng thuốc chuyển gen mạnh rõ ràng so với dòng chuyển gen không xử lý đối chứng (hình 3.20) 13 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 800 Lượ ng M U (p m o l/m in m g) 700 600 500 400 300 200 100 DCT DCS 3T 3S 4T 4S 5T 5S Mẫu Hình 3.20 Biểu gen GUS chuyển gen A: Cây đối chứng không chuyển gen có xử lý hạn; B: Cây chuyển gen không xử lý hạn; C: Cây chuyển gen sau xử lý hạn 24 Hình 3.21 Hoạt tính enzym GUS dòng thuốc chuyển gen mang promoter rd29A điều kiện hạn nhân tạo ĐC: mẫu đối chứng không chuyển gen; 3, 4, 5: dòng chuyển gen, T: trước xử lý hạn, S: sau xử lý hạn Hoạt tính enzym GUS xác định thông qua phản ứng chuyển hóa chất (MUG) Enzym GUS xúc tác cho phản ứng chuyển hóa MUG thành MU, hoạt tính gen enzym GUS mạnh MU tạo nhiều MU phát phép đo độ hấp thụ bước sóng 378 nm ( Fior đtg 2009) Lượng MU đo sau xử lý hạn cao so với trước xử lý hạn từ - 13 lần ( hình 3.21) Những số liệu hoàn toàn thống với công bố (Zhang đtg 2005) 3.4 Đánh giá khả tăng cường khả chịu hạn thuốc chuyển gen mang cấu trúc rd29A:: P5CSM 3.4.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A:: P5CSM Kết cắt P5CSM rd29A :: GUS BamHI SacI Và thực phản ứng ghép nối enzym T4 ligaza biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α, 14 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn M - + 1.3kb A M 12kb 3,4kb B Hình 3.23 Điện di sản phẩm clony- PCR cắt hạn chế vector pBT rd29A:: P5CSM Kết phản ứng cắt enzym giới hạn colony-PCR (Hình 3.23) khẳng định chắn dòng khuẩn lạc có chứa vector chuyển gen, nghĩa thiết kế thành công cấu trúc gen chuyển mang gen chịu hạn rd29A:: P5CSM ghép nối thành công vào vector tách dòng pBT Kết biến nạp vector chuyển gen rd29A:: P5CSM vào A tumefaciens Kết PCR điện di kiểm tra gel agarose 0,8% cho thấy: có dòng khuẩn lạc lựa chọn cho kết dương tính với phản ứng PCR với băng có kích thước khoản 1300 bp Điều chứng tỏ biến nạp thành công vector rd29A:: P5CSM vào tế bào A tumefaciens Như tạo chủng A tumefaciens pGV2260 mang plasmid tái tổ hợp rd29A:: P5CSM Đây nguồn nguyên liệu phục vụ cho mục đích chuyển gen tạo trồng chống chịu hạn 3.4.2 Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc rd29A:: P5CSM Cấu trúc chuyển gen pBI101 mang promoter rd9A điều khiển hoạt động gen P5CS chuyển vào mảnh thuốc giống K326 15 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn M - + Hình 3.25 Kết PCR dòng chuyển gen cặp mồi rd29A for /rd29Arev M: Marker DNA 1kb; 1-9: Các dòng chuyển gen; (-) Đối chứng âm; (+) Đối chứng dương Hình 3.25 cho thấy, số 33 dòng kiểm tra thu 30 dòng cho phản ứng dương tính, giếng xuất vạch AND có kích thước khoảng 1,4kb Đây kích thước tương ứng promoter rd29A Điều chứng tỏ dòng có mang cấu trúc rd29A:: P5CSM mong muốn 3.4.3 Đánh giá khả chịu hạn dòng thuốc chuyển gen Các mẫu dòng thuốc chuyển gen đối chứng thu trước gây hạn sau gây hạn 3, 5, ngày Các mẫu tách chiết kiểm tra hàm lượng prolin Kết trình bày bảng 3.7 hình 3.25 Sau gây hạn nhân tạo, hàm lượng prolin tăng mạnh so với trước gây hạn tất dòng nghiên cứu, đặc biệt dòng chuyển gen Sau ngày gây hạn, prolin đối chứng không chuyển gen tăng 206.8%, với chuyển gen tăng từ 259,5-451,8% (cao dòng H33 thấp dòng H11) 16 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 3.27 Các dòng thuốc sau 20 ngày hạn nhân tạo (A) sau phục hồi (B) WT: đối chứng không chuyển gen, H11, H15, H26, H33: dòng chuyển gen 3.5 Kết tạo đậu tương chuyển gen 3.5.1 Kết tái sinh tạo đa chồi giống đậu tương DT84 3.5.1.1 Tối ưu thời gian khử trùng hạt So sánh hai phương pháp khử trùng (bằng khí clo Javen), nhận thấy phương pháp khử trùng khí clo tỏ ưu hơn, lựa chọn phương pháp khử trùng thời gian khử trùng 16 để khử trùng hạt thu nguyên liệu cho thí nghiệm 3.5.1.2 Ảnh hưởng BAP đến khả tạo đa chồi từ mầm hạt chín Các mẫu sau gây tổn thương cắt bỏ đỉnh sinh trưởng, chúng tạo đa chồi loại môi trường (SIM0-SIM7) chứa nồng độ BAP từ 0mg/l đến 2,5 mg/l Như lựa chọn nồng độ BAP mg/l (SIM4) để bổ sung vào môi trường tạo đa chồi sử dụng kết cho thí nghiệm 3.5.1.3 Ảnh hưởng hocmon sinh trưởng GA3,tới khả kéo dài chồi Các cụm chồi tạo môi trường SIM4 chuyển sang môi trường (SEM0-SEM3) có bổ sung GA3 với nồng độ tương ứng 0,5 17 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn mg/l, mg/l 1,5 mg/l Những kết thu nhận thấy phối hợp GA3 (0,5 mg/l) thích hợp cho trình kéo dài chồi Kết phù hợp với số kết nghiên cứu tác giả khác công bố (Olhoft đtg 2007), Olhoft đtg 2001) 3.5.1.4 Ảnh hưởng IBA đến hiệu tạo rễ Nồng độ IBA nghiên cứu nhận thấy 0,1 mg/l nồng độ thích hợp cho việc rễ đậu tương in vitro giống DT84 3.5.1.5 Xác định giá thể thích hợp cho in vitro Thử nghiệm loại giá thể khác là: trấu hun, trấu hun:1 cát vàng hỗn hợp trồng có bán sẵn Hai yếu tố đánh giá thí nghiệm tỉ lệ sống chất lượng Căn vào chất lượng kết nhận thấy với tỷ lệ giá thể trấu hun: cát vàng phù hợp Sau hai tuần chuyển đất 3.5.2 Kết bước đầu chuyển gen GUS vào đậu tương DT84 Tỷ lệ biểu tạm thời gen gus thu 67,5% Tỷ lệ mẫu sống sót sau tuần môi trường chọn lọc 15,21% 3.5.3 Kết chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào đậu tương Thí nghiệm tiến hành lô thí nghiệm với tổng số 1262 mẫu sử dụng cho chuyển gen, có 564 số mẫu tạo chồi, 101 số mẫu kéo dài chồi, trình chọn lọc kháng sinh có 28 sống sót rễ trồng nhà lưới Để kiểm tra có mặt gen chuyển, sau khoảng tháng, mẫu dòng T0 tiến hành thu để tách chiết DNA tổng số Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy thu nhận dương tính với phản ứng PCR 18 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn M WT - + Hình 3.36 Kiểm tra đậu tương T0 chuyển gen PCR M: Thang DNA chuẩn 1kb; (-): Đối chứng âm; WT: Cây không chuyển gen; -4: Các dòng T0 phân tích; (+): Đối chứng dương (plasmid) Dòng 11 Dòng 23 Dòng 17 Hình 3.37 Cây đậu tương T0 chuyển gen KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Giống đậu tương địa phương sưu tập có đa dạng phong phú hình thái, kích thước khối lượng hạt Phân tích tiêu hóa sinh cho thấy giống đậu tương địa phương có chất lượng khả chịu hạn cao so với giống đối chứng Đã xác định mối liên quan tỷ lệ tăng hàm lượng prolin khả chịu hạn giống đậu tương phạm vi nghiên cứu 1.2 Trình tự gen P5CS hai giống đậu tương DT84 SL5 phân lập gồm có 2148 nucleotit, mã hóa 715 axit amin 19 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.3 Đã tạo đột biến ba có vị trí thứ 125 gen P5CS giống đậu tương SL5, thay Asp Ala trình tự protein 1.4 Promoter rd29A phân lập thành công từ A.thaliana Promotor rd29A có chiều dài 1298bp mang trình tự đặc trưng gồm nhân tố cis thuộc nhóm MYB, DRE, AMYBOX nhân tố đặc trưng promoter nhân tố cảm ứng điều kiện khô hạn 1.5 Khả hoạt động promtor rd29A đánh giá thuốc chuyển gen Trong điều kiện thiếu nước, promoter rd29A điều khiển gen thị GUS biểu mạnh rõ ràng dòng thuốc chuyển gen xử lý hạn nhân tạo so với dòng chuyển gen không xử lý đối chứng 1.6 Đối với dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc rd29A:: P5CSM , có tượng tăng cao hàm lượng prolin sau gây hạn nhân tạo, dẫn đến khả sống sót cao đối chứng (không chuyển gen) Khả phục hồi dòng chuyển gen nhanh đối chứng 1.7 Tối ưu quy trình tái sinh chuyển gen thông qua mô nách mầm đậu tương Bước đầu chuyển thành công cấu trúc gen rd29A:: P5CSM vào giống đậu tương DT84, thu số dòng dương tính PCR gen chuyển Đề nghị 2.1 Tiếp tục nghiên cứu, phân tích dòng đậu tương chuyển gen chịu hạn phục vụ cho chọn tạo giống 2.2 Mở rộng sử dụng cấu trúc promoter rd29A:: GUS rd29A:: P5CSM vào đối tượng trồng khác 20 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn [...]... gen có xử lý hạn; B: Cây chuyển gen không xử lý hạn; C: Cây chuyển gen sau xử lý hạn 24 giờ Hình 3.21 Hoạt tính của enzym GUS ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen mang promoter rd29A trong điều kiện hạn nhân tạo ĐC: mẫu cây đối chứng không chuyển gen; 3, 4, 5: các dòng cây chuyển gen, T: trước xử lý hạn, S: sau xử lý hạn Hoạt tính của enzym GUS còn được xác định thông qua phản ứng chuyển hóa cơ chất (MUG)... rd29A:: P5CSM , có hiện tượng tăng cao hàm lượng prolin sau khi gây hạn nhân tạo, dẫn đến khả năng sống sót cao hơn các cây đối chứng (không chuyển gen) Khả năng phục hồi của các dòng cây chuyển gen nhanh hơn các cây đối chứng 1.7 Tối ưu được quy trình tái sinh và chuyển gen thông qua mô nách lá mầm ở đậu tương Bước đầu chuyển thành công cấu trúc gen rd29A:: P5CSM vào giống đậu tương DT84, và thu được... wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 3.27 Các dòng cây thuốc lá sau 20 ngày hạn nhân tạo (A) và sau phục hồi (B) WT: cây đối chứng không chuyển gen, H11, H15, H26, H33: các dòng cây chuyển gen 3.5 Kết quả tạo cây đậu tương chuyển gen 3.5.1 Kết quả tái sinh tạo đa chồi ở giống đậu tương DT84 3.5.1.1 Tối ưu thời gian khử trùng hạt So sánh hai phương pháp khử trùng (bằng khí clo và bằng Javen), chúng tôi nhận thấy phương... promoter và nhân tố cảm ứng điều kiện khô hạn 1.5 Khả năng hoạt động của promtor rd29A đã được đánh giá trong cây thuốc lá chuyển gen Trong điều kiện thiếu nước, promoter rd29A đã điều khiển gen chỉ thị GUS biểu hiện khá mạnh và rõ ràng ở các dòng thuốc lá chuyển gen được xử lý bởi hạn nhân tạo so với các dòng cây chuyển gen không xử lý và cây đối chứng 1.6 Đối với các dòng cây thuốc lá chuyển gen mang... clony- PCR và cắt hạn chế vector pBT rd29A:: P5CSM Kết quả của phản ứng cắt bằng enzym giới hạn và colony-PCR (Hình 3.23) đã khẳng định chắc chắn cả 3 dòng khuẩn lạc đều có chứa vector chuyển gen, nghĩa là chúng tôi đã thiết kế thành công cấu trúc gen chuyển mang gen chịu hạn rd29A:: P5CSM được ghép nối thành công vào vector tách dòng pBT Kết quả biến nạp vector chuyển gen rd29A:: P5CSM vào A tumefaciens... kiểm tra hàm lượng prolin Kết quả trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.25 Sau khi gây hạn nhân tạo, hàm lượng prolin tăng rất mạnh so với trước gây hạn ở tất cả các dòng cây nghiên cứu, đặc biệt các dòng cây chuyển gen Sau 9 ngày gây hạn, prolin ở cây đối chứng không chuyển gen tăng 206.8%, trong khi đó với cây chuyển gen tăng từ 259,5-451,8% (cao nhất ở dòng H33 và thấp nhất dòng H11) 16 Tai lieu chia se... 3.5.3 Kết quả chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào đậu tương Thí nghiệm được tiến hành trên 3 lô thí nghiệm với tổng số 1262 mẫu được sử dụng cho chuyển gen, có 564 số mẫu tạo chồi, 101 số mẫu kéo dài chồi, trong quá trình chọn lọc kháng sinh có 28 cây sống sót ra rễ và trồng ở nhà lưới Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển, sau khi ra cây khoảng 1 tháng, mẫu lá của các dòng cây T0 được tiến hành thu để... Giống đậu tương địa phương sưu tập được có sự đa dạng và phong phú về hình thái, kích thước và khối lượng hạt Phân tích về chỉ tiêu hóa sinh cho thấy các giống đậu tương địa phương có chất lượng và khả năng chịu hạn cao hơn so với giống đối chứng Đã xác định được mối liên quan giữa tỷ lệ tăng hàm lượng prolin và khả năng chịu hạn của các giống đậu tương trong phạm vi nghiên cứu 1.2 Trình tự gen P5CS. .. trong thí nghiệm này là tỉ lệ sống của cây con và chất lượng cây con Căn cứ vào chất lượng cây con kết quả nhận thấy với tỷ lệ giá thể là 1 trấu hun: 1 cát vàng là phù hợp Sau hai tuần chúng tôi chuyển ra đất 3.5.2 Kết quả bước đầu chuyển gen GUS vào cây đậu tương DT84 Tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus thu được là 67,5% Tỷ lệ mẫu sống sót sau 2 tuần trên môi trường chọn lọc là 15,21% 3.5.3 Kết quả chuyển. .. công cấu trúc gen rd29A:: P5CSM vào giống đậu tương DT84, và thu được một số dòng dương tính PCR đối với gen chuyển 2 Đề nghị 2.1 Tiếp tục nghiên cứu, phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen chịu hạn phục vụ cho chọn tạo giống 2.2 Mở rộng sử dụng cấu trúc promoter rd29A:: GUS và rd29A:: P5CSM vào các đối tượng cây trồng khác 20 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn