dự thảo Luận án Tiến sĩ Sinh học Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật

Header Page of 258 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Duy Phƣơng PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HĨA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Footer Page of 258 Header Page of 258 Cơng trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Xuân Hội GS.TS Phan Tuấn Nghĩa Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án đƣợc bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Quốc gia họp tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội vào hồi ., ngày .tháng .năm 2015 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội Footer Page of 258 Header Page of 258 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hạn yếu tố môi trƣờng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, làm giảm suất, sản lƣợng trồng dẫn tới tình trạng an ninh lƣơng thực Đặc biệt, bối cảnh biến đổi khí hậu tồn cầu, tình trạng hạn hán xảy ngày thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày trầm trọng, nhiều lúc vƣợt tầm kiểm soát ngƣời Chính vậy, việc nghiên cứu gen liên quan tới tính kháng hạn để tiến tới tạo giống trồng biến đổi gen có khả chịu hạn có ý nghĩa đặc biệt quan trọng việc trì tăng sản lƣợng nơng nghiệp, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng thực quốc gia Tính trạng chịu hạn tính trạng đa gen biểu gen liên quan chặt chẽ với trình phiên mã Các nhà khoa học chứng minh đƣợc chức quan trọng nhóm gen điều khiển việc tăng cƣờng tính chịu hạn thực vật Do đó, việc nghiên cứu phân lậ c đặ ố phiên mã liên quan đến chịu hạn trở thành xu hƣớng triển vọng nhận đƣợc quan tâm đặc biệt Hàng loạt gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn đƣợc xác định chuyển vào giống trồng khác Các gen mã hóa nhân tố phiên mã khơng tham gia trực tiếp vào trình đáp ứng với điều kiện hạn nhƣng biểu chúng lại có vai trị điều hịa biểu nhiều gen chức khác, dẫn tới làm tăng cƣờng khả chịu hạn thực vật Nhiều trồng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã đƣợc chứng minh tăng cƣờng khả chịu hạn so với không chuyển gen Footer Page of 258 Header Page of 258 Ở Việt Nam, chƣa có nghiên cứu hoàn chỉnh phân lập nghiên cứu chức gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn thực vật, đặc biệt nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã Xuất phát từ trên, tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Phân lập nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn thực vật” với mục tiêu xác định gen mã hóa nhân tố phiên mã có liên quan tới tăng cƣờng tính chống chịu hạn thực vật Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Phân lập xác định trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển tính chịu hạn từ lúa - Nghiên cứu số đặc tính gen mã hóa nhân tố phiên mã phân lập đƣợc lúa chuyển gen mơ hình Đối tƣợng nội dung nghiên cứu đề tài Đối tượng nghiên cứu đề tài: Gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu stress hạn lúa Oryza sativa L Nội dung nghiên cứu đề tài: - Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chống chịu điều kiện bất lợi lúa - Nghiên cứu đặc điểm chức protein OsNLI-IF - Thiết kế hệ vector biểu gen OsNLI-IF tế bào thực vật - Nghiên cứu biểu OsNLI-IF chuyển gen mơ hình Địa điểm thực đề tài Các nghiên cứu luận án đƣợc thực Bộ môn Bênh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Footer Page of 258 Header Page of 258 Việt Nam), e Phịng Thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật thuộc Trung tâm Kỹ thuật Di truyền Công nghệ Sinh học Quốc tế (New Delhi, Ấn Độ) Đóng góp đề tài Luận án cơng trình Việt Nam thực cách có hệ thống nghiên cứu theo định hƣớng ứng dụng gen OsNLI-IF chƣa đƣợc xác định chức Gen OsNLI-IF đƣợc chứng minh mã hóa nhân tố phiên mã hoạt động cảm ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao có khả tăng cƣờng tính chịu hạn chuyển gen mơ hình (thuốc lá/ lúa) Ngoài ra, vector biểu gen OsNLI-IF đƣợc điểu khiển promoter hoạt động liên tục (35S Ubiquitin) hoạt động điều kiện stress (Lip9) đƣợc chuyển vào mơ hình để nghiên cứu biểu gen Chính vậy, kết nghiên cứu luận án hoàn toàn mới, có giá trị khoa học ý nghĩa thực tiễn công tác chọn tạo giống trồng chuyển gen Ứng dụng thực tiễn đề tài Kết nghiên cứu luận án lần chứng minh vai trị tăng cƣờng tính chịu hạn gen OsNLI-IF dòng chuyển gen Trên sở kết luận án, vector biểu gen OsNLI-IF luận án tạo đƣợc nghiên cứu chuyển vào giống trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu tƣơng, bông… để chọn tạo giống chuyển gen kháng hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết sản xuất điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu Bố cục luận án Luận án gồm 179 trang bao gồm: Phần mở đầu (03 trang); Tổng quan tài liệu (41 trang); Nguyên liệu phƣơng pháp nghiên cứu (28 Footer Page of 258 Header Page of 258 trang); Kết nghiên cứu thảo luận (70 trang); Kết luận (02 trang); Kiến nghị (01 trang); Các cơng trình khoa học tác giả liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (18 trang), tài liệu gồm thứ tiếng tiếng Việt (17 ) tiếng Anh (160 ); Phụ lục (06 trang) Luận án có 11 bảng, 45 hình Footer Page of 258 177 Header Page of 258 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT Hạn thực vật khái niệm đƣợc dùng để trạng thái thiếu nƣớc môi trƣờng gây nên suốt trình sống hay giai đoạn sống, làm ảnh hƣởng đến trình sinh trƣởng phát triển thực vật Môi trƣờng khô hạn gây hàng loạt tác động tiêu cực tới thực vật tất cấp độ, từ hình thái tới phân tử tất giai đoạn phát triển Để đối phó với điều kiện hạn hán, thực vật khởi động chế phòng vệ chống lại thiếu hụt nƣớc, sau loạt chế cấp độ khác Đáp ứng chống chịu stress hạn thực vật đƣợc thực thơng qua chuỗi q trình phức tạp với tham gia hàng loạt yếu tố chia thành giai đoạn: nhận tín hiệu – dẫn truyền tín hiệu – đáp ứng chống chịu khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu 1.2 ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN Ở THỰC VẬT Thực vật thích nghi với mơi trƣờng sống nhờ khả điều hòa nhanh biểu gen chức Q trình điều hịa biểu gen đóng vai trị quan trọng đáp ứng thực vật với điều kiện stress phi sinh học, có hạn hán Các nghiên cứu gần chứng minh stress hạn tác động tới tất bƣớc q trình điều hịa hoạt động gen thực vật, bao gồm: điều hịa q trình phiên mã, điều hòa sau phiên mã, điều hòa trình dịch mã, điều hịa sau dịch mã, điều hịa hoạt động gen thông qua phân tử RNA không mã hóa yếu tố di truyền ngoại sinh (ví dụ nhƣ q trình methyl hóa DNA hay q trình biến đổi histone) Footer Page of 258 Header Page of 258 1.3 VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TRONG ĐÁP ỨNG STRESS HẠN Trong hệ gen thực vật có khoảng 7% gen mã hóa nhân tố phiên mã (TF), số có nhiều gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress Các TF tham gia mạng lƣới điều hòa hoạt động gen đáp ứng stress hạn biết đƣợc xác định thuộc hầu hết nhóm TF lớn thực vật, đƣợc nghiên cứu nhiều nhóm AP2/ERF, NAC, WRKY, MYB/MYC, bZIP hay ZF 1.4 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA LÚA BẰNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT Việc phát triển giống lúa chịu hạn giảm lƣợng nƣớc tiêu thụ sản xuất lúa gạo có ý nghĩa vô to lớn để tăng sản lƣợng đảm bảo an ninh lƣơng thực Một hƣớng nghiên cứu phổ biến đƣợc quan tâm tăng cƣờng biểu gen đáp ứng liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn lúa chuyển gen Do chế chống chịu hạn phức tạp thực vật, việc sử dụng gen điều hòa (mã hóa protein tham gia vào mạng lƣới điều hịa đáp ứng stress) nghiên cứu chuyển gen tạo giống lúa chịu hạn thƣờng mang lại hiệu cao so với gen chức (mã hóa protein/ enzyme trực tiếp tham gia vào đáp úng chống chịu stress) Tuy nhiên, có vài nghiên cứu chứng minh khả chịu hạn dòng lúa chuyển gen điều kiện thử nghiệm đồng ruộng Ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu hoàn chỉnh gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress thực vật, đặc biệt nhóm gen mã hố nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn lúa Footer Page of 258 Header Page of 258 Chƣơng VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Thƣ viện cDNA sơ cấp lúa Oryza sativa L xử lý điều kiện ấp Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di hạn mặn truyền Nông nghiệp Hạt lúa PB1 hạt thuốc Nicotiana tabacum (L.) doTrung tâm Kỹ thuật Di truyền & Công nghệ sinh học Quốc tế (Ấn Độ) cung cấp 2.1.2 Chủng vi sinh vật Chủng vi khuẩn E coli DH5α đƣợc mua từ hãng Fermentas (Mỹ); chủng vi khuẩn E coli XLOR, XL1-Blue MRF phage “trợ giúp” đƣợc mua từ Công ty Agilent Technologies (Mỹ); chủng vi khuẩn E coli Rosetta (DE3) khả biến đƣợc mua từ Công ty Merck Millipore (Mỹ); chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA4404 khả biến, chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae YM4271 AH109 đƣợc mua từ Công ty Clontech (Mỹ) 2.1.3 Vector oligonucleotide Các vector pLacZi/JRC0332, pLacZi/JRC0528, pLacZi/JRC2606, pHISi/JRC0332, pHISi/JRC0528, pHISi/JRC2606 nhóm nghiên cứu Phạm Xuân Hội thiết kế cung cấp; vector YEpGAP, pBILip9, pBI-Ubi nhóm nghiên cứu Kazuko YamaguchiShinozaki thiết kế cung cấp; vector pAD-GAL4, pGBKT7 đƣợc mua từ Công ty Clontech; vector pET28a đƣợc mua từ hãng Novagen, vector pRT101 nhóm nghiên cứu Reinhard Topfer thiết kế; vector pCAMBIA1301 đƣợc mua từ Công ty Marker Gene Technologies; vector pGEM-T đƣợc mua hãng Promega Các cặp oligonucleotide đầu dò sử dụng làm mồi Footer Page of 258 Header Page 10 of 258 đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) Sigma (Mỹ) 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Xử lý mẫu thực vật theo phƣơng pháp Qin (2007), Dubouzet (2003) Tran (2004) - Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA - Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T - Thiết kế vector biểu gen OsNLI-IF Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-35S/OsNLI-IF Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế vector pBI-Lip9 pBI-Ubi - Sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA kỹ thuật lai phân tử tế bào nấm men - Tạo kháng thể đa dòng kháng protein OsNLI-IF tái tổ hợp - Tạo chuyển gen biểu OsNLI-IF Footer Page 10 of 258 Header Page 14 of 258 ngun sinh trƣởng đƣợc mơi trƣờng chọn lọc thể hoạt tính β-galactosidase (Hình 3.17B) Kết chứng tỏ protein dung hợp AD-OsNLI-IF liên kết đặc hiệu với đoạn DNA chứa hai motif CCTCCTCC CTCCAC hoạt hố q trình phiên mã gen thị 3.2.3 Hoạt tính hoạt hóa phiên mã OsNLI-IF Hoạt tính hoạt hóa phiên mã OsNLI-IF đƣợc phân tích kỹ thuật Y1H Đoạn gen OsNLI-IF đƣợc ghép nối vào vector biểu YEpGAP biến nạp vào chủng tế bào nấm men thị YM4271 Hình 3.20: Hoạt tính hoạt hóa phiên mã OsNLI-IF Ghi chú: (A) Sơ đồ bố trí thí nghiệm chủng nấm men mang cấu trúc khác (B) Môi trường YPD (C) Môi trường SD/-Leu/-Ura/-His (D) Môi trường SD/-Leu/-Ura/-His có 3-AT 30 mM (E) Hoạt tính biến đổi chất X-Gal β-galactosidase (ĐC+): đối chứng dương; (YM4271-WT): nấm men YM4271 nguyên bản; (OsNLI-IF): nấm men mang YEpGAP/OsNLI-IF; (JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332; (Vector + JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332 + YepGAP; (OsNLI-IF + JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332 + YepGAP/OsNLI-IF Kết thu đƣợc cho thấy có chủng nấm men mang đồng thời YEpGAP/OsNLI-IF vector thị chứa đoạn DNA đích JRC0332 vùng điều khiển gen HIS3 lacZ sinh trƣởng mơi trƣờng chọn lọc biến đổi chất X-Gal để tạo thành màu xanh (Hình 3.20D & E) Kết chứng tỏ protein OsNLI-IF tƣơng tác với đoạn DNA đích JRC0332 hoạt động 12 Footer Page 14 of 258 Header Page 15 of 258 nhƣ nhân tố hoạt hố q trình phiên mã 3.2.4 Nghiên cứu protein tƣơng tác với OsNLI-IF Protein tƣơng tác với OsNLI-IF đƣợc sàng lọc từ thƣ viện cDNA xử lý stress hạn mặn lúa, sử dụng kỹ thuật Y2H Đoạn gen OsNLI-IF đƣợc ghép nối với trình tự mã hoá domain liên kết DNA BD-GAL4 vector biểu pGBKT7 biến nạp đồng thời thƣ viện cDNA vào tế bào nấm men AH109 để thực thí nghiệm sàng lọc gen Sau sàng lọc thể biến nạp, chúng tơi thu đƣợc tám dịng cDNA dƣơng tính, có hai dịng mã hóa cho protein ubiquitin, cho thấy q trình ubiquitin hóa bƣớc biến đổi sau phiên mã protein OsNLI-IF (Bảng 3.4) Bảng 3.4: Protein tƣơng tác OsNLI-IF sàng lọc từ thƣ viện Protein tƣơng tác OsNLI-IF Số khuẩn lạc Polyubiquitin Protein kép chứa domain phosphatase Protein liên kết kẽm, nhóm Alcohol dehydrogenase Protein chƣa đƣợc nghiên cứu Protein liên kết chlorophyll a/b nhóm I, tiền chất chloroplast Cyclophilin U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase 1 1 Nhƣ vậy, thí nghiệm in vivo cho thấy OsNLI-IF nhân tố phiên mã đƣợc biểu rễ dƣới điều kiện stress hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao, nƣớc, tƣơng tác với vùng promoter chứa hai motif CCTCCTCC CTCCAC, điều hịa q trình phiên mã gen đích liên quan tới q trình ubiquitin hóa 3.3 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT 3.3.1 Thiết kế hệ vector chuyển gen pCAMBIA1301 Vector pCAMBIA1301 mang cấu trúc biểu gen 35S:OsNLI13 Footer Page 15 of 258 Header Page 16 of 258 IF:Nos đƣợc thiết kế theo sơ đồ hình 2.2, sử dụng vector pGEM/OsNLI-IF vector trung gian pRT101 mang promoter 35S Hình 3.28: Kiểm tra pCAM/OsNLI-IF-S pCAM/OsNLI-IF-AS Ghi chú: (A) Vector pCAM/OsNLI-IF-S; (B) Vector pCAM/OsNLI-IF-AS Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng 1: PCR với cặp mồi EcoRI-NLIFw/XhoI-NLI-Rv; giếng 2: PCR với cặp mồi 35S-Fw/GUS-Rv; giếng 3(A): PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 3(B): PCR với cặp mồi 35SFw/EcoRI-NLI-Fw; giếng 4: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 5: sản phẩm cắt giới hạn HindIII; giếng 6: vector nguyên bản; giếng 7: sản phẩm cắt giới hạn EcoRI Để khẳng định kết thu đƣợc, plasmid tái tổ hợp đƣợc tinh từ khuẩn lạc dƣơng tính kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu khác enzyme cắt giới hạn HindIII EcoRI Kết điện di sản phẩm PCR cắt giới hạn cho thấy băng DNA thu đƣợc phù hợp với kich thƣớc tính tốn lý thuyết (Hình 3.28), chứng tỏ thiết kế thành công vector biểu pCAMBIA1301 mang trình tự có nghĩa (sense) hay đối nghĩa (antisense) gen OsNLI-IF, đặt dƣới điều khiển promoter 35S 3.3.2 Thiết kế hệ vector chuyển gen pBI101 Để thiết kế hệ vector biểu pBI101, gen OsNLI-IF đƣợc nhân phản ứng PCR ghép nối lần lƣợt vào hai vector pBI-Lip9 pBI-Ubi đƣợc xử lý enzyme cắt đầu SmaI (Hình 2.3) 14 Footer Page 16 of 258 Header Page 17 of 258 Hình 3.31: Kiểm tra pBI-Ubi/OsNLI-IF pBI-Ubi/OsNLI-IF Ghi chú: (A) Giếng – 3: khuôn pBI-Ubi/OsNLI-IF; giếng – 6: khuôn pBI-Lip9/OsNLI-IF; giếng 1: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Fw; giếng & 5: PCR với cặp mồi SmaI-NLI-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 3: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 4: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/ SmaI-NLI-Fw; giếng 6: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/SmaI-NLI-Rv (B) Giếng & 2: pBI-Ubi/OsNLI-IF; giếng & 4: pBI-Lip9/OsNLI-IF; giếng & 3: sản phẩm cắt giới hạn SmaI; giếng & 4: vector nguyên Giếng M: thang chuẩn DNA kb Để khẳng định kết thu đƣợc, plasmid tái tổ hợp đƣợc tinh từ khuẩn lạc dƣơng tính kiểm tra lần lƣợt PCR với cặp mồi đặc hiệu khác nhau, cắt giới hạn enzyme SmaI giải trình tự gen Kết kiểm tra cho thấy trình tự mã hóa cho nhân tố phiên mã OsNLI-IF đƣợc ghép nối thành công vào hệ vector biểu pBI101, đặt dƣới điều khiển promoter Lip9 Ubiquitin (Hình 3.31) 3.4 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG CÂY CHUYỂN GEN 3.4.1 Nghiên cứu biểu OsNLI-IF thuốc Thí nghiệm biến nạp cấu trúc 35S:OsNLI-IF vector pCAMBIA1301 khơng mang gen đích vào thuốc đƣợc tiến hành dựa phƣơng pháp chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium Dựa vào kết phân tích dịng thuốc T1 phƣơng pháp ni cấy mơi trƣờng có hygromycin phƣơng 15 Footer Page 17 of 258 Header Page 18 of 258 pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cấu trúc biểu gen, năm dòng (TL1, TL3, TL4, TL7, TL8) mang cấu trúc 35S:OsNLI-IF bốn dòng (ĐC2, ĐC3, ĐC8, ĐC9) mang cấu trúc pCAMBIA1301 đƣợc chọn để tiếp tục phân tích (Bảng 3.7) Bảng 3.7: Kết phân tích PCR dịng thuốc T1 Số có kết PCR dƣơng tính Dịng Số cây kiểm tra Mồi Actin Mồi Hygromycin Mồi GUS Mồi OsNLI-IF TL1 20 20/20 18/20 18/20 18/20 TL3 20 20/20 15/20 15/20 15/20 TL4 20 20/20 20/20 20/20 20/20 TL7 20 20/20 17/20 17/20 17/20 TL8 20 20/20 12/20 12/20 12/20 TL10 20 20/20 18/20 18/20 18/20 ĐC2 10 10/10 8/10 8/10 0/10 ĐC3 10 10/10 6/10 6/10 0/10 ĐC8 10 10/10 8/10 8/10 0/10 ĐC9 10 10/10 10/10 10/10 0/10 TL: Dòng thuốc chuyển cấu trúc pCAM-35S/OsNLI-IF ĐC: Dòng thuốc chuyển cấu trúc pCAMBIA1301 Sự có mặt protein OsNLI-IF dòng thuốc chuyển gen T1 đƣợc phát kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể đa dòng chuột kháng OsNLI-IF (tạo từ protein OsNLIIF tái tổ hợp) Kết thu đƣợc cho thấy dòng TL1 TL8 biểu OsNLI-IF mạnh nhất; dòng TL3 TL7 biểu vừa phải, dòng TL10 biểu thấp nhất, dòng TL4 dịng thuốc đối chứng hồn tồn khơng biểu protein đích (Hình 3.39) Nhƣ vậy, chúng tơi chuyển thành công cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào thuốc thu đƣợc dịng T1 có biểu protein đích OsNLI-IF Ba dịng thuốc TL1, TL4 TL10 đại diện cho ba mức độ biểu gen đích OsNLI-IF đƣợc chọn để phân tích khả sinh trƣởng 16 Footer Page 18 of 258 Header Page 19 of 258 chống chịu stress hạn Kết quan sát thuốc giai đoạn bốn tuần tuổi cho thấy khơng có khác biệt đáng kể hình thái tốc độ sinh trƣởng thuốc đối chứng thuốc chuyển gen đích, nhiên tốc độ sinh trƣởng chuyển gen tỉ lệ nghịch với mức độ biểu gen OsNLI-IF (Hình 3.40) Hình 3.39: Biểu OsNLI-IF thuốc T1 Ghi chú: (A) Giếng M: thang chuẩn protein; giếng – & – 7: dịch chiết protein tổng số dòng thuốc TL1, TL3, TL4, TL7, TL8, TL10; giếng 4: protein OsNLI-IF tái tổ hợp (P); giếng 8: dịch chiết protein tổng số dòng thuốc ĐC8 (V); giếng 9: dịch chiết protein tổng số thuốc không chuyển gen (WT) (B) Đồ thị so sánh hàm lượng protein OsNLI-IF tương quan dòng cây; hàm lượng OsNLI-IF dịch chiết protein tổng số dòng TL10 có giá trị Hình 3.40: Khả sinh trƣởng thuốc T1 Ghi chú: Hình thái dịng thuốc sinh trưởng giai đoạn tuần tuổi (WT) thuốc dại; (V) dòng thuốc mang cấu trúc pCAMBIA1301; (TL1, TL4, TL10) dòng thuốc mang cấu trúc 35S:OsNLIIF:Nos 17 Footer Page 19 of 258 Header Page 20 of 258 Để đánh giá khả chống chịu stress hạn dòng thuốc chuyển gen, thuốc chuyển gen T1 đƣợc trồng điều kiện stress hạn giả định (khơng tƣới nƣớc) tháng, sau tƣới nƣớc trở lại quan sát khả phục hồi Kết trình bày bảng 3.8 cho thấy dịng TL10 biểu protein OsNLI-IF mức độ thấp có khả chống chịu hạn cao (75% phục hồi) Khả chịu hạn dòng thuốc TL1 (có gen OsNLI-IF biểu mạnh) thấp so với dòng thuốc TL10 (56% phục hồi) Đặc biệt, tỉ lệ sống sót thuốc có biểu OsNLIIF cao rõ rệt so với dòng thuốc đối chứng khơng chuyển gen (16%) dịng thuốc đƣợc chuyển cấu trúc vector pCAMBIA1301 không mang gen (dòng ĐC2) hay dòng thuốc đƣợc chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF nhƣng khơng biểu gen đích Bảng 3.8: Tỉ lệ phục hồi sau xử lý hạn dịng thuốc Số sống sót/Số kiểm tra Cấu trúc biểu Dịng thuốc Khơng tƣới Tƣới nƣớc1 gen nƣớc2 35/35 6/36 Đối chứng Không chuyển gen (100%) (16%) 36/36 3/36 ĐC2 pCAMBIA1301 (100%) (8%) 35/36 20/36 TL1 35S:OsNLI-IF (97%) `(56%) 36/36 8/36 TL4 35S:OsNLI-IF (100%) (22%) 36/36 27/36 TL10 35S:OsNLI-IF (100%) (75%) Ghi chú:(1)Cây thuốc trồng chậu đất tưới nước hàng ngày; (2)Cây thuốc trồng chậu đất không tưới nước liên tục tháng, sau tưới nước trở lại liên tục ngày 18 Footer Page 20 of 258 Header Page 21 of 258 3.4.2 Nghiên cứu biểu OsNLI-IF lúa chuyển gen Để nghiên cứu vai trò nhân tố phiên mã OsNLI-IF, thí nghiệm chuyển vector biểu mang gen OsNLI-IF không mang gen vào giống lúa Indica đƣợc thực Trong điều kiện nhà kính, có 16 dòng lúa chuyển gen mang cấu trúc Ubi:OsNLIIF kết hạt cho T1 Dựa kết phân tích chuyển gen, số lúa chuyển gen T1 có mang cấu trúc Ubi:OsNLI-IF biểu gen kháng hygromycin đƣợc xác định (Bảng 3.10) Bảng 3.10: Kết sàng lọc dòng lúa chuyển gen T1 Số hạt Số hạt nảy Số có kết PCR dƣơng tính Tên kiểm mầm dịng tra Hygromycin Mồi Actin Mồi Hygromycin Mồi OsNLI-IF L1 10 7/7 7/7 7/7 L2 10 5/5 5/5 5/5 L3 10 8/8 6/8 6/8 L4 3/3 3/3 3/3 L5 10 9/9 7/9 7/9 L6 10 4/4 3/4 3/4 L7 10 7/7 7/7 7/7 L8 10 7/7 6/7 6/7 L9 10 5/5 5/5 5/5 L10 10 5/5 5/5 5/5 L11 6/6 4/6 4/6 L12 10 3/3 3/3 3/3 L13 10 8/8 7/8 7/8 L14 10 8/8 8/8 8/8 L15 3/3 3/3 3/3 L16 10 7/7 7/7 7/7 Kết Real-time PCR xác định mức độ tích luỹ mRNA OsNLIIF mơ lúa chuyển gen T1 cho thấy OsNLI-IF biểu tất 16 dòng lúa chuyển gen, chia thành nhóm: biểu yếu (L1, L3, L5, L6, L7, L8, L10, L11), biểu trung bình (L4, L9, L 13, L16) biểu mạnh (L2, L12, L14 L15 ) (Hình 3.43) 19 Footer Page 21 of 258 Header Page 22 of 258 Hình 3.43: Mức độ biểu OsNLI-IF lúa T1 Ghi chú: Mức độ biểu gen chuyển dòng lúa chuyển gen (L – L16) dịng lúa khơng chuyển gen đối chứng (WT) Mức độ biểu gen lúa dại có giá trị Gen actin sử dụng làm gen nội chuẩn Giá trị thể đồ thị kết trung bình lần lặp lại thí nghiệm Trong thí nghiệm khơng xử lý stress hạn, lúa chuyển gen T1 sinh trƣởng bình thƣờng khơng thể đặc điểm hình thái khác biệt rõ rệt so với không chuyển gen giai đoạn mầm, tốc độ sinh trƣởng chậm (Hình 3.44) Đặc biệt, thí nghiệm xử lý điều kiện hạn cách ngừng tƣới nƣớc tuần cho thấy tất dòng lúa chuyển gen mang cấu trúc Ubi:OsNLI-IF đƣợc kiểm tra thể tính chịu hạn tốt so với dịng đối chứng khơng chuyển gen Trong thí nghiệm xử lý stress hạn cách ngừng tƣới nƣớc ba tuần liên tục ba dòng lúa chuyển gen đại diện cho ba nhóm biểu gen OsNLI-IF mức độ khác (L1 – biểu gen yếu, L13 – biểu gen trung bình, L14 – biểu gen mạnh), có dịng L1 phục hồi sinh trƣởng trở lại sau stress (Bảng 3.11, Hình 3.45) Nhƣ vậy, kết nghiên cứu biểu gen OsNLI-IF chuyển gen mô hình (thuốc lúa) chứng tỏ biểu liên tục gen OsNLI-IF dƣới điều khiển promoter hoạt 20 Footer Page 22 of 258 Header Page 23 of 258 động mạnh (35S hay Ubiquitin) tăng cƣờng khả chịu hạn dòng chuyển gen mức độ chống chịu hạn dòng chuyển gen tỉ lệ nghịch với mức độ biểu gen đích Hình 3.44: Hình thái lúa chuyển gen giai đoạn mầm Ghi chú: (WT) Cây lúa dại không chuyển gen sau tuần gieo hạt (L1 – L16) Các dòng lúa chuyển gen T1 sau – tuần gieo hạt Bảng 3.11: Tỉ lệ lúa chuyển gen phục hồi sau xử lý hạn Tỉ lệ phục hồi* Ngừng tƣới nƣớc tuần Ngừng tƣới nƣớc tuần WT 0/5 0/5 L1 5/5 3/5 L4 4/5 L6 5/5 L7 5/5 L8 5/5 L12 3/5 L13 4/5 0/5 L14 4/5 0/5 Ghi chú: (WT) Dịng lúa khơng chuyển gen; (L1-14) Các dòng lúa chuyển gen; (*) Số phục hồi sau xử lý stress hạn tổng số kiểm tra; (-) Khơng tiến hành thí nghiệm Tên dịng 21 Footer Page 23 of 258 Header Page 24 of 258 Hình 3.1: Phục hồi sau stress hạn lúa chuyển gen Ghi chú: (A) Cây lúa non mầm trồng điều kiện không tưới nước liên tục tuần tưới nước trở lại ngày (B) Cây lúa non mầm trồng điều kiện không tưới nước liên tục tuần tưới nước trở lại ngày WT: lúa dại (không chuyển gen); L1, L6 L7: dòng lúa chuyển gen T1 biểu OsNLI-IF mức thấp; L4, L8 L13: dòng lúa chuyển gen T1 biểu OsNLI-IF mức thấp trung bình; L12 L14: dịng lúa chuyển gen T1 biểu OsNLI-IF mức cao Hình trái: vị trí xếp dịng lúa; hình phải: ảnh chụp lúa sau ngày tưới nước phục hồi 22 Footer Page 24 of 258 Header Page 25 of 258 KẾT LUẬN hân lập đƣợc gen OsNLI-IF (mã số NM_001050330.1) từ - thƣ viện cDNA xử lý hạn mặn lúa phƣơng pháp lai phân tử tế bào nấm men nhân dịng thành cơng vào vector pGEM-T Trình tự gen OsNLI-IF phân lập đƣợc có kích thƣớc 1850 bp, mang vùng khơng mã hóa đầu 5’ dài 311 bp, vùng khơng mã hóa đầu 3’ dài 219 bp vùng ORF dài 1320 bp mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 439 axit amin - Nghiên cứu biểu gen điều kiện môi trƣờng bất lợi cho thấy OsNLI-IF cảm ứng với yếu tố stress hạn, mặn, lạnh nhiệt độ cao theo đƣờng điều hịa khơng phụ thuộc ABA Các nghiên cứu tƣơng tác phân tử tế bào nấm men chứng tỏ OsNLI-IF nhân tố phiên mã có khả liên kết đặc hiệu với đoạn DNA chứa hai motif CCTCCTCC & CTCCAC, hoạt hóa q trình phiên mã gen đích tƣơng tác với protein ubiquitin - Đã thiết kế thành công cấu trúc biểu gen OsNLI-IF tế bào thực vật, đƣợc điều khiển promoter hoạt động liên tục 35S Ubiquitin promoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress Lip9 Các vector biểu gen OsNLI-IF đƣợc biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium chủng LBA4404 để phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen thực vật - Đã chuyển thành công cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào thuốc lá, cấu trúc Ubi:OsNLI-IF vào lúa xác định đƣợc có mặt cấu trúc biểu gen chuyển dòng chuyển gen T0 T1 phƣơng pháp PCR sàng lọc mơi trƣờng ni cấy có Hygromycin Biểu gen chuyển OsNLI-IF 23 Footer Page 25 of 258 Header Page 26 of 258 chuyển gen T1 đƣợc chứng minh phƣơng pháp lai thẩm tách miễn dịch (đối với thuốc lá) Real-time PCR (đối với lúa) Các dòng thuốc lúa chuyển gen T1 có tốc độ sinh trƣởng chậm so với dòng đối chứng điều kiện bình thƣờng Trong thí nghiệm xử lý stress hạn (ngừng tƣới nƣớc), chuyển gen thể khả chống chịu cao rõ rệt so với đối chứng Tỉ lệ thuốc chuyển gen sống sót đạt 22 – 75% so với – 16% đối chứng; tỉ lệ lúa chuyển gen sống sót đạt 60 – 100% so với 0% đối chứng KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu chế hoạt động đƣờng điều hòa hoạt động gen liên quan tới đáp ứng chống chịu stress nhân tố phiên mã OsNLI-IF - Tiếp tục nghiên cứu, phân tích dịng chuyển gen OsNLIIF hệ T2, T3… để làm rõ đặc điểm chức protein OsNLI-IF đáp ứng chống chịu yếu tố stress phi sinh học - Mở rộng nghiên cứu chuyển gen OsNLI-IF vào đối tƣợng trồng khác với promoter điều khiển hoạt động cảm ứng điều kiện stress để phục vụ công tác chọn tạo giống 24 Footer Page 26 of 258 Header Page 27 of 258 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Duy Phƣơng, Trần Tuấn Tú, Phạm Xuân Hội (2012), “Thiết kế thƣ viện ADNc chịu hạn lúa phân lập gen NLI-IF1 kỹ thuật sàng lọc phép lai đơn tế bào nấm men”, Tạp chí Sinh học, 34(1), tr 114-122 Nguyễn Duy Phƣơng, Narendra Tuteja, Lê Huy Hàm, Phạm Xuân Hội (2012), “Biểu tinh protein tái tổ hợp NLI-IF từ tế bào Escherichia coli”, Tạp chí Sinh học, 34(3), tr 347-353 Nguyễn Duy Phƣơng, Narendra Tuteja, Phạm Xuân Hội (2013), “Thiết kế hệ vector biểu mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NLI-IF liên quan đến tính chịu hạn lúa”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 29(1), tr 36-44 Nguyễn Duy Phƣơng, Narendra Tuteja, Phạm Xuân Hội (2013), “Nghiên cứu khả tƣơng tác in vivo protein NLI-IF liên quan đến tính chống chịu stress lúa”, Tạp chí Sinh học, 35(1), tr.92-98 Nguyễn Duy Phƣơng, Narendra Tuteja, Phạm Xuân Hội (2014), “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein NLI-IF liên quan đến tính chịu hạn vào thuốc lá”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nơng thôn, 214, tr 79-84 Nguyen Duy Phuong, Pham Xuan Hoi (2015), “Isolation and characterization of a OsRap2.4A transcription factor and its expression in Arabidopsis for enhancing high salt and drought tolerance”, Current sciences, 108(1), pp 51-62 Footer Page 27 of 258 Header Page 28 of 258 Footer Page 28 of 258 ... ? ?Phân lập nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn thực vật? ?? với mục tiêu xác định gen mã hóa nhân tố phiên mã có liên quan tới tăng cƣờng tính chống chịu hạn thực vật Mục... cứu hồn chỉnh phân lập nghiên cứu chức gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn thực vật, đặc biệt nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã Xuất phát từ trên, tiến hành đề tài luận án tiến sĩ ? ?Phân lập. .. tiêu nghiên cứu đề tài - Phân lập xác định trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển tính chịu hạn từ lúa - Nghiên cứu số đặc tính gen mã hóa nhân tố phiên mã phân lập đƣợc lúa chuyển gen