Nghiên cứu sự biểu hiện MIRACULIN tái tổ hợp ở một số dòng rẽ tơ thuốc lá chuyển gen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP Ở MỘT SỐ DÕNG RỄ TƠ THUỐC LÁ CHUYỂN GEN Giáo viên hƣớng dẫn : Ts Phạm Bích Ngọc Sinh viên thực : Nguyễn Thị Hồng Hảo Lớp : CNSH-11-03 HÀ NỘI - 2015 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Bích Ngọc-Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người hướng dẫn, giúp đỡ bảo em tận tình, chu em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ths La Việt Hồng-trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, trực tiếp hướng dẫn em thao tác kỹ thuật giúp đỡ em suốt trình thực tập phòng thí nghiệm Em xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học giúp đỡ em suốt thời gian thực nghiệm Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến quý thầy cô, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học-Viện Đại học Mở Hà Nội, người đặt móng, giúp em trau dồi kiến thức khoa học cho em suốt bốn năm học vừa qua, để từ em học tập, nghiên cứu đạt kết ngày hôm Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn vô đến gia đình, người thân bạn bè bên giúp đỡ động viên em trình học tập hoàn thành khóa luận Trong trình nghiên cứu đề tài, thân em có nhiều cố gắng xong tránh sai sót, nên em mong nhận góp ý quý thầy- cô bạn lĩnh vực chuyên ngành Một lần nữa, cho phép em cảm ơn tất giúp đỡ tận tình quý báu Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Hảo Khoa Công nghệ Sinh học i Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT cDNA complement Deoxyribonucleic Axit CTAB Cetyltrimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic Axit EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Axit ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay MIR Miraculin MS Môi trƣờng theo Murashige Skoong(1962) OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PBST Phosphate Buffer Saline Tween RNase Ribonuclease SDS Sodium docecyl Sulfate SDS-PAGE Sodium docecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TBST Tris-buffered Saline WT Wild type Khoa Công nghệ Sinh học ii Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) Hình 1.2: Miraculin tự nhiên đƣợc tích lũy thần kỳ Hình 1.3: Mô hình cấu trúc 3D protein miraculin dạng dimer đồng hình Hình 1.4: (A) Hình thái rễ tơ bắp cải môi trƣờng đặc, (B) Rễ tơ thuốc phát triển môi trƣờng đặc không chất điều hòa sinh trƣởng sau tuần Hình 1.5: Cấu trúc Ri plasmd Hình 1.6: Nuôi cấy rễ tơ G.glabra Hình 2.1: Chu kỳnhiệtchạyphảnứng PCR Hình 3.1: Quá trình tạo chọn lọc dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Mir_BamHI_F/Mir_SacI_R gel agarose 0,8% (w/v) Hình 3.3: Kết lai western blot kiểm tra biểu protein miraculin dòng rễ tơ Hình 3.4: Một số giai đoạn nuôi lỏng rễ tơ thuốc biểu protein tái tổ hợp miraculin A: Rễ tơ môi trƣờng đặc 21 ngày tuổi: B, C, D: Rễ tơ môi trƣờng lỏng tuần tuổi, tuần tuổi tuần tuổi Hình 3.5: Động thái tích lũy sinh khối tƣơi số dòng rễ tơ Hình 3.6: Động thái tích lũy sinh khối khô số dòng rễ tơ Hình 3.7: Biểu đồ sinh trƣởng theo chiều dài số dòng rễ tơ Hình 3.8: Chỉ tiêu đánh giá chiều dài số dòng rễ tơ thuốc chuyển gen Khoa Công nghệ Sinh học iii Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các thiết bị dùng thí nghiệm Bảng 2.2: H a chất pha đệm rửa Bảng 2.3: H a chất pha đệm chiết Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại gen Bảng 2.6: Thành phần cách pha dung dịch PBST Bảng 2.7: Thành phần gel điện di protein SDS-PAGE Bảng 2.8: thành phần đệm biến tính protein Bảng 2.9: Thành phần cách pha Blotting solution 1X Bảng 2.10: Thành phần hàm lƣợng dung dịch TBS 1X Bảng 3.1: Kết tạo chọn lọc dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin Bảng 3.2: Động thái tích lũy sinh khối tƣơi số dòng rễ tơ (g) Bảng3.3: Động thái tích lũy sinh khối khô số dòng rễ tơ (g) Khoa Công nghệ Sinh học iv Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội CÔNG THỨC MÔI TRƢỜNG Môi trƣờng MS đặc  MS Bản  Saccaroza:  Agar: 30g/l 9g/l  pH= 5,8 Môi trƣờng MS lỏng  MS Bản  Saccaroza: 30g/l  pH= 5,8 Khoa Công nghệ Sinh học v Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC MỞ ĐẦU .4 Lý chọn đề tài .4 Mục đích nội dung nghiên cứu 2.1 Mục đích nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa lý luận thực tiễn 3.1 Ý nghĩa lý luận .5 3.2 Ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6 1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY THẦN KỲ VÀ MIRACULIN 1.1.1 Đặc điểm sinh học thần kỳ 1.1.2 Miraculin: tính chất đặc điểm phân tử 1.1.2.1 Cấu trúc miraculin 1.1.2.2 Tính chất tạo cảm giác miraculin 1.2 NGUỒN GỐC, ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ ƢU ĐIỂM CỦA HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TƠ THỰC VẬT 10 1.2.1 Nguồn gốc rễ tơ thực vật 10 1.2.2 Đặc điểm sinh trƣởng ƣu điểm rễ tơ thực vật 10 1.2.3 Phƣơng pháp đánh giá sinh trƣởng rễ tơ thực vật 11 1.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN THÔNG QUA AGROBACTERIUM RHIZOGENES VÀ ỨNG DỤNG .11 1.3.1 Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 12 1.3.2 Hệ vector nhị thể .14 Khoa Công nghệ Sinh học Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 1.3.3 Một số nghiên cứu ứng dụng hệ thống nuôi cấy rễ tơ công nghệ sinh học thực vật .15 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ NƢỚC NGOÀI LIÊN QUAN ĐẾN MIRACULIN 16 1.4.1 Tình hình nghiên cứu miraculin giới 16 1.4.2 Tình hình nghiên cứu miraculinở Việt Nam 17 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .18 2.1.1 Vật liệu 18 2.1.2 H a chất thiết bị thí nghiệm .18 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Kiểm tra c mặt gen miraculintrong dòng rễ tơ kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 19 2.2.2 Đánh giá mức độ biểu protein tái tổ hợp miraculin số dòng rễ tơ chuyển gen miraculin lai miễn dịch Western Blot .23 2.2.3 Phƣơng pháp đánh giá tiêu sinh trƣởng 26 2.2.4 Phƣơng pháp phân tích số liệu 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA GEN MIRACULIN TRONG DÕNG RỄ TƠ BẰNG KỸ THUẬT PCR 28 3.2 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN BẰNG LAI MIỄN DỊCH WESTERN BLOT 30 3.3 KHẢO SÁT ĐỘNG THÁI SINH TRƢỞNG CỦA MỘT SỐ DÕNG RỄ TƠ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN 31 3.3.1 Động thái tích lũy sinh khối tƣơi số dòng rễ tơ 32 3.3.2 Động thái tích lũy sinh khối khô số dòng rễ tơ 34 Khoa Công nghệ Sinh học Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.3.3 Đánh giá sinh trƣởng chiều dài số dòng rễ tơ 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 Kết luận 37 Kiến nghị .37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Khoa Công nghệ Sinh học Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong năm gần tỷ lệ ngƣời mắc bệnh béo phì bệnh tiểu đƣờng tăng mạnh nhiều nƣớc giới, bao gồm Việt Nam Những kết thực nghiệm cho thấy bệnh béo phì yếu tố nguy gây bệnh đái tháo đƣờng type 2, rối loạn chuyển h a lipid, tăng huyết áp, ung thƣ đƣờng tiêu h a… Với bệnh nhân này, không nên sử dụng thực phẩm đồ uống chứa nhiều chất béo, đƣờng Những chất nhân tạo nhƣ saccarin, aspartame, cyclamate…đã đƣợc sử dụng từ lâu toàn giới nhƣ chất làm lƣợng để cải thiện bữa ăn, đồ uống cho bệnh nhân bị bệnh liên quan đến việc sử dụng đƣờng, ví dụ nhƣ tiểu đƣờng, hyperlipemia, sâu răng, béo phì… Tuy nhiên, chất nhân tạo c tác dụng sử dụng nhiều nhƣ vấn đề tâm lý, rối loạn tâm thần, ung thƣ bàng quang, suy tim khối u não (Kant,2005) Vì vậy, nhà khoa học tìm protein c vị an toàn thân thiện với ngƣời thay chất nhân tạo Do loại protein đƣợc chiết từ tự nhiên c lƣợng hấp thu thấp nên đƣợc sử dụng thức ăn cho bệnh nhân bị bệnh liên quan đến việc tiêu thụ loại đƣờng nhƣ đái tháo đƣờng, béo phì… Cho đến c bảy loại protein c vị (sweet protein) protein thay đổi tạo vị (taste-modifying protein) đƣợc sử dụng bao gồm Brazzein, Thaumatin, Monelin, Curculin, Mabinlin, Miraculin Pentadin Trong đ điển hình Miraculin-một loại protein thay đổi vị đƣợc nghiên cứu Miraculin đƣợc tách chiết từ Richadella dulcifica, loại bụi vùng nhiệt đới Tây Phi, thuộc họ Hồng xiêm (saponaceae), tên thƣờng gọi thần kỳ (Micracle fruit), nhai phần thịt thần kỳ sau đ ăn vị chua chẳng hạn nhƣ chanh, lúc đ chanh c vị Loại đƣợc ngƣời dân Châu Phi dùng cách hàng trăm năm, sử dụng Miraculin tích lũy lƣợng hấp thu thấp, đ tốt cho cải thiện bữa ăn bệnh nhân tiểu đƣờng, béo phì Mặc dù c tính chất ƣu nhƣ vậy, xong sản lƣợng lại bị hạn chế thần kỳ sinh trƣởng chậm, nhỏ không thích hợp cho việc sản xuất với số lƣợng lớn Khoa Công nghệ Sinh học Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Các mẫu rễ tơ sau đƣợc xử lý phƣơng pháp sốc nhiệt đƣợc thấm khô cân cân phân tích (độ xác 10-4g) Số liệu sinh khối tƣơi đƣợc làm tròn đến chữ số sau dấu phẩy đƣợc ghi lại để so sánh cho lần phân tích Rễ tơ đƣợc cân khối lƣợng sinh khối tƣơi đƣợc đem sấy nhiệt độ 1050C đến c khối lƣợng không đổi để xác định khối lƣợng sinh khối khô (Ge et al.,2005) 2.2.3.2 Xác định chiều dài rễ tơ biểu protein tái tổ hợp miraculin Hình thái rễ tơ yếu tố thể khả sinh trƣởng tích lũy protein dòng rễ tơ chuyển gen Chiều dài rễ khả phân nhánh hai tiêu thể xác khả sinh trƣởng rễ tơ Trong thí nghiệm xác định chiều dài rễ tơ chuyển gen, thực đặt đoạn rễ tơ c chiều dài từ từ 1-1,5 cm lên đĩa petri chứa 30 ml môi trƣờng MS đặc đƣợc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 100 (mg/ml) Hàng tuần tiến hành đo chiều dài rễ thƣớc c c độ xác đến đơn vị (mm) Thí nghiệm tiến hành tuần 2.2.4 Phƣơng pháp phân tích số liệu Các số liệu thu đƣợc từ thí nghiệm đƣợc phân tích thống kê theo tham số: giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ tin cậy theo Nguyễn Văn Mã cộng (2013) Khoa Công nghệ Sinh học 27 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA GEN MIRACULIN TRONG DÕNG RỄ TƠ BẰNG KỸ THUẬT PCR Hệ thống rễ tơ hệ thống tiềm biểu protein tái tổ hợp Rễ tơ c đặc điểm sinh trƣởng nhanh môi trƣờng không chứa chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, dễ dàng hình thành thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Trong thí nghiệm này, chọn thuốc làm nguyên liệu phục vụ cho việc chuyển gen miraculin nhân tạo Việc tạo rễ tơ chuyển gen đƣợc thực cách đồng nuôi cấy vi khuẩn A.rhizogens mang vector đích (chứa cassette HSP-pro:Mir:HSP-ter 35S-pro:Mir:NOS-ter) với mảnh thuốc tuần tuổi đƣợc làm tổn thƣơng để tạo hội tiếp xúc vi khuẩn với tế bào thực vật, sau đ mảnh đƣợc đặt lên môi trƣờng chọn lọc c bổ sung kanamycin (100 mg/l) Kết tạo chọn lọc dòng rễ tơ chuyển gen miraculin đƣợc thể Bảng 1.1 Hình 1.1 Bảng 3.1: Kết tạo chọn lọc dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin Vector tái tổ hợp Cảm ứng hình Số dòng sinh trƣởngổn Số dòng thành (sau 7-10 định (sau 4-5 lần mang gen ngày) cấychuyển) mirauclin 35S-pro:Mir:NOS- 28 25 ter HSP-pro:Mir:HSPter Rễ tơ đƣợc hình thành vị trí tổn thƣơng mô thực vật đƣợc tiếp xúc với vi khuẩn A.rhizogenes (Hình 3.1A) Rễ sinh trƣởng nhanh môi trƣờng chọn lọc không chứa chất điều hòa sinh trƣởng, phân nhiều nhánh thứ cấp (Hình 3.1B) Khoa Công nghệ Sinh học 28 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.1: Quá trình tạo chọn lọc dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin A: Rễ tơ hình thành sau đồng nuôi cấy 7-10 ngày; B: Dòng rễ tơ phân nhánh mạnh môi trường chọn lọc Từ dòng sinh trƣởng ổn định (sau 4-5 lần cấy chuyển) môi trƣờng đặc chứa tác nhân chọn lọc Chúng thu mẫu rễ (0,2g) dòng rễ để tiến hành tách tách chiết DNA, thực phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen miraculin Mir_BamHI_F/Mir_SacI_R Kết điện di sản phẩm PCR đƣợc thể Bảng 3.1 Hình 3.2 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Mir_BamHI_F/Mir_SacI_R gel agarose 0,8% (w/v) (+): đối chứng dương; 1-9 (phía bên trái): dòng rễ tơ chuyển cấu trúc HSP-pro:Mir:HSP-ter; 1-6 (phía bên phải): dòng rễ tơ chuyển cấu trúc 35S-pro:Mir:NOS-ter; M: thang DNA chuẩn kb (Fermentas) Phân tích kết điện di cho thấy dòng rễ tơ xuất băng đặc hiệu tƣơng đƣơng với băng đối chứng dƣơng, kích thƣớc khoảng 761 bp tƣơng ứng với kích thƣớc gen miraculin đƣợc thiết kế Cụ thể: số dòng rễ tơ đƣợc chuyển cấu trúc HSP-pro:Mir:HSP-ter 7, số dòng rễ tơ đƣợc chuyển cấu Khoa Công nghệ Sinh học 29 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội trúc 35S-pro:Mir:NOS-ter Các dòng nguyên liệu quan trọng đƣợc nuôi lỏng để nhân lên lƣợng lớn, dùng cho nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp miraculin 3.2 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN BẰNG LAI MIỄN DỊCH WESTERN BLOT Sự biểu protein tái tổ hợp đích đến quan trọng trình chuyển gen vào thực vật Để kiểm tra đánh giá biểu protein miraculin rễ tơ, từ dòng mang gen, lựa chọn cấu trúc dòng rễ tơ (quan sát thấy sinh trƣởng tốt môi trƣờng lỏng chứa tác nhân chọn lọc) dòng không chuyển gen dùng làm đối chứng âm đƣợc tách chiết protein để tiến hành phản ứng lai Western blot Đối với dòng rễ tơ đƣợc chuyển cấu trúc HSPpro:Mir:HSP-ter, tiến hành xử lý sốc nhiệt theo Lee KT, 370C giờ, sau đ nuôi phục hồi 270C, thu sinh khối để tách chiết protein Hình 3.3: Kết lai western blot kiểm tra biểu protein miraculin dòng rễ tơ 1-3 (phía bên trái): dòng rễ tơ chuyển cấu trúc HSP-pro:Mir:HSP-ter; 1-3 (phía bên phải): dòng rễ tơ chuyển cấu trúc 35S-pro:Mir:NOS-ter; (+), (-): đối chứng dương âm Phản ứng lai sử dụng kháng thể protein c-myc Phân tích kết đƣợc thể Hình 3.3 miraculin tái tổ hợp không đƣợc tìm thấy mẫu rễ tơ không chuyển gen (mẫu đối chứng âm) Ngƣợc lại, Khoa Công nghệ Sinh học 30 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội dòng rễ tơ 1, mang cấu trúc HSP-pro:Mir:HSP-ter dòng rễ tơ mang cấu trúc 35S-pro:Mir:NOS-ter xuất băng kích thƣớc khoảng 43-45kDa Kết Hình 3.3 mức độ biểu khác dòng rễ tơ đƣợc chuyển cấu trúc HSP-pro:Mir:HSP-ter 35S-pro:Mir:NOS-ter Cụ thể dòng rễ tơ mang cấu trúc HSP-pro:Mir:HSP-ter biểu mạnh so với dòng Trong đ , dòng rễ tơ mang cấu trúc 35S-pro:Mir:NOS-ter biểu với mức biểu tƣơng đƣơng dòng mang cấu trúc HSP-pro:Mir:HSP-ter Các dòng đƣợc chuyển cấu trúc 35S-pro:Mir:NOS-ter không cho thấy biểu miraculin kiểm tra PCR cho thấy2 dòng rễ tơ mang gen đích miraculin Kết phân tích Western blot lần khẳng định biểu thành công protein tái tổ hợp miraculin số dòng rễ tơ thuốc 3.3 KHẢO SÁT ĐỘNG THÁI SINH TRƢỞNG CỦA MỘT SỐ DÕNG RỄ TƠ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN Việc đánh giá khả sinh trƣởng (tích lũy sinh khối) rễ tơ bình nuôi cấy cho phép bƣớc đầu đánh giá tiềm ứng dụng hệ thống Từ dòng rễ tơ đƣợc đánh giá kỹ thuật PCR Western Blot, lựa chọn dòng rễ tơ mang cấu trúc HSP-pro:Mir:HSP-ter dòng rễ tơ mang cấu trúc 35S-pro:Mir:NOS-ter để thực nghiên cứu Mỗi dòng lấy 0,2 g mẫu cho vào bình tam giác loại 250 ml chứa 20 ml môi trƣờng MS lỏng chứa kanamycin 100 (mg/l) Đánh giá sinh khối tƣơi-khô dòng rễ tơ đƣợc thực hàng tuần (sau ngày), kéo dài khoảng 42 ngày Khoa Công nghệ Sinh học 31 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.3.1 Động thái tích lũy sinh khối tƣơi số dòng rễ tơ Để đánh giá khả tích lũy sinh khối nhƣ khả mở rộng sản xuất sinh khối rễ tơ mang gen miraculin, chọn lọc dòng rễ tơ sinh trƣởng ổn định để nuôi cấy môi trƣờng lỏng (Hình 3.4) Các dòng nguyên liệu cho nghiên cứu Hình 3.4: Một số giai đoạn nuôi lỏng rễ tơ thuốc biểu protein tái tổ hợp miraculin A: Rễ tơ môi trƣờng đặc 21 ngày tuổi: B, C, D: Rễ tơ môi trƣờng lỏng tuần tuổi, tuần tuổi tuần tuổi Kết động thái tích lũy sinh khối tƣơi đƣợc thể Bảng 3.2 Hình 3.5 Khoa Công nghệ Sinh học 32 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng 3.2: Động thái tích lũy sinh khối tƣơi số dòng rễ tơ Thời gian nuôi cấy (ngày) WT(*) HSP1 HSP2 35S1 0,20 ±0,00 0,20 ± 0,00 0,20 ± 0,00 0,20 ± 0,00 0,28 ± 0,05 0,31 ± 0,07 0,32 ± 0,12 0,26 ± 0,02 14 0,45 ± 0,03 0,55 ± 0,04 0,46 ± 0,04 0,31 ± 0,03 21 0,68 ± 0,08 0,79 ± 0,05 0,67 ± 0,03 0,77 ± 0,08 28 0,77 ± 0,05 0,86 ± 0,08 0,79 ± 0,07 0,80 ± 0,07 35 0,83 ± 0,08 0,88 ± 0,10 0,82 ± 0,02 0,82 ± 0,10 42 0,80 ± 0,02 0,76 ± 0,03 0,74 ± 0,05 0,73 ± 0,06 (*) Dòng tế bào rễ tơ wild type nuôi môi trường không chứa kháng sinh chọn lọc kanamycin, số liệu thể giá trị trung bình lần nhắc lại độ lệch chuẩn Đơn vị (g) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 WT 14 ngày 21 ngày 28 ngày HSP1 HSP2 35 ngày 35S-1 42 ngày Hình 3.5: Động thái tích lũy sinh khối tƣơi số dòng rễ tơ Kết cho thấy môi trƣờng nuôi cấy kín (bình chứa 20 ml môi trƣờng), sinh trƣởng dòng rễ tơ thể pha sinh trƣởng rõ rệt: pha chuẩn bị (từ 0-7 ngày dòng rễ tơ gồm: WT, HSP1 HSP2 đ dòng rễ tơ 35S1 c pha chuẩn bị kéo dài hơn: từ 0-14 ngày), pha lũy thừa (từ 7-21 ngày), pha ổn định (từ 28-35 ngày) pha suy vong (từ 42 ngày trở đi) dòng rễ tơ sinh trƣởng chậm lại, h a nâu chết Dòng HSP1 sinh trƣởng tốt nhất, đạt 0,88 g sau 35 ngày, dòng WT, HSP2 35S1 sinh trƣởng đạt cực đại sau 35 ngày với sinh khối tƣơng đƣơng Khoa Công nghệ Sinh học 33 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.3.2 Động thái tích lũy sinh khối khô số dòng rễ tơ Tiếp tục đánh giá động thái tích lũy sinh khối khô dòng rễ tơ, kết đƣợc thể Bảng 3.3 Hình 3.6 Bảng3.3: Động thái tích lũy sinh khối khô số dòng rễ tơ Thời gian nuôi WT(*) HSP1 HSP2 35S-1 0,001 ± 0,000 0,001 ± 0,000 0,001 ± 0,000 0,001 ± 0,000 0,015 ± 0,001 0,014 ± 0,006 0,016 ± 0,003 0,013 ± 0,003 14 0,026 ± 0,002 0,031 ± 0,004 0,022 ± 0,005 0,020 ± 0,004 21 0,047 ± 0,003 0,051 ± 0,001 0,055 ± 0,001 0,053 ± 0,004 28 0,054 ± 0,006 0,062 ± 0,002 0,061 ± 0,002 0,058 ± 0,005 35 0,055 ± 0,002 0,069 ± 0,005 0,068 ± 0,008 0,063 ± 0,002 42 0,054 ± 0,008 0,061 ± 0,002 0,062 ± 0,004 0,058 ± 0,003 cấy (ngày) (*) Dòng tế bào rễ tơ wild type nuôi môi trường không chứa kháng sinh chọn lọc kanamycin, số liệu thể giá trị trung bình lần nhắc lại ± độ lệch chuẩn Đơn vị (g) 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 WT 14 ngày 21 ngày HSP1 28 ngày HSP2 35 ngày 42 ngày 35S-1 Hình 3.6: Động thái tích lũy sinh khối khô số dòng rễ tơ Kết sinh khối khô cho thấy pha sinh trƣởng rõ rệt dòng rễ tơ Sinh khối cao dòng HSP1 HSP2 đạt lần lƣợt 0,069 (g) 0,068 (g) sau 35 ngày nuôi cấy, thấp dòng WT đạt 0,055 (g) Khoa Công nghệ Sinh học 34 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.3.3 Đánh giá sinh trƣởng chiều dài số dòng rễ tơ Chỉ tiêu đánh giá sinh trƣởng chiều dài số dòng rễ tơ đƣợc thể Bảng 3.4, Hình 3.7 Hình 3.8 Bảng 3.4: Chỉ tiêu sinh trƣởng chiều dài số dòng rễ tơ Số ngày nuôi cấy HSP1 HSP2 35S-1 1,4 ± 0,00 1,4 ± 0,034 1,15 ± 0,02 2,4 ± 0,034 2,0 ± 0,034 1,70 ± 0,001 14 5,7 ± 0,034 4,4 ± 0,034 4,80 ± 0,002 21 7,2 ± 0,034 6,8 ± 0,034 6,80 ± 0,001 Số liệu tính giá trị trung bình lần thí nghiệm lặp lại, đơn vị (cm) 0 14 ngày HSP1 HSP2 21 ngày 35S-1 Hình 3.7: Biểu đồ sinh trƣởng theo chiều dài số dòng rễ tơ Thí nghiệm đánh giá tiêu sinh trƣởng chiều dài rễ tơ chuyển gen môi trƣờng c chứa kháng sinh chọn lọc kanamycine cho thấy sinh trƣởng mặt hình thái dòng rễ tơ ổn định đồng Trong dòng rễ tơ tiến hành thí nghiệm lặp lại lần thấy đƣợc dòng HSP1 c khả sinh trƣởng tốt dòng lại HSP3 35S-1 Khoa Công nghệ Sinh học 35 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.8: Chỉ tiêu đánh giá chiều dài số dòng rễ tơ thuốc chuyển gen A: Rễ tơ thuốc nuôi cấy ngày thứ B: Rễ tơ thuốc nuôi cấy ngày thứ C: Rễ tơ thuốc nuôi cấy ngày thứ 14 D: Rễ tơ thuốc nuôi cấy ngày thứ 21 Trên hình ảnh thí nghiệm nhận thấy dòng rễ tơ chuyển gen phát triển ổn định đồng nhau, khả phân nhánh rễ tơ chuyển gen cao Điều cho thấy triển vọng tiến hành nuôi cấy rễ tơ quy mô công nghiệp thiết bị Bioreactor cho sinh khối rễ tơ lớn với thời gian ngắn Khoa Công nghệ Sinh học 36 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau trình nghiên cứu thí nghiệm đạt đƣợc kết sau: - Xác định đƣợc 12 dòng rễ tơ thuốc chuyển gen mang gen miraculin mã h a protein miraculin - Đánh giá mức độ biểu protein tái tổ hợp miraculin dòng rễ tơ mang gen miraculin sinh trƣởng ổn định Trong 12 dòng rễ tơ mang gen miraculin mà tạo c dòng sinh trƣởng biểu tốt nhất, đ dòng: HSP1, HSP3 35S-3 - Khảo sát động thái sinh trƣởng dòng rễ tơ biểu gen miraculin Kiến nghị Từ kết nghiên cứu, đánh giá biểu protein tái tổ hợp miraculin số dòng rễ tơ thuốc chuyển gen Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu, đề xuất số ý kiến nhƣ sau: - Tối ƣu h a quy trình nuôi cấy rễ tơ thuốc chuyển gen dựa vào đ để tiến hành nuôi cấy rễ tơ thuốc quy mô công nghiệp để thu sinh khối - Tiếp tục nghiên cứu biểu protein miraculin đối tƣợng khác để so sánh hiệu hệ thống biểu Khoa Công nghệ Sinh học 37 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Lê Duy Thành “Cơ sở di tryền chọn giống thực vật” Hà Nội, NXB Khoa học kỹ thuật Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Ánh Hồng, (2000) "Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gen thực vật." NXB Nông nghiệp(Hà Nội) Nguyễn Đức Thành (2003) "Chuyển gen thực vật." NXB Khoa học kỹ thuật(Hà Nội) Nguyễn Huy Hoàng (2010), “Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt vius H5N1 bước đầu chuyển gen HA1 tạo dòng rễ tơ chuyên gen thuốc lá” Luận văn thạc sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật (Methods in plant physiology) Nxb ĐHQG Hà Nội Trần Thế Danh, Vũ Văn Độ, Ngô Kế Sƣơng (2010), “Bước đầu trồng thử nghiệm tách chiết hoạt chất Miraculintrong trái Thần kỳ” Science & Technology Development(vol 13), No T1 Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Giáo trình công nghệ chuyển gen động vật thực vật, Nxb Huế Tài liệu tiếng anh Britton, M T., M.A Escobar, and A.M Dandekar (2008) "The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes in Agrobacterium: From Biology to Biotechnology." T Tzfira and V Citovsky, Editors Springer: New York: p (524-565) 10 Chilton MD, Tepfer DA, Petit A, David C, Casse-Delbart F, Tempe J (1982) Agrobacterium rhizogenesinserts T-DNA into the ge-nomes of the host plant root cells Nature (295): 432 -434 Khoa Công nghệ Sinh học 38 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 11 Christey, a M C (2001) "Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants." In Vitro Cell, Dev, Biol-Plant: p (687700) 12 Hirai T, Sato M, Toyooka K, Sun HJ, Yano M, Ezura H (2010b) Miraculin , a taste-modifying protein is secreted into intercellular spacesinplantcells J PlantPhysiol(167):209 -215.doi: 10.1016/j.jplph.2009.08.001 13 Igeta H, Tamura Y, Nakaya K, Nakamura Y, Kurihara Y (1991) Determination of disulfide array and subunit structure of tastemodifyingprotein,miraculin BiochimBiophysActa(1079):303 -307 doi:10.1016/0167-4838(91)90073-9 14 Ito K, Asakura T, Morita Y, Nakajima K, Koizumi A, Shimizu-Ibuka A, Masuda K, Ishiguro M, Terada T, Maruyama J, Kitamoto K, Misaka T, Abe K (2007) Microbial production of sensory-active miraculin Biochem Biophys Res Commun (360):407 -411 doi:10.1016/j.bbrc.2007.06.064 15 Kato K, Yoshida R, Kikuzaki A, Hirai T, Kuroda H, Hiwasa-Tanase K, Takane K, Ezura H, Mizoguchi T (2010) Molecular breeding oftomatolinesformass production ofmiraculininaplant factory J Agric Food Chem (58):9505 -9510 doi:10.1021/jf101874b 16 kato K, Maruyama S, Hirai T, Hiwasa-Tanase K, Mizoguchi T, Goto E, Ezura H (2011) A trial of production of the plant-derived high-value recombinant protein in a plant factory: photosynthetic photon fluxes affect the accumulation of recombinant miraculinin transgenic tomato fruits Plant Signal Behav (8):1172 -1179 doi:10.4161/psb.6.8.16373 17 Kant R (2005) Sweet proteins—potential replacement for artificial low calorie sweeteners Nutr J 4:5 doi:10.1186/1475-2891-4-5 18 Kim YW, Kato K, Hirai T, Hiwasa-Tanase K, Ezura H (2010b) Spatial and developmental profiling of miraculinaccumulation in transgenic tomato fruits expressing the miraculingene constitu-tively J Agric Food Chem (58):282 -286 doi:10.1021/jf9030663 Khoa Công nghệ Sinh học 39 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 19 Kittipongpatana N, Hock RS, Porter JR(1998) Production of solasodine by hairy root, callus, and cell suspension cultures of Solanum aviculareForst Plant Cell Tiss Org Cult (52): 133 -143 20 Koizumi A, Tsuchiya A, Nakajima K, Ito K, Terada T, Shimizu-Ibuka A, Briand L, Asakura T, Misaka T, Abe K (2011) Human sweet taste receptor mediates acid-induced sweetness of miraculin Proc Natl Acad Sci USA doi:10.1073/pnas.1016644108 (in press) 21 Kusano M, Redestig H, Hirai T, Oikawa A, Matsuda F, Fukushima A,Arita M, Watanabe S, Yano M, Hiwasa-Tanase K, Ezura H, Saito K (2011) Covering the chemical diversity of genetically modified tomato using multi-platform metabolomics for an objectivesubstantialequivalenceassessment.PLoSONE6:e16989 doi:10.1371/journal.pone.0016989 22 Kurihara K, Beidler LM (1969) Mechanism of the action of tastemodifyingprotein.Nature(222):1176 -1178.doi:10.1038/2221176a0 23 Masuda Y, Nirasawa S, Nakaya K, Kurihara Y (1995) Cloning and sequencing of a cDNA encoding a taste-modifying protein, mira-culin Gene (161):175 -177 doi:10.1016/0378-1119(95)00198-F 24 Lee K T., Chen S C., Chiang B L., Yamakawa T., 2007 Heat-inducible production of beta-glucuronidase in tobacco hairy root cultures Appl Microbiol Biotechnol., (73):1047-1053 25 Merkli A, Christen P, Kapetanidis I(1997) Production of diosge-nin by hairy root cultures of Trigonella foenum-graecumL Plant Cell Rep (16) 632 -636 26 PaladinoA,CostantiniS,ColonnaG,FacchianoAM(2008) Molecular modeling of miraculin : structural analysis and func-tional hypothesis Biochem Biophys Res Commun (367):26 -32 doi:10.1016/j.bbrc.2007.12.102 27 Rhodes MJC, Robins RJ, Hamill JD, Parr AJ, Hilton MH, Walton NJ (1990) Properties of transformed root culture In: Charlwood BV, Rhodes Khoa Công nghệ Sinh học 40 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MJC, eds Proceedings of the Phytochemical Soci-ety of Europe Secondary Product from Plant Tissue Culture Clarendon Press, Oxford pp 201 -225 28 Sevon, N a K M O.-C (2002) "Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation: root cultures as a source of alkaloids." Planta Med Vol 68(No.10): p (859-868) 29 Sun HJ, Cui ML, Ma B, Ezura H (2006a) Functional expression of the taste-modifying protein, miraculin , in transgenic lettuce FEBS Lett (580):620 -626 doi:10.1016/j.febslet.2005.12.080 30 Tepfer D(1984) Genetic transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes: Sexual transmission of the transformed genotype and phenotype Cell (37), 959 -967 31 Theerasilp S, Kurihara Y (1988) Complete purification and characterization of the taste-modifying protein, miraculin , from miracle fruit J Biol Chem (263):11536 -11539 32 http://www.ejbiotechnology.info/index.php/ejbiotechnology/article/viewFil e/v9n4-4/323 Khoa Công nghệ Sinh học 41 Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03 [...]... thực hiện đề tài: Nghiên cứu sự biểu hiện miraculintái tổ hợp ở một số dòng rễ tơ thuốc lá chuyển gen 2 Mục đích và nội dung nghiên cứu 2.1 Mục đích nghiên cứu Đánh giá sự biểu hiện của miraculintái tổ hợp ở một số dòng rễ tơ thuốc lá chuyển gen 2.2 Nội dung nghiên cứu - Kiểm tra sự c mặt của gen miraculintrong một số dòng rễ tơ chuyển gen bằng kỹ thuật PCR - Đánh giá mức độ biểu hiện miraculintrong một. .. miraculintrong một số dòng rễ tơ chuyển gen miraculin bằng lai miễn dịch Western Blot - Đánh giá động thái sinh trƣởng của một số dòng rễ tơ chuyển gen 3 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn 3.1 Ý nghĩa lý luận Cung cấp tƣ liệu khoa học về quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp trong hệ thống rễ tơ thuốc lá 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết quả đề tài cung cấp một số dòng rễ tơ thuốc lá biểu hiện miraculin tái tổ hợp ở mức cao,... Các dòng này là nguyên liệu quan trọng đƣợc nuôi lỏng để nhân lên lƣợng lớn, dùng cho các nghiên cứu tiếp theo về biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin 3.2 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN BẰNG LAI MIỄN DỊCH WESTERN BLOT Sự biểu hiện của protein tái tổ hợp là đích đến quan trọng trong quá trình chuyển gen vào thực vật Để kiểm tra và đánh giá sự biểu hiện của protein miraculin. .. mảnh lá thuốc lá 1 tuần tuổi đƣợc làm tổn thƣơng để tạo cơ hội tiếp xúc giữa vi khuẩn với tế bào thực vật, sau đ các mảnh lá đƣợc đặt lên môi trƣờng chọn lọc c bổ sung kanamycin (100 mg/l) Kết quả tạo và chọn lọc các dòng rễ tơ chuyển gen miraculin đƣợc thể hiện ở Bảng 1.1 và Hình 1.1 Bảng 3.1: Kết quả tạo và chọn lọc các dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin Vector tái tổ hợp Cảm ứng hình Số dòng sinh... tiềm năng biểu hiện protein tái tổ hợp Rễ tơ c đặc điểm là sinh trƣởng nhanh trên môi trƣờng không chứa chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, dễ dàng hình thành thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn cây thuốc lá làm nguyên liệu phục vụ cho việc chuyển gen miraculin nhân tạo Việc tạo rễ tơ chuyển gen đƣợc thực hiện bằng cách đồng nuôi cấy vi khuẩn A.rhizogens mang... Thành, 2003) Vector chuyển gen trong hệ vector nhị thể ở A.tumefaciens c thể sử dụng để chuyển gen thông qua A.rhizogenes Khi nhiễm A.rhizogenes với thực vật sẽ làm chuyển T-DNA từ vector chuyển gen cùng với T-DNA của A.rhizogenes vào genome thực vật (Nguyễn Ánh Hồng , 2000) Sự tái sinh thành cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.rhizogenes c thể xảy ra thông qua sự phát triển phôi soma hoặc sự phát sinh cơ... cộng sự đã tạo đƣợc cây cà chua chuyển gen mang gen miraculin Miraculin c cùng một hoạt tính sinh học nhƣ miraculin ở cây bản địa, chất này đƣợc tạo ra trong lá và quả cà chua biến đổi gen Năm 2011, Hirai T và cộng sự đã tạo ra cây cà chua mang chuyển gen mang trình tự kết thúc terminator của gen HSP 18.2 từ Arabidopsis thaliana đem lại mức tích lũy protein miraculin cao 1.4.2 Tình hình nghiên cứu miraculin ... 2.2.2 Đánh giá mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong một số dòng rễ tơ chuyển gen miraculin bằng lai miễn dịch Western Blot 2.2.2.1.Đánh giá mức độ biểu hiện protein miraculin trong một số dòng rễ tơ chuyển gen bằng phương pháp Western Blot a) Chuẩn bị h a chất và dung dịch đệm Trong phƣơng pháp tách chiết protein tổng số chúng tôi sử dụng các h a chất nhƣ: đệm PBST, đệm biến tính protein,... học Mở Hà Nội Kỹ thuật di truyền thực vật nhƣ một giải pháp để khắc phục vấn đề này, kỹ thuật này cho phép biểu hiện các gen khác nhau trong các loài thực vật, nhờ đ c thể sản xuất đƣợc protein tái tổ hợp mong muốn C nhiều hệ thống thực vật để sản xuất protein tái tổ hợp, đặc biệt là hệ thống rễ tơ chuyển gen đã đƣợc sử dụng rất rộng rãi ở nhiều nƣớc trên thế giới để sản xuất ra các protein tái tổ hợp. .. tách béo trong 2 giờ - Sự c mặt của miraculin trong mẫu đƣợc phát hiện nhờ phản ứng hiện màu bằng cơ chất TMB (3,3′; 5,5′-Tetramethylbenzidine) 2.2.3 Phƣơng pháp đánh giá chỉ tiêu sinh trƣởng 2.2.3.1 Xác định khối lượng tươi-khô sinh khối rễ tơ biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin Từ các dòng rễ tơ đã đƣợc đánh gia bằng kỹ thuật PCR và Western Blot, chúng tôi lựa chọn 2 dòng rễ tơ mang cấu trúc HSP-pro:Mir:HSP-ter