Nghiên cứu tạo hạt giả virus lở mồm long móng type o trong hệ biểu hiện baculovirus tế bào côn trùng định hướng sản xuất vaccine tt

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN PHƯƠNG HOA NGHIÊN CỨU TẠO HẠT GIẢ VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG HỆ BIỂU HIỂN BACULOVIRUS TẾ BÀO CÔN TRÙNG ĐỊNH HƯỚNG SẢN XUẤT VACCINE Chuyên ngành : Hóa sinh học Mã số : Mã số: 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020 Cơng trình hồn thành Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Kim Cúc Viện Hóa sinh biển PGS TS Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án phiên thức Viện Cơng nghệ sinh học, 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi …….giờ, ngày …….tháng …….năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Viện Công nghệ sinh học - Trang web Bộ GD&ĐT NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ CƠNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Phương Hoa, Nguyễn Hoàng Dương, Đinh Duy Kháng, Nguyễn Thị Kim Cúc, Phạm Việt Cường, Tôn Thất Hữu Đạt, Lê Thị Hồng Minh (2018) Nghiên cứu tối ưu trình biểu tạo hạt giả virus virus lở mồm long móng type O Việt Nam hệ biểu Baculovirus tế bào côn trùng Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2018: 1192-1197 Nguyen Phuong Hoa, Nguyen Hoang Duong, Tran Thi Kim Dzung, Le Thi Hong Minh,Vu Thi Thu Huyen, Nguyen Mai Anh, Nguyen Thi Kim Cuc, Pham Viet Cuong (2016) Expression and purification of envelop capsid proteins of foot and mouth disease virus type O isolated in Vietnam in baculovirus system for making virus-like particle International Journal of Development Research, 06(01): 6447-6452 ISSN: 2230-9926 0866-708X/54/5/7498 Nguyen Phuong Hoa, Nguyen Hoang Duong, Vu Thi Thu Huyen, Le Thi Hong Minh, Nguyen Thi Kim Cuc, Ton That Huu Dat, Le Van Phan, Pham Viet Cuong (2015) Variation in genetic structure of the genes coding for envelope protein of Vietnamese foot and mouth disease viruses Vietnam journal of chemistry, 53(2e): 178-182 DOI: 10.15625/0866-7144.2015-2e-041 MỞ ĐẦU Bệnh lở mồm long móng (LMLM) bệnh truyền nhiễm xuyên biên giới, công vật nuôi động vật hoang dã Bệnh lây lan nhanh mạnh, làm nhiều gia súc nhiễm bệnh nhanh chóng lây lan thành dịch Động vật mắc bệnh LMLM lồi móng guốc chẵn như: trâu, bò, lợn, dê, cừu, hươu, nai Bệnh LMLM đánh giá bệnh nguy hại động vật trang trại gây giảm suất thiệt hại kinh tế lớn Theo Tổ chức Thú y giới (Office International des Epizooties - OIE) bệnh LMLM làm sảy thai khoảng 25 % động vật có chửa, làm giảm tới 25 % sản lượng thịt, 50 % sản lượng sữa giảm suất lơng tới 25 % cừu Vì vậy, LMLM Tổ chức Thú y giới xếp vào danh mục bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho chăn nuôi tác động lớn tới ngành kinh doanh sản phẩm động vật móng guốc chẵn, đặc biệt bị lợn Virus gây bệnh LMLM có khả biến chủng cao, nhược điểm vaccine phịng bệnh LMLM có tác dụng phịng bệnh cao chủng virus dùng để sản xuất vaccine chủng virus có tương đồng kháng nguyên với chủng gây bệnh thực địa Tất loại vaccine LMLM sử dụng giới Việt Nam vaccine vô hoạt Tuy nhiên, vaccine bộc lộ hạn chế định Vì vậy, có nhiều hướng công nghệ sản xuất vaccine nhằm khắc phục nhược điểm để đảm bảo tăng cường hiệu lực, tính an tồn nâng cao hiệu kinh tế Hiện nay, hướng nghiên cứu tạo hạt giả virus (Virus like particle-VLP) xem bước đột phá công nghệ sản xuất vaccine hệ VLP tạo protein cấu trúc virus, có cấu trúc tương tự hạt virus tự nhiên không mang vật liệu di truyền virus, khơng có khả lây nhiễm Do có cấu trúc tương tự virus tự nhiên bao gồm protein kháng nguyên quan trọng virus, VLP hệ thống miễn dịch phòng vệ vật chủ nhận biết tạo đáp ứng miễn dịch phòng vệ cao tương tự động vật bị nhiễm virus tự nhiên Vaccine viêm gan B vaccine ung thư cổ tử cung hai loại vaccine VLP sản xuất công nghệ tiên tiến thương mại hóa Hiện nay, Việt Nam Công ty TNHH MTV AVAC thuộc Tổng công ty RTD nghiên cứu sản xuất thành công vaccine LMLM type O có tên đầy đủ AVAC – V6 FMD Emulsion type O công nghệ cổ điển với chủng virus thực địa Chi cục thú y vùng VI phân lập, tuyển chọn cung cấp Vừa qua, Công ty AVAC tiếp nhận chủng LMLM type A Chi cục thú y vùng VI phân lập, tuyển chọn, cung cấp tiếp tục nghiên cứu sản xuất vaccine LMLM type A Nhưng, chưa có nghiên cứu sử dụng cơng nghệ tạo hạt giả virus VLP hướng tới mục tiêu sản xuất vaccine LMLM Với lý nêu trên, tiến hành thực đề tài:”Nghiên cứu tạo hạt giả virus Lở mồm long móng type O hệ biểu Baculovirus tế bào côn trùng định hướng sản xuất vaccine” Mục đích Nghiên cứu tạo hạt giả virus (VLP-virus like paticle) hệ biểu Baculovirus/ tế bào côn trùng định hướng ứng dụng sản xuất vaccine lở mồm long móng Nội dung nghiên cứu  Phân lập gen cấu trúc vỏ VP0, VP1-2A, VP3 virus LMLM type O Việt Nam, tối ưu tạo cụm gen VP0 VP1-2A-VP3  Tạo vector biểu bacmid mang cụm gen VP0 VP1-2A-VP3 thông qua vector trung gian pFastBacTMDual tế bào E.coli DH10Bac  Biểu cụm gen tối ưu VP0, VP1-2A-VP3 tế bào côn trùng tạo hạt giả virus (VLP) virus LMLM  Đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch VLP-LMLM động vật thí nghiệm chuột bê Những đóng góp luận án Nghiên cứu tạo virus dạng giả (VLP) nói chung VLP-LMLM virus LMLM type O Việt Nam nói riêng nghiên cứu sử dụng công nghệ VLP để hướng tới làm vaccine an toàn tuyệt đối cho động vật, cho loại bệnh nguy hiểm virus gây HIV… Sau nghiên cứu chúng tơi góp phần làm chủ quy trình cơng nghệ tạo VLP Đã sản xuất hạt giả virus LMLM làm ứng viên cho chế tạo vaccine phòng chống LMLM (Đã đăng kí độc quyền giải pháp hứu ích cục sở hữu trí tuệ cho quy trình sản xuất hạt giả virus LMLM số: 2017 theo định số 24008/QĐ-SHTT, ngày 02/04/2019) Bố cục luận án Luận án gồm 149 trang: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (40 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp (20 trang); Chương 3: Kết (40 trang); Chương 4: Bàn luận kết (16 trang); Kết luận kiến nghị (1 trang); Danh mục cơng trình cơng bố (1 trang); Tóm tắt luận án tiếng Anh (7 trang); Tài liệu tham khảo (19 trang); Phụ lục (25 trang) Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh Lở mồm long móng Giới thiệu chung bệnh lở mồm long móng Tình hình dịch bệnh LMLM giới Tình hình dịch bệnh Việt Nam Cấu trúc gen vi rút LMLM Các type huyết virus LMLM Chẩn đoán bệnh LMLM Xác định đặc tính virus LMLM mức độ phân type Vaccine phòng bệnh LMLM 1.2 Hạt giả virus (VLP) vaccine phát triển công nghệ tạo VLP Khái niệm VLP Phương pháp tạo hạt giả VLP Các hệ thống biểu tạo VLP Các loại Vaccine VLP Tạo VLP - LMLM trện hệ biểu baculovirus tế bào côn trùng Vaccine lở mồm long móng dựa VLP 1.3 Thử nghiệm VLP virus LMLM type O Việt Nam chuột Bê Đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch VLP-LMLM chuột thí nghiệm Đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch VLP-LMLM Bê thí nghiệm Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Vật liệu nghiên cứu: ARN virus LMLM type O tách chiết từ mẫu biểu mơ bong tróc móng lợn, bò mắc bệnh LMLM Việt Nam Bảng 2.1: Danh sách mẫu virus LMLM type O sử dụng nghiên cứu STT Kí hiệu chủng Thời gian thu thập mẫu Địa điểm lấy mẫu Mã số GenBank Topotype Vật chủ O/VN/HN1/2014 2014 Hà Nội ME-SA (PanAsia) KM 588394 Lợn O/VN/HN2/2013 2013 Hà Nội ME-SA (PanAsia) KM 588384 Lợn O/VN/LC/2010 2010 Lai Châu ME-SA (PanAsia) KM 260716 Bò 4 O/VN/QT1/2013 2013 Quảng Trị ME-SA (PanAsia) KM 588387 Bò O/VN/QT2/2013 2013 Quảng Trị ME-SA (PanAsia) KM 588388 Bò O/VN/HNA2/2014 2014 Hà Nam ME-SA (PanAsia) KM 588396 Lợn O/VN/HNA6/2014 2014 Hà Nam ME-SA (PanAsia) KM 588397 Bò Ký hiệu HN = Hà Nội, LC = Lai Châu, HNA = Hà Nam, QT = Quảng Trị Phân type (còn gọi Topotype) PanAsia ME-SA: Middle East-South Asia Chủng vi sinh vật: Tế bào vi khuẩn E coli TOP10 (Invitrogen), Cat No C4040-10 Tế bào E coli chủng DH10BacTM (Invitrogen) Cat No 10361012 Tế bào côn trùng Sf9TM II SFM (Publication number MAN 0007364) Plasmid: pCRTM4-TOPO có (Invitrogen, Mỹ) Cat No K4575-01 Vector pFastBacTMDual (Invitrogen) Catalog number: 10712024 2.2 Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp sử dụng luận án chủ yếu dựa theo hướng dẫn Sambrook, Maniatis, (1989) kit Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System Thiết kế mồi phân lập gen cấu trúc VP0, VP1-2A VP3 từ cDNA virus LMLM type O Việt Nam Tối ưu codon tạo cụm gen VP0 VP1-2A-VP3 phù hợp cho biểu Baculovirus tế bào côn trùng để tạo VLP Thiết kế vector chuyển pFastBacTM Dual mang hai cụm gen VP0 VP1-2A-VP3 Tạo bacmid tái tổ hợp mang hai cụm gen VP0 VP1-2A-VP3 tế bào E.coli DH10bac 5 Nhiễm bacmid tái tổ hợp vào tế bào côn trùng Sf9 tạo Bac stock P1 Nhiễm biểu Bac stock P1 vào tế bào côn trùng Sf9 tạo VLPLMLM tối ưu biểu Đánh giá VLP-LMLM phương pháp Western Blot, Quan sát tạo thành VLP-LMLM kính hiển vi điện tử truyền qua TEM Đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch VLP-LMLM dạng giả virus động vật thí nghiệm: chuột thí nghiệm, bê thí nghiệm Kiểm tra độc tính kháng nguyên VLP-LMLM chuột thí nghiệm CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết tách chiết ARN tổng số Bảng 3.1: Kết tách chiết ARN từ mẫu LMLM Số TT Nguồn gốc mẫu, địa điểm lấy mẫu Hà Nội Hà Nội Lâm Đồng Quảng Trị Quảng Trị Hà Nam Hà Nam Giá trị A260/A280 1,82 1,83 1,88 1,79 1,97 1,9 1,85 Nồng độ (ng/µl) 28.17 16,4 18,8 17,9 19,7 19,0 18,8 Độ tinh dung dịch dựa vào tỷ số OD mẫu đo bước sóng A260 /A280 Một dung dịch axit nucleic coi tỷ số OD 1,82,0: kết bảng 3.1 kết luận mẫu ARN tổng số tách từ mẫu bệnh phẩm mắc bệnh LMLM đủ đảm bảo nông độ cho thí nghiệm 3.2 Thiết kế mồi nhân gen VP0, VP1-2A VP3 Để thiết kế mồi đặc hiệu nhân tồn gen mã hóa protein vỏ virus LMLM type O VP0, VP1-2A, VP3 chúng tơi so sánh trình tự gen chủng gây bệnh địa phương khác Việt Nam, bao gồm Gia Lai (GL13), Quảng Bình (QB88), Sơn La (SL01), Yên Bái (YB105) sử dụng phần mềm GeneDoc để phục vụ cho mục đích Kết so sánh cho thấy, trình tự gen VP0, VP3 VP1-2A chủng virus LMLM type O gây bệnh địa phương khác Việt Nam dựa kết so sánh trình tự gen thu ngân hang GenBank Bảng 3.2 hồn tồn tìm vùng bảo thủ để thiết kế cặp mồi cho việc khuếch đại gen Các cặp primer thiết kế nhờ chương trình phần mềm BioEdit Bảng 3.3: Mồi thiết kế để khuếch đại gen VP0, VP3 VP1-2A Tên primer Trình tự VP0pf VP0pr VP3pf VP3pr VP12Apf VP12Apr 5’-tcaggcaacaccgggagc-3’ 5’- gaaaatcccctctttggaagg-3’ 5’-agaggggattttccctgtgg-3’ 5’-gactcgcct/cgtcgaagtgg-3’ 5’-cagaccacttcgaca/gggcg-3’ 5’- ggcccggggttggactca-3’ Số Nhiệt nóng nucleotide chảy Tm 18 21 20 19 19 18 57 54 55 54 55 57 Kích thước gen VP0 ~ 876 bp VP3~ 684 bp VP1-2A~692 bp 3.3 Kết tổng hợp cDNA mồi FMD-F/R Hình 3.1: Kết PCR sử dụng cặp mồi định tính LMLM FMD-F FMD-R Giếng 1, 8: ĐC (+);Giếng 7,11: ĐC-; Giếng 2: cDNA chủng O/VN/HN1/2013; Giếng 3: cDNA chủng O/VN/HN1/2013; Giếng 4: cDNA chủng O/VN/LD1/2013; Giếng 5: cDNA chủng O/VN/QT1/2013; Giếng 6: cADN chủng LMLM O/VN/QT2/2013; Giếng 9: cADN chủng O/VN/HNA2/2014; Giếng 10: cDNA chủng O/VN/HNA6/2014; M: Marker 100bp Mẫu đối chứng dương cDNA chủng virus O/VN/YB08/2010 (mã số truy cập ngân hàng GenBank: HQ260718) Mẫu đối chứng âm mẫu cDNA thay nước cất vơ trùng Sản phẩm PCR có kích thước 328bp Để kiểm tra hiệu trình tạo cDNA, phản ứng PCR với cặp mồi định tính đặc hiệu vùng khơng dịch mã 5’-UTR hệ gen virus LMLM Nếu cDNA tạo thành, sản phẩm phản ứng PCR có kích thước 328 bp sử dụng cặp mồi đặc hiệu FMD-1F FMD-1R Kết Hình 3.1 cho thấy, sản phẩm PCR sau chạy điện di gel agarose 1% từ mẫu cDNA cho băng DNA với kích thước khoảng 328 bp với kích thước đoạn ADN đích theo tính tốn lý thuyết Trong mẫu đối chứng âm (mẫu cDNA âm tính chuẩn) không cho băng sản phẩm DNA Qua kết phân tích sản phẩm PCR cho thấy cDNA tổng hợp sử dụng cho phản ứng khuếch đại gen tiếp theo, phục vụ cho trình nhân dịng, biểu gen mã hóa protein vỏ virus LMLM, tạo VLP - LMLM 3.4 Kết lựa chọn chủng làm nguyên liệu nghiên cứu Để lựa chọn chủng thích hợp dùng làm nguyên liệu cho thí nghiệm nghiên cứu sản xuất hạt giả VLP virus LMLM type O Chúng tơi tiến hành PCR đọc trình tự so sánh độ tương đồng gen VP1 chủng virus LMLM type O Việt Nam Sản phẩm PCR nhân gen VP1 chủng cho băng có kích thước khoảng 687 bp Đúng với kích thước theo dự kiến lý thuyết thiết kế cặp mồi cho gen VP1 Sản phẩm PCR Gen VP1 sau tinh chế lại phương pháp thơi gen theo kít Thermo gửi đọc trình tự bên cơng ty GenScript Kết nhận dùng phần mềm BioEdit phân tích độ tương đồng cho thấy chủng: KM 588394; KM 588384; KM 588387; KM 588388; KM 588396; KM 588397; HQ260718 có độ tương đồng cao với chủng công bố năm năm trước chủng type O năm 2010 có mã số O/VN/YB08/2010 ngân hang GenBank Hình 3.2: Ảnh điện di sản phẩm PCR gen VP1 chủng Giếng 1-7 kí hiệu tương ứng chủng thược vừng theo thứ tự bảng 3.2 M: maker DNA 1kb: Thermor 3.5 Tách dòng gen VP3, VP1-2A VP0 Sử cặp mồi tương ứng PCR nhân gen VP3, VP1-2A VP0 chạy kiểm tra gen agarose 1% kết thể hình 3.3a cho thấy, gen VP3 xuất băng theo tính tốn lý thuyết khoảng 684 bp, gen VP1-2A xuất băng theo tính tốn lý thuyết khoảng 692 bp VP0 xuất băng theo tính toán lý thuyết khoảng 876 bp 10 Tiến hành gắn cụm gen VP1-2A-VP3 vào vector pFastBacTM Dual enzyme ligate, sản phẩm ligate biến nạp vào tế bào chủng E.coli TOP 10 có bổ sung kháng sinh Ampicilin 50µg/mL Hình 3.5b ni khuẩn lạc tách thu plasmid tái tổ hợp kí hiệu pDUALVP1-2A-VP3, kiểm tra gen agarose 1% hình 3.5a Tiến hành phản ứng cắt kiểm tra cặp enzyme Bam HI Hind III Điện di kiểm tra gen gốc VP1-2A-VP3 maker gel agarose 1% Hình 3.4c, đường chạy số sản phẩm cắt văng băng có kích thước tương đương với kích thước cụm gen VP1-2A-VP3 gốc đường chay 1, khẳng định tạo thành cơng vector tái tổ hợp pDUALVP1-2A-VP3 Ngồi chúng tơi tiến hành đọc trình tự cặp mồi thiết kế vector pDual để kiểm tra vùng gen VP1-2A-VP3 plasmid pDUALVP1-2A-VP3:DualVP123-pf:5’-ttcataccgtcccaccatcg-3’; DualVP123-pr: 5’-ttatgatcctctagtacttctcg-3’ Hình 3.5: Ảnh đĩa biến nạp điện di kiểm tra DNA gel agarose 1% a 1; 2: plasmid p DualVP1-2A-VP3, b Đĩa biến nạp plasmid p Dual VP1-2A-VP3 vào chủng E.coli Top10, c 1: gen VP1-2A-VP3 gốc đối chứng; 2: Sản phẩm cắt kiểm tra plasmid p DualVP1-2A-VP3 BamHI HindIII 3.7.2 Tạo vector pDUALVP1-2A-VP3 mang gen VP0 Tương tự gắn gen VP1-2A-VP3 tạo vector pDualVP1-2A-VP3 Chúng biến nạp vector pDualVP1-2A-VP3 vector pUC57 mang gen VP0 tế bào E.coli TOP 10 hình 3.6a 11 Hình 3.6: Ảnh đĩa biến nạp kiểm tra DNA gel agarose 1% a: Đĩa biến nạp plasmmid vào chủng E.coli top 10, b: 1, 2: plasmid p DualVP12A-VP3; pUC57-VP0; X: vector pFastBacTM Dual, c: 1: Gen VP0; 2: vector p DualVP1-2A-VP3; M: Maker 1kb invitrogen Nuôi tách thu plasmid pDualVP1-2A-VP3 gen VP0, điện di kiểm tra gel agarose 1% hình 3.6b Cắt mở vòng vector pDualVP1-2A-VP3 cắt thu gen VP0 cặp enzyme NcoI SphI sản phẩm cắt tinh chế lại kit gen Invitrogen hình 3.6c Kiểm tra gel agarose 1% kết hình 3.6c cho thấy giếng số xuất băng có kích thước khoảng 897 bp theo lý thuyết Ở đường chạy số sản phảm cắt mở vòng vector pDual-VP1-2A-VP3 thấy xuất băng chứng tỏ vector pDual-VP1-2A-VP3 cắt mở vòng Tiến hành gắn gen VP0 vào vector p Dual-VP1-2A-VP3 Hình 3.7: Ảnh kiểm tra sản phẩm gắn gen VP0 vào pDual-VP1-2A-VP3 b: Đĩa biến nạp vector p Dual-VP1-2A-VP3 gắn gen VP0, b: Ảnh vector p Dual-VP1-2A-VP3 gắn gen VP0 sản phẩm cắt kiểm tra Kết trình tự phân tích phần mềm Bioedit tương đồng 100% với cụm gen tối ưu ban đầu theo lý thuyết Sau biến nạp vector pDual-VP1-2A-VP3 gắn gen VP0 vào tế bào E.coli TOP10 cấy trải đĩa thạch LB bổ sung kháng sinh Ampicilin 50µg/ml hình 3.7a Nhặt khuẩn lạc riêng rẽ nuôi tách thu plasmid tái tổ hợp pDual VP1-2A-VP3 mang gen VP0, kí hiệu pDual VP1-2A-VP3-VP0, 12 điện di kiểm tra gen agarose 1% plasmid pDual-VP1-2AVP3 chưa gắn gen VP0 kí hiệu X, kết hình 3.7b cho thấy plasmid pDual-VP1-2A-VP3 chưa gắn gen VP0 thấp hẳn so với giếng plasmid có gắn gen VP0 chạy nhau, Để xác định xác chúng tơi thực hai phản ứng cắt pDual VP1-2A-VP3-VP0 cặp enzyme NcoI SphI, sản phẩm cắt điện di kiểm tra vector pDual-VP1-2 A-VP3 (giếng 5, hình 3.7) gel agarose 1% hình 3.7b thấy plasmid rơi băng có kích khoảng 897pb cho thấy chúng tơi gắn thành công gen VP0 vào vector p Dual-VP1-2A-VP3 để tạo vector tái tổ hợp pDualVP1-2A-VP3-VP0 Ngoài vector tái tổ hợp pDualVP1-2A-VP3-VP0 gửi giải trình tự gen với cặp mồi: DualVP0-pf: 5’-acttgatcacccgggatctcg-3’, DualVP0-pr: 5’-cagttagcctcccccatctcc-3’ Kết đọc trình tự gen VP0 sau phân tích so sánh với VP0 tối ưu ban đầu kết tương đồng 100% Chứng tỏ gắn thành công gen VP0 vào vector pFastBacTM Dual 3.8 Tạo bacmid tái tổ hợp mang hai cụm gen VP1-2A-VP3 VP0 Hình 3.8: Biến nạp vector pDual VP1-2A-VP3-VP0 vào tế bào E.coli DH10bac điện di bacmid tái tổ hợp gel agarose 1% a Đĩa khuẩn lạc xanh trắng chủng E.coli DH10Bac b Ảnh kiểm tra bacmid gắn gen VP0, VP1-2A-VP3 tế bào E.coli DH10Bac c Ảnh sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu M13-F/R kiểm tra bacmid Vector tái tổ hợp pDual-VP1-2A-VP3-VP0 biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH10Bac Invitrogen phương pháp sốc nhiệt Nuôi môi trường thạch LB có bổ sung 50 µg/ml kanamycin, µg/ml gentamycin, 10 µg/ml tetracyclin 100 µg/ml Bluo-gal, 40 µg/ml chất cảm ứng IPTG để tạo khuẩn lạc xanh trắng hình 3.8a Chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc trắng khuẩn lạc xanh tiến hành ni tách bacmid hình 3.8b kit tách bacmid Invitrogen Để khẳng định q trình tạo bacmid thành cơng, chúng tơi tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu M13-F/R thiết kế vector baculovirus theo gợi ý kit Bac-to-Bac để khẳng định có mặt 13 cụm gen VP1-2A-VP3 VP0 vector Sản phẩm PCR đường chạy 1, 2, 3, bacmid tách từ khuẩn lạc trắng có kích thước khoảng 4845 bp kích thước gen cộng với 2560 pb theo gợi ý kit Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System có chuyện vị gen đích xảy Nếu khơng có chuyển vị sản phẩm PCR có kích thước 300 pb bacmid X tách từ khuẩn lạc xanh Chúng tơi giải trình tự cụm gen VP0, VP1-2A-VP3 để kiểm tra trình tạo bacmid Kết đọc trình tự so sánh với gen gốc tối ưu tương đồng 100% Chứng tỏ tạo thành công BacP1 mang hai cụm gen VP1-2A-VP3 VP0 3.9 Biểu BacP1 tế bào côn trùng tạo VLP virus LMLM 3.9.1 Ni cấy tế bào trùng Dịng tế bào Sf9 nuôi môi trường Sf-900 II SFM (Invitrogen) có bổ sung 10% FBS (Fetal Bovin Serum) 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen) nhiệt độ 27 ºC bình ni cấy T75 dạng bám đáy bình Kiểm tra tăng sinh tế bào sau 24 h, 48 h 72 h nuôi cấy Tế bào tiến hành cấy chuyển lần để làm tăng sinh số lượng tế bào đạt tới mật độ 8.105 trước lây nhiễm Hình 3.9: Hình thái tế bào Sf9 độ phóng đại khác a: Mật độ tế bào đưa vào ni cấy độ phóng đại 10x b: Mật độ tế bào sau 48 h nuôi cấy độ phóng đại 10x c: Mật độ tế bào sau 72 h ni cấy độ phóng đại40x 14 3.9.2 Nhiễm Bac P1 vào tế bào côn trùng Sf9 tạo Baculovirus stock P1 Hình 3.10: Hình thái tế bào SF9 giai đoạn khác a: Tế bào không nhiễm Bac P1 giờ, 24 giờ, 48 72 b: Trạng thái tế bào Sf9 sau nhiễm Bac P1 0h, 24 h, 48 h 72 Nhiễm BacP1 nồng độ µg vào tế bào côn trùng Sf9 hỗ trợ cellfectin, đĩa giếng sau Tế bào Sf9 sau nhiễm nuôi môi trường Grace’s Insect Cell Medium có bổ sung 10% FBS 1% kháng sinh (penicillin/streptomycin) Từ hình 3.10, giếng tế bào lây nhiễm BacP1 sau 72 h lây nhiễm tồn tế bào bị virus cơng vỡ P1 xác tế bào nhiều mặt môi trường: số lượng tế bào giảm sau ngày, giếng tế bào khơng bị nhiễm mật độ tế bào ngày dày đặc Với kết thu cho thấy bước đầu khẳng định trình nhiễm bacmid tái tổ hợp vào dịng tế bào trùng Sf9 thành công tạo Bac stock P1 sau chuẩn độ 1,2 x 106 pfu/mL Tiếp tục lây nhiễm Bac stock P1để tạo Bac stock P2 để có chuẩn độ thu đạt x 106 pfu/mL 15 3.9.3 Nhiễm biểu Bac stock P2 tế bào Sf9 tạo VLP Nuôi tế bào sf9 nồng độ 8x105 cells/ml 20 mL môi trường Grace’s Insect Cell Medium với 10% FBS kháng sinh (Penicillin/Streptomycin) mật độ 8x105 tế bào/mL Hình 3.11: Hình thái tế bào sau nhiễm Bac stock P2 16 ủ 30 phút 27oC tủ nuôi, tế bào bám đáy bình, nhỏ từ từ 200 µL Bac stock P2 vào 20 mL dịch tế bào Sf9 Nuôi tiếp tục nhiệt độ 27oC khơng có CO2, sau ngày quan sát dấu hiệu xâm nhiễm biến đổi tế bào Sf9 kính hiển vi điện tử ngược Kết sau ngày tế bào bị xâm nhiễm 80% sau ngày nuôi cấy tế bào bị phá vỡ hoàn toàn Tiến hành thu dịch ni Biến tính 100oC Loại cặn ly tâm Kiểm tra gel SDS-PAGE 12% Kết (hình 3.11a) so sánh với mẫu không nhiễm Bac stock P2 (giếng 3) cho thấy có protein tạo tương ứng 32 kDa kích thước VP0, băng kích thước khoảng 24kDa/28kDa tương đương kích thước VP1/ VP3, hoàn toàn khác với mẫu đối chứng đường chạy Có thể khẳng định biểu thành công protein vỏ virus LMLM type O Thực phản ứng miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể với kháng thể tồn phần virrus LMLM (hình 3.11b) Kết western blot kháng thể toàn phần FMDV hình 3.11b cho thấy xuất băng tương ứng kích thước VP0 (~32 kDa) VP1/VP3 (~24/28 Ka) Kết cho thấy protease 2A phân cắt thành cơng VP1-2A-VP3 thành VP1-2A VP3 Hình.3.11: Kiểm tra biểu protein sau 24 h, 48 h, 72 h, 96 h ni cấy Hình a :M: Maker GangNam Pink; giếng 1, 2,: protein sau; 72 h 96 h (3 ngày) nhiễm Bac stock P2; 3: Mẫu đối chứng khơng nhiễm baculovirus Hình b: Ảnh westen blot M: Maker Gangnam - StainTM; 1: Protein VP0, VP1, VP3 3.9.4 Kiểm tra tạo thành hạt giả virus kính hiển vi điện tử Kính hiển vi điện tử sử dụng để kiểm tra khả tự lắp ráp tạo VLP cấu trúc bậc ba phức hợp protein bề mặt VP1,VP3 VP2 Hình ảnh thấy xuất hạt VLP-LMLM với đường kính khoảng 25 nm ± (hình 3.12), tương tự đường kính hạt virus thực trung bình 25 nm Kết tương đồng với số nghiên cứu trước (Lee cs., 2013; Guoet cs., 2013) 17 Hình 3.12: Ảnh chụp TEM đánh giá hình thành VLP-LMLM 3.10 Tối ưu biểu tạo VLP-LMLM tế bào trùng 3.10.1 Xác định dịng tế bào côn trùng phù hợp để lây nhiễm biểu tạo VLP virut FMD Virus hệ (Bac stock P2) sản phẩm thu nhận sau nhiễm virus (Bac stock P1) mang toàn hai cụm gen tối ưu VP0 VP1-2AVP3 virus LMLM theo hướng dẫn kit Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System Các gen đồng biểu tế bào có khả tự lắp ráp để tạo thành lớp vỏ virus gọi virus dạng giả (VLP) Hình 3.13: Hình thái tế bào Sf sf 21 sau nhiễm biểu Hình 3.13 Để tối ưu cho trình biểu tạo VLP virus LMLM, thí nghiệm này, hai dịng tế bào trùng Sf9 Sf21 sử dụng làm tế bào chủ biểu nhằm lựa chọn dòng tế bào trùng thích hợp để sau biểu thu lượng VLP lớn Mật độ virus đưa vào thử nghiệm x 106 pfu, nồng độ tế bào x 106 mL, tương đương với MOI thu mẫu sau 96 h (dpi 4) Kết quan sát hình thái hai dịng tế bào côn trùng sau khoảng thời gian xâm nhiễm khác kính hiển vi đảo ngược Hình 3.13 cho thấy tế bào Sf9 bị phá vỡ số điểm sau 24 h xâm nhiễm tiếp tục lan sau 48 h Sau 96 h xâm nhiễm tế bào Sf9 bị phá vỡ hồn tồn lơ lửng mặt đĩa 18 mơi trường ni cấy Đối với tế bào Sf21, hình thái tế bào có biến đổi dạng hình amip sau bị lây nhiễm chậm không rõ ràng Sau 96h lây nhiễm, quan sát thấy hầu hết tế Sf9 bị phá vỡ tế bào Sf21 hầu hết chuyển thành dạng amip xuất vài điểm tế bào vỡ nát Kết xác đánh giá máy nanodrop kiểm tra để đánh giá lượng VLP-LMLM tạo rasau tủa PEGđược lượng VLP-LMLM thơ µg/mL tế bào Sf9 1,25 µg/mL Sf21.Từ kết lựa chọn tế bào Sf9 cho nghiên cứu 3.10.2 Xác định mật độ tế bào trùng lây nhiễm thích hợp Hình 3.14: Hình thái tế bào sau khoảng thời gian lây nhiễm khác mật độ tế bào khác Để xác định mật độ tế bào trùng thích hợp để lây nhiễm Bac stock P2 tạo lượng VLP-LMLM cao nhất, sử dụng mật độ tế bào Sf9 khác theo hướng dẫn kít Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System 1,5 x 106, x 106, 2,5 x 106 (Hình 3.14) Kết quan sát tế bào sau khoảng thời gian lây nhiễm khác cho thấy sau 96 h lây nhiễm, tế bào Sf9 bị phá vỡ nồng độ tế bào khác Tuy nhiên, tế bào Sf9 nồng độ 1,5 x 106 x 106 tế bào/mL bị phá vỡ hoàn toàn quan sát kính hiển vi điện tử ngược, nồng độ 2.5 x 106 tế bào/mL, quan sát thấy tế bào Sf9 chưa bị phá vỡ Điều khẳng định tủa VLP- LMLM PEG 6000 hòa lại mL PBS 1X sau đo nồng độ protein máy nanodrop thu nồng độ protein tương ứng 1,7 µg/mL; 3,2 µg/mL ; 3,1 µg/mL protein thơ 19 Vì vậy, chúng tơi lựa chọn nồng độ virus x 106 pfu/mL thích hợp để lây nhiễm vào x 106 tế bào/mL tế bào Sf9, tương đương với pfu/tế bào hay MOI Với nồng độ đo hiệu lây nhiễm thu 3.2 µg VLP-LMLM mL thơ sau tủa PEG Khi có VLP-LMLM thô tiến hành làm VLP-LMLM ly tâm siêu tốc hòa lại BPS 1X nồng độ 0.32 µg/mL 3.10.3 Kiểm tra protein gel polyacrylamid Western blot Dịch nhiễm biểu tạo VLP-FMD sau tủa PEG kiểm tra gel polyacrylamid 12 % để đánh giá biểu protein VP0, VP1, VP3 (Hình 3.15a) Hình ảnh điện di cho thấy protein VP0, VP1, VP3 khoảng thời gian khác (giếng 2, 3, 4, 5) xuất băng protein ngoại lai có kích thước 32 kDa, 24 kDa 28 kDa tương ứng kích thước protein VP0, VP1 VP3 so sánh với giếng khơng nhiễm khơng thấy có xuất băng Để khẳng định chắn trình biểu thành công, tiếp tục kiểm tra phương pháp Western blot Phân đoạn (~45 % sucrose) sau thu hồi phân tích Western blot (hình 3.15 b) Protein tái tổ hợp phân tách SDS-PAGE 12 % chuyển lên màng polyvinylidenedifluoride (PVDF) 0,4 µm, hệ thống chuyển màng ướt hãng Invitrogen Màng phủ % sữa gầy đệm 1x PBS-T h nhiệt độ phòng Sau màng ủ với kháng thể (kháng thể kháng virus LMLM thu từ huyết thỏ lây nhiễm virus LMLM) độ pha loãng 1:500 qua đêm oC Hình 3.15: Ảnh điện di kiểm tra biểu protein a: M: Maker protein GangNam Pink; Giếng 2, 3, 4,5: nhiễm Bac stock P1 sau 24 h, 48 h, 72 h, 96 h nhiễm, Giếng 1: mẫu không nhiễm baculovirus b: Kiểm tra Western blot: M: Maker; 1: Dịch tế bào nhiễm Bac stock P1 sau 72 h; 2: Dịch tế bào nhiễm Bac stock P1 sau 96 h 20 Sau màng rửa lần với 1x PBS-T (10 phút/lần) nhuộm với kháng thể 2: cộng hợp kháng thể kháng IgG thỏ có gắn HRP sản xuất chuột (anti-rat, Sigma) nhiệt độ phòng (1:5000) Sau rửa, màng ủ với chất luminescence Hình ảnh lên film hoạt tính Kết phân tích Western blot kháng thể FMDV tồn phần (Hình 3.15b) cho thấy xuất băng tương ứng kích thước VP0 (~32 kDa) VP1/VP3 (~24/28 Ka) Như ậy khẳng định rằng, biểu thành cơng tồn protein vỏ virus LMLM với nồng độ pfu/ tế bào 27 oC thu mẫu sau 96 h lây nhiễm 3.11 Đánh giá khả gây miễn dịch VPL-LMLM động vật 3.11.1 Đánh giá khả gây miễn dịch VPL-LMLM chuột Bảng 3.5: Kết xác định liều tiêm phù hợp kháng nguyênVLP-LMLM Mẫu chuột dương tính, theo dải nồng độ (Nồng độ: 200-250-300-400 ng/0.5 ml) Ngày lấy Nhóm 1: mẫu máu Nhóm 2: Nhóm 3: Nhóm 4: Nhóm Khơng 200 ng 250 ng 300 ng 5:400 ng tiêm 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 1/5 1/5 0/5 1/5 14 0/5 0/5 1/5 0/5 2/5 21 0/5 0/5 3/5 Mẫu dương tính số 0/5 0/5 0/5 2/5 3/5 mẫu máu thử nghiệm Sau tiêm 0,5 mL kháng nguyên VLP-LMLM nồng độ 200250-300-400 ng, sau 7, 14 21 ngày lấy máu để kiểm tra kháng thể kháng virus FMD phương pháp ELISA, sử dụng kit PrioCHECK (hãng ThermoFisher USA) Kết ELISA đọc bước sóng 450 nm Sau ngày tiêm kháng nguyên VLP-LMLM nồng độ 300 ng/liều 400ng/liều, phát kháng thể có 1/5 chuột thứ thứ Sau 21 ngày tiêm nông độ 300 ng/liều cho kết 2/5 chuột có phán ứng miễn dịch dương tính 400 ng/liều 3/5 chuột có phản ứng dương tính, với ngưỡng PI>50 (đạt 60 % số chuột thí nghiệm) Với liều tiêm lựa chọn 400 ng/0,5 ml/liều, cho kết 3/5 chuột lang sinh kháng thể sau tiêm Lượng kháng thể sinh ra, huyết chuột đạt nồng độ cao vào ngày thứ 21 tùy chuột 21 Bảng 3.6 Tổng kết thay đổi kháng thể (tính theo số ố PI) chuột thử nghiệm nồng độ 400 ng/liều Ngày Ngày Ngày 14 Ngày 21 ĐC 18,861 18.343 23.749 28.680 ĐC 22.576 36.582 25.862 43.764 ĐC 17.191 29.387 40.475 38.129 CL No 19 25.462 52.725 61.462 65.876 CL No 20 26.975 39.786 36.342 37.986 CL No 21 31.857 28.876 41.765 61.746 CL No 22 25.624 31.016 30.456 40.986 CL No 23 19.765 34.475 49.478 60.589 Ngay Ngay Ngay 14 Ngay 21 80 60 40 20 ĐC ĐC ĐC No 19 No 20 No 21 No 22 No 23 Hình 3.16: Kết xác định kháng thể sau tiêm kháng nguyên tái tổ t hợp (VLP-LMLM) nồng độ 400 ng/0,5 mL L 3.10.2 Kiểm tra độc tính kháng nguyên cho động ộng vật thí nghiệm Bảng 3.7: Bảng theo dõi chuộtt sau 10 ngày, sau tiêm VLP-LMLM Ngày thứ Nhóm Nhiệt độ Phản (bình ứng thường vị trí 37-39 tiêm o C) 37.8oC 0/7 38.0 0/7 37.5 0/7 38.3 0/7 37.9 0/7 38.0 0/7 37.7 Nhóm Trọng lượng trung bình (g) Phản ứng vị trí tiêm 247.8 247.1 249.0 249.3 250.1 249.9 252.4 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Nhiệt độ Nhi (bình thường 37 oC) 37-39 Trọng lượng trung bình (g) 38.1 oC 37.5 38.4 37.7 38.1 38.3 37.6 250.1 251.2 251.5 253.1 253.8 254.5 256.2 22 10 0/7 0/7 0/7 0/7 38.5 38.0 37.8 38.4 253.0 254.3 255.5 256.1 0/3 0/3 0/3 0/3 38.5 37.8 38.1 37.8 257.3 258.4 259.6 260.9 Sau tiêm kháng nguyên VLP-LMLM, theo dõi lâm sàng 10 ngày đánh giá kết phản ứng cục bộ, toàn thân, thay đổi trọng lượng Kết cho thấy: Liều tiêm 800 ng/1ml liều kháng nguyên không gây phản ứng cục toàn thân chuột lang Kháng nguyên coi an tồn sử dụng nồng độ thử nghiệm Chúng tiếp tục đánh giá VLP-LMLM thử nghiệm lên đối tượng bê 3.12 Đánh giá khả gây miễn dịch VPL-LMLM Bê 3.12.1 Nghiên cứu thử nghiệm liều sinh miễn dịch bê Sử dụng 24 Bê khỏe mạnh 40 kg-60 kg, chưa tiêm vaccine loại thử ngiệm VLP-LMLM Lấy máu tất 24 bê làm đối chứng trước tiêm, kiểm tra kháng thể ELISA- kit PrioCHECK (hãng ThermoFisher USA) Kết ELISA, có bê thuộc nhóm bê số 16 cho kết dương tính với kháng ngun LMLM chuẩn Số cịn lại, tất cho kết âm tính với kháng nguyên LMLM chuẩn Bê chia thành nhóm liều tiêu kháng nguyên tướng ứng 0,9 µg 1,8 µg, 3,6 µg, 7,2 µg, 14,4 µg , 28,8 µg/ liều tiêm Theo dõi cẩn thận, tiến hành lấy máu, thu huyết sau 28 ngày, đánh giá kit ELISA Instruction Manual VDPro® FMDV Type O ELISA hãng MEDIAN, xác định khả đáp ứng sinh kháng thể bê tiêm liều khác nhau, Sau 28 ngày thử nghiệm không phát thấy tượng bất thường nhóm thử nghiệm nhóm đối chứng, khơng viêm, khơng sưng, khơng gây phản ứng cục tồn thân bê Nồng độ 7,2 µg/0,75 mL/liều, cho kết 1/3 bê dương tính Nồng độ 5: 14,4 µg/1,5 mL/liều; Nồng độ 6: 28,8 µg/3 mL/liều nồng độ 7: 43,2 µg/4,5 mL/liều, cho kết 3/3 bê dương tính test ELISA kiểm tra kháng thể LMLM Kháng ngun coi an tồn sử dụng nồng độ thử nghiệm Với kết đạt được, xác định liều tiêm kháng nguyên phù hợp cho bê 28,8 µg/liều/con bê Tiến hành xác định hiệu giá kháng thể 3.12.2 Đánh giá hiệu giá kháng thể VLP-LMLM Huyết bê kiểm tra pha loãng theo tỷ lệ 1/8; 1/16; 1/32; 1/64/; 1/128; 1/256 Hiệu giá kháng thể phản ánh nồng độ kháng thể huyết thanh, hiệu giá kháng thể độ pha loãng huyết cao mà phản ứng cịn dương tính Kết hiệu giá kháng thể cho thấy, lượng kháng thể huyết cao, đặc biệt Bê số 19, với hiệu giá kháng thể lên đến 1/256 23 Bảng 3.9: Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể từ HT bê sau tiêm VLP- LMLM STT Nhóm TN Hiệu giá kháng thể LMLM Kết ĐC1 ĐC2 ĐC3 Bê 19 Bê 20 Bê 21 Âm tính Âm tính Âm tính 1/256 1/32 1/128 N N N P P P Như vậy, kháng nguyên VLP-LMLM thu nhận có tác dụng kích thích sinh kháng thể kháng virus LMLM với liều xác định 28,8 µg/3ml/liều bê sữa thử nghiệm, kết xác định hiệu giá kháng thể 1/256 cho thấy nồng độ kháng thể tạo cao sau tuần thử nghiệm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã phân lập thành công gen cấu trúc VP0; VP1-2A VP3 mã hóa protein vỏ virus LMLM type O phân lập Việt Nam, tối ưu tạo hai cụm gen VP1-2A-VP3 VP0 phù hợp cho biểu baculovirus tế bào côn trùng Sf9 Thiết kế thành công vector pFastBacTMDual mang đồng thời hai cụm gen VP0 VP1-2A-VP3 tạo bacmid tái tổ hợp mang đồng thời hai cụm gen VP0 VP1-2A-VP3 tế bào E.coli DH10bac Đã biểu thành công từ hai cụm gen VP0 VP1 -2A-VP3 tế bào côn trùng Sf9 tạo VLP virus LMLM type O với hàm lượng 3.2 µg/mL thơ 0.32 µg/mL tinh chế Kiểm tra tạo hạt giả virus kính hiển vi điện tử Đã đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch VLP-LMLM thành cơng động vật thí nghiệm (Chuột, Bê) Chuột 400 ng bê 28,8 µg/liều PI > 50 % (60 % số chuột thí nghiệm) Đã thử độc tính VLP-LMLM phối trộn với nhũ dầu kép chuột lang với nồng độ gấp lần liều kháng nguyên cho phép (800 ng/1 ml) Không thấy có biểu gây độc VLP-LMLM Đã thử nghiệm VLP-LMLM, đánh giá hiệu giá kháng thể huyết thu nhận nồng độ 28,8 µg/liều cho thấy, lượng kháng thể huyết bê cao với hiệu giá kháng thể 1/256 thấp bê số 20 với hiệu giá kháng thể 1/32 24 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu nâng cao tỉ lệ tạo hạt giả virus LMLMM trình biểu Nghiên cứu khả đáp ứng miễn dịch thời gian bảo hộ VLPLMM tiêm nhắc lại ... định hướng sản xuất vaccine? ?? Mục đích Nghiên cứu t? ?o hạt giả virus (VLP -virus like paticle) hệ biểu Baculovirus/ tế b? ?o côn trùng định hướng ứng dụng sản xuất vaccine lở mồm long móng Nội dung nghiên. .. t? ?o hạt giả virus VLP hướng tới mục tiêu sản xuất vaccine LMLM Với lý nêu trên, tiến hành thực đề tài:? ?Nghiên cứu t? ?o hạt giả virus Lở mồm long móng type O hệ biểu Baculovirus tế b? ?o côn trùng định. .. pháp t? ?o hạt giả VLP Các hệ thống biểu t? ?o VLP Các loại Vaccine VLP T? ?o VLP - LMLM trện hệ biểu baculovirus tế b? ?o côn trùng Vaccine lở mồm long móng dựa VLP 1.3 Thử nghiệm VLP virus LMLM type O