Thiết kế và biểu hiện trần thị hạnh hiền của virus lở mồm long móng type o trong tế bào côn trùng sf9

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SỸ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN CASSETTE VP0, VP1-2A-VP3 CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG TẾ BÀO CÔN TRÙNG SF9 TRẦN THỊ HẠNH HIỀN HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SỸ THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN CASSETTE VP0, VP1-2A-VP3 CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG TẾ BÀO CÔN TRÙNG SF9 TRẦN THỊ HẠNH HIỀN CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHẠM VIỆT CƢỜNG NCS NGUYỄN PHƢƠNG HOA HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, cố gắng nỗ lực thân, nhận đƣợc nhiều giúp đỡ quý báu cá nhân tập thể Nhân dịp này, cho phép tơi đƣợc bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới: Ban giám hiệu, thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học- Trƣờng Đại học Mở Hà Nội đào tạo, truyền tải kiến thức khoa học cho suốt trình học tập trƣờng Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Việt Cƣờng Viện Nghiên Cứu Khoa học Miền Trung , ngƣời hƣớng dẫn tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hoàng Dƣơng Th.s Nguyễn Phƣơng Hoa, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình giúp đỡ tơi thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn chân thành tới cô chú, anh chị Trung tâm Công nghệ sinh học phân tử Nghĩa Đô, Viện Nghiên Cứu Khoa học Miền Trung giúp đỡ tơi q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân tồn thể bạn bè, quan tâm, ủng hộ động viên tơi suốt q trình học tập tiến hành luận văn Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2017 Học viên Trần Thị Hạnh Hiền LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn thầy, cô hƣớng dẫn Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình Tác giả luận văn ( ký ghi rõ họ tên) Trần Thị Hạnh Hiền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG 1.2 TÌNH HÌNH BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.2.1 Tình hình bệnh LMLM giới 1.2.2 Tình hình phát triển bệnh LMLM Việt Nam 1.3 TRIỆU CHỨNG BỆNH TÍCH 1.3.1 Triệu chứng 1.3.2 Đƣờng xâm nhập virus phƣơng thức lây lan 11 1.3.3 Thời kỳ ủ bệnh 12 1.4 VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG 12 1.4.1 Hình thái cấu tạo 12 1.4.2 Phân loại 13 1.5 CẤU TRÚC HỆ GEN CỦA VIRUS LMLM 14 1.6 HỆ THỐNG BACULOVIRUS/TẾ BÀO CÔN TRÙNG 16 1.7 TẾ BÀO E.COLI DH10BAC 18 1.8 VECTOR pFASTBACTMDUAL 20 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 21 2.2 VẬT LIỆU 21 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1 Phƣơng pháp khuyếch đại gen PCR 22 2.3.2 Phƣơng pháp điện di gel agarose 23 2.3.3 Phƣơng pháp gắn DNA vào vector chuyển 23 2.3.6 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 26 2.3.7 Phƣơng pháp tạo Bacmid 26 2.3.8 Phƣơng pháp nuôi tế bào Sf9 27 2.3.9 Phƣơng pháp đếm tế bào sf9 27 2.3.10 Phƣơng pháp tạo baculovirus tái tổ hợp 28 2.3.11 Phƣơng pháp biểu baculovirus tái tổ hợp tế bào côn trùng Sf928 2.3.12 Phƣơng pháp Western Blot 29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 TẠO PLASMID VẬN CHUYỂN PFASTBACTMDUAL TÁI TỔ HỢP MANG GEN VP1-2A-VP3 32 3.2 TạO VECTOR PFAST-BAC DUAL TÁI Tổ HỢP MANG GEN VP1-2AVP3 VÀ VP0 35 3.3 TẠO BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO SF9 BIỂU HIỆN VP1-2A-VP3+ VP0 38 3.3.1 Tạo bacmid tái tổ hợp mang gen VP1-2A-VP3 + VP0 38 3.3.2 Nhiễm bacmid- VP1-2A-VP3+ VP0 tái tổ hợp tế bào côn trùng Sf9 tạo Baculovirus stock P1 41 3.4 NHIỄM BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP P1 BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG TẾ BÀO CÔN TRÙNG SF9 43 3.5 THU HỒI PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ 44 KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ .47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp : Ampicillin BP( bp) : Cặp Bazơ DNA maker : Thang DNA chuẩn DNA : Axit Deoxyribonucleic E.Coli : Escherichia Coli EDTA : Ethylen Diamine Tetra acetic Acid EtBt : Ethidium Bromide EU : Liên minh Châu Âu FDMV : Foot and Mouth Disease Virus Genome : Bộ gen LB : Môi trƣờng Lauria Betani LMLM : Bệnh lở mồm long móng OD : Optical Density (mật độ quang học) OIE : Office International Epidemiology (Tổ chức dịch tễ giới) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA : Axit Ribonucleic RT-PCR :Reverse transcriptase-PCR (Kỹ thuật phối hợp khuyếch đại trình tự RNA) SAT : South Africa Territories SDS : Sodium dodecyl sulphate TAE : Tris – Acetate – EDTA Taq polymerase: Polymerase Thermus aquaticus v/ph : vòng / phút WHO : Who Health Organization (Tổ chức Y tế giới) X-gal : 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl--D-Galactopyranoside IRES : International Ribosome Entry Site UTR : Untranslated Region DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ Bảng 1.1: Tình hình bệnh lở mồm long móng giai đoạn 1999-10/2004 .8 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hơp mang genVP1-2A-VP3 enzyme Bam HI Hind III 26 Bảng 3.1: Hàm lƣợng bacmid dùng để xâm nhiễm tế bào Sf9 41 Bảng 3.2: Trạng thái tế bào sau lây nhiễm 43 Hình 1.1: Bản đồ phân bố bệnh LMLM giới năm 2005 Hình 1.2: Triệu chứng LMLM trâu, bò lợn .10 Hình 1.3: Hình thái virus LMLM 13 Hình 1.4: Cấu trúc vỏ cuả virus LMLM 15 Hình 1.5: Sơ đồ mơ tả hệ thống Bac-to-Bac baculovirus expression .18 Hình 1.6: Cấu trúc vector pFastBac Dual 20 Hình 3.1: Kết nhân dịng vector pFastBacTM Dual .32 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm cắt vòng vector pFastBacTM Dual gen VP1-2AVP3 enzyme BamHI HindIII 33 Hình 3.3: Kết nhân dòng gen VP1-2A-VP3 .34 Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pFastBacTM Dual 35 mang gen VP1-2A-VP3 35 Hình 3.5a: Điện di đồ sản phẩm tách plasmid pUC19-VP0 pFastBacTM DualVP1-2A-VP3 36 Hình 3.5b: Điện di đồ sản phẩm cắt gen VP0 pFastBacTM Dual-VP1-2A-VP3 36 Hình 3.6a: Đĩa biến nạp vector pFastBacTM Dual VP1-2A-VP3 + VP0 37 Hình 3.6b: Sản phẩm tách plasmid pFastBacTM Dual VP1-2A-VP3 + VP0 .37 Hình 3.6c: Sản phẩm cắt plasmid pFastBacTM Dual VP1-2A-VP3+ VP0 37 Hình 3.7a: Các khuẩn lạc E.coli DH10Bac sau biến nạp vector pFastBacTMDual VP1-2A-VP3+ VP0 .38 Hình 3.7b: Sản phẩm tách bacmid VP1-2A-VP3+ VP0 1,2: bacmid mang gen VP12A-VP3+ VP0 38 Hình 3.8:Sản phẩm PCR gen VP1-2A-VP3+ VP0 39 Hình 3.9: Hình thái tế bào SF9 giai đoạn khác (250x) 42 Hình 3.10: Ảnh kiểm tra biểu protein sau 24h , 48h, 72h, 96h ni cấy 43 Hình 3.11: Kết Western Blot sau thu hồi protein ly tâm siêu tốc 44 LỜI MỞ ĐẦU Bệnh Lở mồm long móng (LMLM) bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm virus LMLM (Foot and Mouth Disease Virus- FMDV) gây lồi động vật móng guốc chẵn nhƣ trâu, bò, dê, cừu, lợn Bệnh có biểu đặc trƣng sốt cao hình thành mụn nƣớc niêm mạc miệng, kẽ chân da vú gia súc cảm thụ Bệnh gây thiệt hại lớn kinh tế khả lây lan nhanh nhiều loài gia súc, giảm sức sản xuất, gây ảnh hƣởng xấu đến suất, chất lƣợng sản phẩm chăn ni Bệnh khơng có thuốc ch a đặc hiệu, ch có vắc xin phịng bệnh Dịch lây lan nhanh làm nhiều gia súc nhiễm bệnh thời gian ngắn gây đại dịch Bệnh LMLM đƣợc Tổ chức Thú y Thế giới (Office Internationale des Epizooties - OIE) xếp vào bệnh đứng đầu danh mục bảng A - Bảng danh mục bệnh truyền nhiễm đặc biệt nguy hiểm động vật Bệnh LMLM xảy hầu hết châu lục: Châu Âu (bệnh đƣợc ghi nhận vào nh ng năm cuối kỷ 17), châu Á (Pakistan, Ấn Độ, v.v ), châu Phi (Nam Phi v.v.) Ở Việt Nam, bệnh đƣợc ghi nhận lần Nha Trang, năm 1898.Theo số liệu tổng hợp Cục thú y, tình hình dịch bệnh FMDV nh ng năm gần diễn với số ổ dịch số lƣợng gia súc mắc bệnh ngày tăng Tác nhân gây bệnh, virus lở mồm long móng loại picornavirus nhỏ, khơng vỏ với serotypes Virus dễ truyền nhiễm di chuyển vật nuôi bị bệnh sản phẩm động vật, đồ vật, bình phun, ngƣời bị nhiễm.Virus LMLM thành viên chi Aphthovirus thuộc họ Picornaviridae Picornaviruses virus nhỏ (đƣờng kính 27-30 nm) Virus lở mồm long móng có bảy loại (types) A, 0, C, Asia-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3 với 60 phân typ (subtypes) Các t p virus LMLM gây nh ng triệu chứng lâm sàng giống nhau, nhƣng miễn dịch chéo cho Cho đến trƣớc năm 2004, virus gây bệnh LMLM Việt Nam chủ yếu thuộc týp O Từ năm 2004, virus LMLM t p A lần lƣợt đƣợc phát t nh phía Nam đến Quảng Bình 35 1388bp p Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pFastBacTM Dual mang gen VP1-2A-VP3 1: Gen gốc VP1-2A-VP3 2: Sản phẩm cắt kiểm tra gen VP1-2A-VP3 M: Marker 1kb (Invitrogen) Quan sát hình 3.4 cho thấy sản phẩm cắt cho băng có kích thƣớc nằm gi a 1000pb 1500bp so sánh với marker, phù hợp với kích thƣớc gen VP1-2AVP3 theo tính tốn lý thuyết để tối ƣu gen 1388bp Ngoài ra, băng khác điện di đồ tƣơng đƣơng với kích thƣớc pFastBacTM Dual mở vòng 3.2 TạO VECTOR PFAST-BAC DUAL TÁI Tổ HỢP MANG GEN VP1-2AVP3 VÀ VP0 Vector pFastBacTM Dual mang gen VP1-2A-VP3 kí hiệu pFastBacTM DualVP1-2A-VP3 đƣợc mở vịng cặp enzyme khác SmaI SphI Cặp enzyme đƣợc thiết kế đoạn gen VP0 mã hóa protein vỏ virus LMLM Thực phản ứng cắt theo phƣơng pháp nêu vector mang gen tối ƣu VP0 nhƣ sau: 36 1000 750 Hình 3.5a: Điện di đồ sản phẩm tách Hình 3.5b: Điện di đồ sản phẩm cắt gen plasmid pUC19-VP0 pFastBacTM VP0 pFastBacTM Dual-VP1-2A-VP3 Dual-VP1-2A-VP3 1- cắt sản phẩm PCR gen VP0 1- Plasmid pUC19-VP0 2- pFastBacTM Dual-VP1-2A-VP3 2- plasmid pFastBacTM Dual-VP1-2A-VP3 M- maker 1kb invitrogen Gen VP0 có kích thƣớc 897 bp theo tính tốn lý thuyết Ở đƣờng chạy số sản phảm cắt mở vòng vector pFastBacTM Dual-VP1-2A-VP3 ch thấy xuất băng chứng tỏ vector đƣợc cắt mở vòng đảm bảo cho phản ứng ghép nối gen VP0 vào vector pFastBacTM Dual-VP1-2A-VP3 37 M 8000 6000 1000 750 Hình 3.6a: Đĩa biến nạp Hình 3.6b: Sản phẩm tách Hình 3.6c: Sản phẩm cắt vector pFastBacTM Dual plasmid pFastBacTM Dual plasmid pFastBacTM Dual VP1-2A-VP3 + VP0 VP1-2A-VP3 + VP0 VP1-2A-VP3+ VP0 Sau gắn VP0 vào pFastBacTM Dual-VP1-2A-VP3 mở vòng, sản phẩm gắn (ligase) đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến JM109, cấy trải đĩa thạch LB có bổ sung kháng sinh Ampicilin làm áp lực chọn lọc (Hình 3.6a) Tiến hành chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc, nuôi môi trƣờng LB qua đêm, sau tách thu plasmid Điện di kiểm tra sản phẩm plasmid đƣợc tách gen agarose 1% (Hình 3.6b) Plasmid đƣợc cắt kiểm tra enzyme SmaI SphI thiết kế để gắn gen VP0, kết thể hình 3.6c Điện di đồ (hình 3.6c) cho thấy, sản phẩm cắt có băng với kích thƣớc khoảng 897bp nằm gi a băng 750bp băng 1000bp băng khác kích thƣớc tƣơng ứng kích thƣớc pFastBacTM Dual-VP1-2AVP3 Nhƣ vậy, tạm khẳng đinh gen VP0 đƣợc gắnvào vector pFastBacTM Dual VP1-2A-VP3 38 3.3 TẠO BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO SF9 BIỂU HIỆN VP1-2A-VP3+ VP0 3.3.1 Tạo bacmid tái tổ hợp mang gen VP1-2A-VP3 + VP0 ADN plasmid pFastBacTMDual VP1-2A-VP3 +VP0 đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH10Bac phƣơng pháp sốc nhiệt, sau xử lý tế bào CaCl2 nồng độ 100 mM để tạo bacmid tái tổ hợp Tế bào E.coli DH10Bac sau biến nạp đƣợc nuôi mơi trƣờng LB đặc có bổ sung 50µg/ml Kanamycin 7µg/ml Gentamycin 10µg/ml Tetracyclin 100µg/ml Bluo-gal, 40µg/ml chất cảm ứng IPTG chọn lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp Sau biến nạp đĩa môi trƣờng LB thạch có bổ sung kháng sinh trên, chúng tơi thu đƣợc khuẩn lac xanh trắng nhƣ hình 3.7a 2 Bacmid VP12A-VP3+ VP0 Hình 3.7a: Các khuẩn lạc E.coli Hình 3.7b: Sản phẩm tách bacmid DH10Bac sau biến nạp vector VP1-2A-VP3+ VP0 pFastBacTMDual VP1-2A-VP3+ VP0 1,2: bacmid mang gen VP1-2A-VP3+ VP0 Chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc trắng tiến hành tách chiết bacmid (Hình 3.7b) Để kiểm tra có mặt tổ hợp gen nghiên cứu pFASTBac tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu pUC M13-F/R thiết kế vector baculovirus dòng bacmid tái tổ hợp chọn 39 M 5000bp PCR 4000bp Hình 3.8:Sản phẩm PCR gen VP1-2A-VP3+ VP0 1, 2,: Sản phẩm PCR gen VP1-2A-VP3+ VP0 M: maker kb cuả invitrogen Kết PCR đƣợc điện di kiểm tra gel agarose (Hình 3.8) Trên điện di đồ thấy, sản phẩm PCR từ bacmid xuất băng, trùng với kích thƣớc tổ hợp gen nghiên cứu, khoảng 4845bp Nhƣ vậy, dòng bacmid thu đƣợc mang tổ hợp gen ADN ngoại lai có kích thƣớc với kích thƣớc tổ hợp gen VP1-2A-VP3+ VP0 Từ kết thu đƣợc, nói việc chuyển vị gen mã hoá protein vỏ virus LMLM bƣớc đầu tạo bacmid tái tổ hợp thành công Nhƣ vậy, tạm khẳng định chọn đƣợc bacmid mong muốn, sử dụng bacmid số đối tƣợng cho nghiên cứu Để khẳng định chắn tạo đƣợc bacmid tái tổ hợp mang gen VP1-2A-VP3+ VP0 , bacmid số đƣợc xem có gắn gen VP1-2A-VP3+ VP0 đƣợc giải trình tự cặp mồi DualVP123-pf/r cho đoạn gen VP1-2A-VP3, cặp mồi DualVP0-pf/r cho đoạn gen VP0 ID VP0_S_Tu gan them Restriction Sites SQ SEQUENCE NheI 887 BP; 232 A; 250 C; PRELIMINARY; 219 G; DNA; 887 BP 186 T; NcoI GCTAGCCCAT GGACACAGGC TCAATTATCA ACAACTACTA CATGCAGCAA TACCAGAACT CAATGGACAC GCAACTCGGA GACAACGCGA TTTCGGGTGG CAGTAACGAG GGCTCGACAG ATACCACTAG TACGCACACA ACGAACACCC AGAACAACGA CTGGTTCTCT AAGCTCGCAT 40 CCAGCGCGTT CTCAGGCTTG TTCGGTGCTC TGCTGGCTGA TAAGAAAACT GAGGAAACCA CTTTGCTGGA GGACCGCATC CTGACAACGC GTAACGGACA CACCACTAGT ACAACGCAGT CTTCAGTCGG AGTTACTTAC GGTTACGCTA CAGCCGAAGA CTTCGTCTCC GGTCCTAACA CCTCCGGACT GGAGACCAGG GTTGTGCAAG CTGAAAGATT CTTCAAGACG CACCTCTTCG ACTGGGTGAC CTCCGATCCA TTCGGTAGAT GCCATCTGCT GGAGCTGCCG ACTGACCATA AAGGTGTCTA CGGCGGTTTG ACAGATAGCT ACGCATACAT GCGCAACGGT TGGGACGTGG AAGTCACTGC TGTGGGCAAC CAATTCAACG GAGGTTGCCT GCTCGTGGCT ATGGTCCCTG AGCTGTGTAG CATTCAAAAG CGCGAACTCT ACCAGTTGAC GCTGTTCCCA CACCAATTCA TCAACCCGCG TACAAACATG ACGGCCCATA TTAAGGTGCC ATTCGTTGGC GTGAACCGTT ACGACCAGTA CAAGGTCCAC AAACCGTGGA CATTGGTGGT CATGGTTGTG GCTCCTCTGA CCGTTAACAC TGAAGGAGCC CCCCAAATCA AGGTGTACGC AAACATTGCG CCTACCGACG TCCATGTTGC TGGAGAGTTC CCCTCAAAAG AATAAGCATG CGGTACC SphI KpnI // ID Vp1-2A-VP3-S Sau toi uu va gan Res Sites PRELIMINARY; DNA; 1382 BP SQ SEQUENCE 1382 BP; 336 A; 428 C; 340 G; 278 T; EcoRI BamHI GAATTCGGAT CCATGACGAC CAGCACAGGA GAATCAGCAG ATCCGGTTAC AGCGACGGTT GAAAACTACG GTGGAGAGAC GCAAGTCCAA AGACGCCACC ACACCGACGT GTCCTTCATC CTCGATAGGT TCGTTAAAGT GACTCCTCAA GACCAGATTA ACGTGCTCGA TTTGATGCAA ACCCCACCAC ACACTCTGGT CGGCGCGCTG CTCAGAACCG CTACTTACTA CTTCGCCGAC TTGGAGGTCG CCGTTAAGCA TGAAGGCGAT CTGACATGGG TCCCAAACGG AGCCCCGGAG GCAGCACTGG GTAACACCAC TAACCCTACC GCGTACCACA AGGCTCCCCT CACACGCCTG GCACTCCCTT ACACGGCACC ACATCGTGTG TTGGCAACTG TCTACAACGG TAACTGCAAG TACGCCGGTG GTCCACTGAC TAACGTCAGA GGTGACCTGC AAGTGCTCGC TCAAAAGGCT GCCCGCCCGC TGCCGACGTC TTTCAACTAC GGAGCCATCA AGGCAACCAG GGTCACTGAG TTGCTGTACA GGATGAAAAG AGCTGAAACC TACTGTCCAC GTCCGCTCTT GGCTGTGCAC CCAGATCAAG CCCGCCACAA GCAGAAAATT GTTGCTCCGG TGAAGCAAAG TTGGAAGTTC GACTTGCTGA AATTGGCCGG TGACGTCGAA AGTAACCCTG GCCCCGGAAT TTTCCCAGTC GCCTGCTCCG ACGGTTACGG AGGCCTGGTT ACAACGGACC CAAAGACCGC TGACCCTGTT TACGGAAAAG TTTTCAACCC TCCCCGCAAC ATGCTGCCAG GTCGTTTCAC GAACTTCCTC GACGTCGCCG AGGCATGTCC TACATTCCTG CACTTCGAGG GAGACGTCCC CTACGTTACC ACTAAGACAG ACTCGGATCG TATCCTCGCC CAGTTCGATT TGTCGCTGGC AGCGAAACAC ATGTCCAACA CCTTCTTGGC CGGACTGGCA CAGTACTACA CCCAATACTC CGGTACTATC AACCTGCATT TCATGTTCAC AGGCCCAACG GACGCGAAGG CTAGGTACAT GATTGCCTAC GCACCACCAG GAATGGAGCC TCCAAGGACC CCTGAAGCTG CCGCACACTG CATCCATGCT GAGTGGGACA CCGGACTCAA CTCTAAGTTC ACTTTCTCAA TTCCTTACTT GAGTGCGGCT 41 GACTACGCGT ACACAGCTTC CGATACGGCC GAAACAACGA ACGTTCAGGG TTGGGTGTGT CTGTTCCAAA TCACTCACGG AAAGGCCGAC GGTGACGCAC TCGTGGTCTT GGCGTCTGCT GGCAAAGACT TCGAACTCAG GTTGCCCGTG GATGCTAGAC AACAATAAAA GCTTGCGGCC GC HindIII NotI // Từ trình tự ADN nhận thấy, đoạn gen ngoại lai VP1-2A-VP3 gen VP0 đƣa vào vector baculovirus thành công, với đầy đủ mã mở đầu (ATG), mã kết thúc (TGA) tƣơng đồng 100% so với gen đƣợc tối ƣu theo l thuyết 3.3.2 Nhiễm bacmid- VP1-2A-VP3+ VP0 tái tổ hợp tế bào côn trùng Sf9 tạo Baculovirus stock P1 Bacmid tái tổ hợp chọn đƣợc nhiễm vào tế bào côn trùng Sf9 dƣới hỗ trợ cellfectin, thí nghiệm đƣợc thiết kế đĩa giếng nhƣ sau: Bảng 3.1: Hàm lượng bacmid dùng để xâm nhiễm tế bào Sf9 Nồng độ nhiễm bacmid Bacmid VP0+VP1-2A-VP3 0,5µg 1µg Khơng nhiễm 1,5µg 2µg Khơng nhiễm Các dịng tế bào Sf9 sau nhiễm đƣợc ni mơi trƣờng Grace’s Insect Cell Medium có bổ sung 10% FBS kháng sinh (Penicillin/Streptomycin) kiểm tra khả tạo baculovirus vịng 72 Từ hình 3.9 cho thấy, dòng tế bào đƣợc lây nhiễm bacmid có khác biệt so với dịng tế bào đối chứng: số lƣợng tế bào giảm sau ngày, dịng tế bào khơng bị nhiễm mật độ tế bào ngày dày đặc Điều thể rõ nồng độ 1µg, sau 72h lây nhiễm tồn tế bào bị virus cơng vỡ ra, xác tế bào nhiều mặt môi trƣờng Chứng tỏ nồng độ bacmid nhiễm vào µg thích hợp đƣa vào tế bào Sf9 42 Hình 3.9: Hình thái tế bào SF9 giai đoạn khác (250x) 1: Dạng bình thường tế bào SF9 2: Tế bào trước nhiễm Baculovirus 3: Tế bào nhiễm Baculovirus sau 24 4: Tế bào nhiễm Baculovirus sau 48 5: Tế bào nhiễm Baculovirus sau 72 43 Bảng 3.2: Trạng thái tế bào sau lây nhiễm Thời gian ngày Trạng thái tế bào sau lây nhiễm Màng tế bào phồng nhiều chỗ Tế bào bị nhiễm, hình dạng thay đổi rõ rệt, tế bào từ dạng tròn trở thành dạng amip, khơng phân chia Nhìn rõ thể hạt nhân ngày tế bào chất, đa số tế bào tách khỏi bề mặt, vỡ nát >3 ngày Phần lớn tế bào bị nhiễm,thể vùi lớn tràn khỏi nhân bắt đầu tế bào Với kết thu đƣợc, chúng tơi bƣớc đầu khẳng định trình nhiễm bacmid tái tổ hợp vào dịng tế bào trùng Sf9 thành cơng, baculovirus tạo phá vỡ dần tế bào chủ Sf9, thu dịch môi trƣờng nuôi cấy chứa virus tiến hành số phƣơng pháp kiểm tra 3.4 NHIỄM BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP P1 BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG TẾ BÀO CÔN TRÙNG SF9 kDa M Hình 3.10: Ảnh kiểm tra biểu protein sau 24h , 48h, 72h, 96h nuôi cấy M: Maker GangNam Pink 1,2, 3, 5: Mẫu nhiễm baculovirus sau 24h, 48h, 72h, 96h nuôi cấy 4: Mẫu đối chứng không nhiễm biểu Kết điện di kiểm tra biểu protein VP0, VP1, VP3 (hình 3.10) so 44 sánh với mẫu không nhiễm biểu cho thấy protein đƣợc tạo có kich thƣớc khoảng 32 kDa tƣơng đƣơng kích thƣớc VP0, băng kích thƣớc khoảng 24kDa tƣơng đƣơng kích thƣớc VP1/ VP3 hồn tồn khác với mẫu đối chứng Điều tạm khẳng định biểu thành công protein vỏ virus LMLM type O 3.5 THU HỒI PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ Tiến hành tƣơng tự nhƣ xử lý thu hồi protein tái tổ hợp cassette P12A- 3C Phân đoạn gi a (~45% sucrose) sau thu hồi đƣợc phân tích WB (hình 3.70) Protein tái tổ hợp đƣợc phân tách SDS-PAGE 12% chuyển lên màng polyvinylidenedifluoride (PVDF) 0,4 µm, hệ thống chuyển màng ƣớt hãng Invitrogen Màng đƣợc phủ 5% s a gầy đệm 1x PBS-T 1h nhiệt độ phịng Sau màng đƣợc ủ với kháng thể (kháng thể kháng LMLM thu từ huyết thỏ đƣợc lây nhiễm LMLM) độ pha loãng 1:500 qua đêm oC Sau màng đƣợc rửa lần với 1x PBS-T (10 phút/lần) nhuộm với kháng thể 2: cộng hợp kháng thể kháng IgG thỏ có gắn HRP sản xuất dê (anti-rat, Sigma) nhiệt độ phòng (1:5000) Sau rửa, màng đƣợc ủ với chất luminescence Hình ảnh đƣợc lên film hoạt tính Hình 3.11: Kết Western Blot sau thu hồi protein ly tâm siêu tốc Giếng M: marker protein (Hãng Gangnam - StainTM) Giếng 1: protein tái tổ hợp thu hồi ly tâm siêu tốc 45 Kết Western blot kháng thể LMLM hình 3.11 cho thấy xuất băng tƣơng ứng kích thƣớc VP0 (~32 kDa) VP1/VP3 (~24/28 Ka) Điều cho thấy protease 2A phân cắt thành công VP1-2A-VP3 thành VP1 VP3 Kết phản ứng Western Blot, cho thấy thành công việc biểu protein tái tổ hợp (mang cassetteVP0-VP1-2A-VP3) đƣợc chứng minh qua phản ứng kháng nguyên- kháng thể đặc hiệu Protease 2A có hoạt tính cắt VP1-2A-VP3 thành VP3 VP1-2A 46 KẾT LUẬN Đã tạo đƣợc vector chuyển pFastbac Dual tái tổ hợp mang toàn gen mã hóa protein vỏ virus LMLM type O viêt Nam Đã tạo đƣợc bacmid tái tổ hợp mang tồn gen mã hóa protein vỏ virus LMLM type O Việt Nam Đã biểu thành cơng tồn gen VP1-2A-VP3 VP0 mã hóa protein vỏ virus LMLM type O Việt Nam tế bào côn trùng Đã thu hồi đƣợc Protein vỏ virus LMLM type O Việt Nam 47 KIẾN NGHỊ Tiếp tục thực nh ng nghiên cứu tạo VLP dạng giả virus Lở mồm long móng định hƣớng sản xuất vaccin LMLM 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt a Đào Trọng Đạt: Góp phần vào việc đấu tranh phịng chống bệnh lở mồm long móng – Tạp chí KHKT thú y, tập VII, số – 2000 số chuyên đề bệnh lở mồm long móng ( Tr 6- 7) b Đỗ H u Dũng, Văn Đăng Kỳ: Dịch sốt lở mồm long móng Bắc Phi – Tạp chí KHKT thú y, tập VI, số – 1999( Tr 84 – 86) c Hạ Lƣơng Trụ: Tư liệu bệnh lở mồm long móng – Khoa chăn ni, đại học quốc gia Bình Đơng d Hồng Mạnh Lâm: Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh lở mồm long móng trâu, bị Đắc Lắc biện pháp phòng trị – Luận án tốt nghiệp thạc sĩ, 1997 e Hoàng Văn Nam, Văn Đăng Kỳ: Tình hình bệnh lở mồm long móng giới (1999 – 5/2000) – Tạp chí KHKT Thú y, tập VII, số – 2000 số chuyên đề bệnh lở mồm long móng ( Tr 99) f Nguyễn Tiến Dũng (Bộ môn virus, Viện thú y): Bệnh lở mồm long móng ( Bài tổng hợp) – Tạp chí KHKT thú y, Tập VII, số – 2000 số chuyên đề bệnh lở mồm long móng( tr8 – 17) Tài liệu Tiếng Anh a Alexandersen S., Zhang Z., Reid S.M., Hutchings G.H (2002) Quantities of infectious virus and viral RNA recovered from sheep and cattle experimentally b Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System An efficient site-specific transposition system to generate baculovirus for high-level expression of recombinant proteins c Bastos, A.D.S., Boshoff, C.I., Keet, D.F., Bengis, R.G and Thomson, G.R 2000 Natural transmission of foot-and-mouth disease virus between African buffalo (Syncerus caffer) and impal (Aepyceros melampus) in the Kruger National Park, South Africa Epid Infect 124: 591-598 d Cao Y, Zengjun Lu, Jiachuan Sun, Xingwen Bai, Pu Sun, Huifang Bao, Yingli Chen, Jianhong Guo, Dong Li, Xiangtao Liu, Zaixin Liu (2009) Synthesis of empty 49 capsid-like particles of Asia I foot- and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs Veterinary Microbiology 137: 10– 17doi:10.1016/j.vetmic.2008.12.007 e Casas Olascoaga, R., 1978 Summary of current reseache of Pan American footand-mouth disease center on oil adjuvanted vaccine Bull Off Int Epiz 89 (1112), 1015-1054 f Feng, Q., Chen, X., Ma, O., Liu, Y., Ding, M., Collins, R.A., Ko, L.S., Xing, J., Lau, L.T., Yu, A.C., Chen, J Serotype and VP1 gene sequence of a foot-and-mouth disease virus from Hong Kong (2002) Biochem Biophys Res Commun 302, (2003) 715–721 g Goodwin S, Tobias J Tuthill, Armando Arias, Richard A Killington, and David J Rowlands (2009) Foot-and-Mouth Disease Virus Assembly: Processing of recombinant Capsid Precursor by Exogenous Protease Induces Self-Assembly of Pentamers In Vitro in a Myristoylation-Dependent Manner J Virol, 83(21): 11275– 11282 doi:10.1128/JVI.01263-09 h Knowles, N.J., Davies, P.R., Henry, T., O’Donnell, V., Pacheco, J.M., Mason, P.W., 2001a, Emergence in Asia of foot-and-mouth disease viruses with altered host range: characterisation of alteration in the 3A protein J Virol 75, 1551-1556 ... GI? ?O DỤC VÀ Đ? ?O T? ?O VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SỸ THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN CASSETTE VP0, VP1-2A-VP3 CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG TẾ B? ?O CÔN TRÙNG SF9 TRẦN THỊ HẠNH HIỀN... tế b? ?o SF9 giai ? ?o? ??n khác (250x) 1: Dạng bình thường tế b? ?o SF9 2: Tế b? ?o trước nhiễm Baculovirus 3: Tế b? ?o nhiễm Baculovirus sau 24 4: Tế b? ?o nhiễm Baculovirus sau 48 5: Tế b? ?o nhiễm Baculovirus... xâm nhiễm v? ?o tế b? ?o côn trùng, tế b? ?o thực chép DNA gen biểu protein baculovirus tế b? ?o chết Ở hệ thống biểu baculovirus, protein thƣờng đƣợc biểu dƣới kiểm soát promoter mạnh gen polyhedrin