Nghiên cứu tạo hạt giả virus lở mồm long móng type o trong hệ biểu hiện baculovirus tế bào côn trùng định hướng sản xuất vaccine

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN PHƯƠNG HOA NGHIÊN CỨU TẠO HẠT GIẢ VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG HỆ BIỂU HIỆN BACULOVIRUS TẾ BÀO CÔN TRÙNG ĐỊNH HƯỚNG SẢN XUẤT VACCINE LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2020 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GUYỄN P NGHIÊN CỨU TẠO HẠT VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG HỆ BIỂU HIỆN BACULOVIRUS TẾ BÀO CÔN TRÙNG ĐỊNH HƯỚNG SẢN XUẤT VACCINE Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc Viện Hóa sinh biển PGS.TS Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học Hà nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sau sắc tới hai thầy hướng dẫn cho tơi hồn thành luận án, PGS TS Nguyễn Thị Kim Cúc, Viện Hóa sinh biển PGS TS Đinh Duy Kháng, Viện Công nghệ sinh học Kết đạt ngày hơm có tận tâm dạy dỗ, định hướng cho nghiên cứu, truyền cho niềm say mê kiến thức khoa học vững Một lần xin cảm ơn Thầy cô Tôi xin chân thành cảm ơn Chủ nhiệm đề tài TS Lê Thị Hồng Minh cho phép tạo điều kiện cho thực luận án theo hướng nghiên cứu đề Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung cử học, PGS TS Phạm việt Cường, TS Nguyễn Hoàng Dương, tập thể đồng nghiệp Trung tâm sinh học phân tử Nghĩa Đô, nơi làm việc tạo điều kiện giúp đỡ cho tơi hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sở đào tạo, Viện Công nghệ sinh học Ths Bùi Thị Hải Hà cán phụ trách NCS hướng dẫn gúp đỡ tơi suốt q trình học tập Cuối tơi xin chân thành cảm ơn bạn bè, gia đình bên tôi, cổ vũ động viên tôi, hồn thành tốt luận án Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nôi, ngày tháng năm 2020 Tác giả NCS Nguyễn Phương Hoa i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi thực số kết có cộng tác với cộng khác Tất số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên nghành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại luận án chưa cơng bố cơng trình khác Hà nôi, ngày tháng năm 2020 Tác giả NCS Nguyễn Phương Hoa ii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vi MỞ ĐẦU MỤC TIỂU NỘI DUNG NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh lở mồm long móng 1.1.1 Giới thiệu chung bệnh lở mồm long móng 1.1.2 Tình hình dịch bệnh LMLM giới 1.1.3 Tình hình dịch bệnh Việt Nam 1.2 Virus gây bệnh LMLM 1.2.1 Cấu trúc virus LMLM 10 1.2.2 Các type huyết Virus LMLM 13 1.2.3 Chẩn đoán bệnh LMLM 14 1.2.4 Đặc tính virus LMLM mức độ phân type 22 1.2.5 Vaccine phòng bệnh LMLM 24 1.3 Hạt giả virus (VLP) vaccine phát triển công nghệ VLP 29 1.3.1 Khái niệm VLP 30 1.3.2 Phương pháp tạo hạt giả virus VLP 30 1.3.3 Các hệ thống biểu tạo VLP 30 1.3.4 Các loại vaccine VLP 34 1.3.5 Hệ biểu VLP cho virus LMLM 38 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1 Vật liệu nghiên cứu 44 iii 2.2 Phương pháp nghiên cứu 46 2.2.1 Phương pháp RT-PCR tạo cDNA 46 2.2.2 Thiết kế primer để nhân dòng gen VP0, VP1-2A VP3 48 2.2.3 Tách dòng gen VP0, VP1-2A VP3, giải trình tự 49 2.2.4 Thiết kế vector pFastBacTM Dual mang gen VP0 VP1-2A-VP3 51 2.2.5 Tạo bacmid tái tổ hợp tế bào E coli DH10Bac 55 2.2.6 Biểu cụm gen VP0, VP1-2A-VP3 tế bào côn trùng .56 2.2.7 Tối ưu biểu hai cụm gẹn VP0, VP1-2A-VP3 tế bào côn trùng tạo VLP-LMLM lớn 59 2.2.8 Phương pháp điện di protein gel polyacrylamid 60 2.2.9 Phương pháp Western Blot 61 2.2.10 Phương pháp thu hổi VLP 61 2.2.11 Phương pháp soi kính hiển vi điện tử truyền qua 62 2.3 Đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch VLP-LMLM 63 2.3.1 Đánh giá đáp ứng miễn dịch VLP-LMLM chuột 63 2.3.2 Đánh giá gây đáp ứng miễn dịch VLP-LMLM bê 65 2.3.3 Kiểm tra độc tính VLP-LMLM chuột thí nghiệm 67 2.3.4 Đánh giá hiệu giá kháng thể VLP-LMLM 67 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 3.1 Phân lập gen cấu trúc VP0, VP1-2A VP3 68 3.1.1 Thiết kế primer cho gen VP0, VP1-2A VP3 68 3.1.2 Tổng hợp cDNA 69 3.1.3 Lựa chọn chủng làm nghuyên liệu nghiên cứu 70 3.1.4 Tách dòng giải trình tự gen VP0, VP1-2A VP3 71 3.1.5 Tối ưu gen VP0, VP1-2A P3 tạo thành hai cụm gen VP0, VP12A-VP3 75 3.2 Thiết kế vector pFastBacTM Dual mang gen VP0 VP1-2A-VP3 78 3.2.1 Kết tạo vector pFastBacTM Dual mang cụm gen VP1-2A-VP3 78 3.2.2 Tạo vector pFastBacTM DualVP1-2A-VP3 mang gen VP0 80 3.3 Tạo bacmid tái tổ hợp mang gen VP1-2A-VP3 VP0 tế bào E coli DH10Bac 82 iv 3.4 Biểu gen VP0, VP1-2A-VP3 tế bào côn trùng tạo VLP 84 3.4.1 Nuôi cấy tăng sinh lượng lớn tế bào côn trùng 84 3.4.2 Nhiễm bacmid tái tổ hợp vào tế bào côn trùng tạo Bac stock P1 85 3.4.3 Biểu Bac stock P2 tế bào côn trùng 87 3.4.4 Kiểm tra tạo thành VLP kính hiển vi điện tử TEM 90 3.5 Tối ưu biểu Bac stock P2 tế bào côn trùng 91 3.5.1 Xác định dịng tế bào thích hợp nhiễm biểu tạo VLP-LMLM lớn 91 3.5.2 Xác định nồng độ tế bào côn trùng khoảng thời gian thích hợp để lượng VLP-LMLM thu lớn 92 3.5.3 Kiểm tra protein gel polyacrylamid Western blot 93 3.6 Đánh giá khả gây miên dịch VP-LMLM động vật 95 3.6.1 Kết gây miễn dịch VLP-LMLM chuột lang 95 3.6.2 Kết kiểm tra độc tính VLP-LMLM chuột thí nghiệm .97 3.7 Kết đánh giá đáp ứng miễn dịch VLP-LMLM bê 98 3.7.1 Nghiên cứu thử nghiệm liều sinh miễn dịch bê 98 3.7.2 Đánh giá hiệu giá kháng thể VLP-LMLM 102 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 103 4.1 Phân lập gen cấu trúc VP0, VP1-2A VP3 103 4.2 Tối ưu codon hai cụm genVP0 VP1-2A-VP3 105 4.3 Biểu hai gen VP0, VP1-2A-VP3 tế bào côn trùng 106 4.4 Thử nghiệm VLP-LMLM động vật thí nghiệm 113 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 116 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ 117 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 119 TÀI LIỆU THAM KHẢO 128 v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích ATP Adenosine triphosphat APS Amonium persulphate Amp Ampicillin ARN Ribonucleic acid BSA Bovine serum albumin cDNA Complementary deoxyribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid CBB Comassie brillant blu R-250 EtBr Ethidium bromite ELISA Enzyme linked immunosorbent assay FMD Foot Mouth Disease FBS Phosphat buffered saline GDP Gross Domestic Product ELISA Enzyme linked immunosorbent assay IRES Internal Ribosome Entry Site Kb Kilo base IPTG Isopropylthio-β-D-galactosita LB Lauria Betani BLAST Basic Local Alignment Search Tool LMLM Lở mồm long móng mRNA Messenger Ribonuclease Acid TTH Tái tổ hợp vi NEB Native Elution Buffer NWB Native Wash Buffer NPB Native purification Buffer OIE Organization of International Epizootics ORF Open reading frame OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PBS Phosphat buffered saline PVDF Polyvinylidene difluoride RNA Ribonucleic acid RT Revesec transcriptase SDS Sodium dodecyl sulphat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphat- polyacrylamide gel electrophoresis TBS Tris buffered saline TEDED N, N, N’, N’- tetramethyl ethylenediamine TTBS Tween- Tris Buffered Saline UTR Untranslated region VLP Virus-like particles vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tóm tắt đợt bùng phát dịch LMLM 2007 đến 2017 Bảng 2.1: Danh sách mẫu bệnh phẩm virus LMLM sử dụng nghiên cứu .44 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR từ cDNA 47 Bảng 2.3: Thông tin cặp mồi FMDV-1F/1R sử dụng 47 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại sản phẩm PCR 48 Bảng 2.5: Phản ứng gắn gen VP1-2A-VP3 vào vector pFastBac TM Dual 53 Bảng 2.6: Trình tự cặp mồi M13 55 Bảng 2.7: Chu trình nhiệt phản ứng PCR gen VP0 vàVP1-2A-VP3 55 Bảng 2.8: Thành phần gel polyacrylamide12% 60 Bảng 2.9: Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch VPL-LMLM huột 63 Bảng 3.1: Kết tách chiết AR từ mẫu LMLM 69 Bảng 3.2: Các cặp primer khuếch đại gen VP0, VP3 VP1-2A 87 Bảng 3.3: Trạng thái tế bào sau lây nhiễm 95 Bảng 3.4: Kết xác định liều tiêm phù hợp kháng nguyênVLP-LMLM 96 Bảng 3.5: Tổng kết thay đổi kháng thể (tính theo số PI) chuột thử nghiệm nồng độ 400 ng/liều 97 Bảng 3.6: Bảng theo dõi chuột 10 ngày sau tiêm VLP-LML 99 Bảng 3.7: Kết kiểm tra huyết bê trước thử nghiệm 100 Bảng 3.8: Tổng hợp kết xác định liều sinh miễn dịch 101 Bảng 3.9: Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể từ HT bê 102 viii ACTCTGGTGG GAGCGCTCCT TCGTACTGCC ACTTACTACT TTGCTGATCT AGAGGTGGCA GTGAAACACG AGGGGGATCT CACCTGGGTA CCAAATGGAG CACCTGAGGC AGCCTTGGGT AATACCACCA ACCCAACGGC ATACCACAAA GCGCCACTCA CTCGGCTTGC ACTGCCTTAC ACGGCACCAC ACCGTGTTCT GGCTACCGTT TACAACGGGA ACTGCAAATA CGCTGGGGGT CCACTGACCA ACGTGAGAGG CGATCTCCAG GTGCTGGCTC AGAAGGCGGC GAGGCCGCTG CCTACCTCCT TCAACTATGG TGCCATCAAA GCCACCCGGG TGACAGAACT GCTGTACCGC ATGAAGAGGG CCGAGACGTA TTGCCCGCGG CCTCTTTTGG CCGTCCACCC GGATCAAGCT AGACACAAAC AGAAAATTGT GGCACCTGTG AAACAGTCCT GGAAGTTTGA CCTGCTCAAG TTGGCGGGAG ACGTTGAGTC CAACCCCGGG CCAGGGATTT TCCCTGTGGC ATGTAGCGAC GGTTACGGCG GTTTGGTGAC CACTGACCCA AAGACGGCTG ACCCCGTCTA CGGCAAGGTG TTTAACCCCC CCCGTAACAT GTTGCCGGGG CGGTTCACCA ACTTCTTGGA TGTGGCCGAG GCGTGCCCCA CGTTTCTGCA CTTCGAAGGT GACGTGCCAT ACGTGACCAC GAAGACGGAC TCAGACAGGA TTCTCGCGCA ATTTGACTTG TCTCTGGCAG CAAAACACAT GTCAAACACC TTTCTTGCAG GTCTTGCCCA GTACTACACG CAGTACAGTG GTACGATCAA CCTGCACTTC ATGTTCACAG GTCCCACTGA CGCGAAAGCG CGTTACATGA TTGCATACGC CCCACCGGGT ATGGAGCCGC CTCGCACGCC TGAGGCCGCT GCCCATTGCA TTCATGCTGA GTGGGACACG GGTTTGAATT CAAAGTTCAC CTTTTCCATC CCATATCTCT CAGCAGCTGA CTACGCATAC ACCGCGTCTG ACACTGCCGA GACCACAAAT GTTCAGGGAT GGGTCTGCTT GTTCCAGATA ACACACGGGA AAGCTGACGG CGACGCTCTT GTCGTGCTGG CCAGCGCTGG TAAAGACTTT GAGCTGCGCT TGCCTGTGGA CGCCCGCCAA CAGTAG // Trình tự gen VP1-2A-VP3 sau tối ưu virus LMLM type O Việt Nam ID Vp1-2A-VP3-S Sau toi uu va gan Res Sites PRELIMINARY; DNA; BP SQ SEQUENCE 1382 BP; 336 A; 428 C; 340 G; 278 T; EcoRIBamHI GAATTCGGAT CCATGACGAC CAGCACAGGA GAATCAGCAG ATCCGGTTAC AGCGACGGTT GAAAACTACG GTGGAGAGAC GCAAGTCCAA AGACGCCACC ACACCGACGT GTCCTTCATC CTCGATAGGT TCGTTAAAGT GACTCCTCAA GACCAGATTA ACGTGCTCGA TTTGATGCAA ACCCCACCAC ACACTCTGGT CGGCGCGCTG CTCAGAACCG CTACTTACTA CTTCGCCGAC TTGGAGGTCG CCGTTAAGCA TGAAGGCGAT CTGACATGGG TCCCAAACGG AGCCCCGGAG GCAGCACTGG GTAACACCAC TAACCCTACC GCGTACCACA AGGCTCCCCT CACACGCCTG GCACTCCCTT ACACGGCACC ACATCGTGTG TTGGCAACTG TCTACAACGG TAACTGCAAG TACGCCGGTG GTCCACTGAC TAACGTCAGA GGTGACCTGC AAGTGCTCGC TCAAAAGGCT GCCCGCCCGC TGCCGACGTC TTTCAACTAC GGAGCCATCA AGGCAACCAG GGTCACTGAG TTGCTGTACA GGATGAAAAG AGCTGAAACC TACTGTCCAC GTCCGCTCTT GGCTGTGCAC 11 1382 CCAGATCAAG CCCGCCACAA GCAGAAAATT GTTGCTCCGG TGAAGCAAAG TTGGAAGTTC GACTTGCTGA AATTGGCCGG TGACGTCGAA AGTAACCCTG GCCCCGGAAT TTTCCCAGTC GCCTGCTCCG ACGGTTACGG AGGCCTGGTT ACAACGGACC CAAAGACCGC TGACCCTGTT TACGGAAAAG TTTTCAACCC TCCCCGCAAC ATGCTGCCAG GTCGTTTCAC GAACTTCCTC GACGTCGCCG AGGCATGTCC TACATTCCTG CACTTCGAGG GAGACGTCCC CTACGTTACC ACTAAGACAG ACTCGGATCG TATCCTCGCC CAGTTCGATT TGTCGCTGGC AGCGAAACAC ATGTCCAACA CCTTCTTGGC CGGACTGGCA CAGTACTACA CCCAATACTC CGGTACTATC AACCTGCATT TCATGTTCAC AGGCCCAACG GACGCGAAGG CTAGGTACAT GATTGCCTAC GCACCACCAG GAATGGAGCC TCCAAGGACC CCTGAAGCTG CCGCACACTG CATCCATGCT GAGTGGGACA CCGGACTCAA CTCTAAGTTC ACTTTCTCAA TTCCTTACTT GAGTGCGGCT GACTACGCGT ACACAGCTTC CGATACGGCC GAAACAACGA ACGTTCAGGG TTGGGTGTGT CTGTTCCAAA TCACTCACGG AAAGGCCGAC GGTGACGCAC TCGTGGTCTT GGCGTCTGCT GGCAAAGACT TCGAACTCAG GTTGCCCGTG GATGCTAGAC AACAATAAAA GCTTGCGGCC GCHindIIINotI // ===31-AUG-2016================NALIGN=======================PC/GENE=== Kết sánh hai gen VP1-2A-VP3 trước sau tối ưu codon The two sequences to be aligned are: VP1-2A-VP3-S Total number of bases: 1356 VP1-2A-VP3-T Total number of bases: 1356 Open gap cost : 10 Unit gap cost : 10 The character to show that two aligned residues are identical is '|' VP1-2A-VP3-S - ATGACGACCAGCACAGGAGAATCAGCAGATCCGGTTACAGCGACGGTTGA -50 ||||| || || || || ||||| || || || || || || ||||| VP1-2A-VP3-T - ATGACCACTTCGACGGGCGAGTCAGCCGACCCCGTGACCGCTACCGTTGA -50 VP1-2A-VP3-S - AAACTACGGTGGAGAGACGCAAGTCCAAAGACGCCACCACACCGACGTGT -100 ||||||||||| ||||| || ||||| || || |||||||| ||||| | VP1-2A-VP3-T - GAACTACGGTGGCGAGACACAGGTCCAGAGGCGTCACCACACAGACGTCT -100 VP1-2A-VP3-S - CCTTCATCCTCGATAGGTTCGTTAAAGTGACTCCTCAAGACCAGATTAAC -150 12 | || || | || || || || ||||| || || |||||||| ||||| VP1-2A-VP3-T - CATTTATATTGGACAGATTTGTGAAAGTCACACCACAAGACCAAATTAAT -150 VP1-2A-VP3-S - GTGCTCGATTTGATGCAAACCCCACCACACACTCTGGTCGGCGCGCTGCT -200 || | || ||||||| ||||| || ||||||||||| || ||||| || VP1-2A-VP3-T - GTTTTGGACCTGATGCAGACCCCCCCCCACACTCTGGTGGGAGCGCTCCT -200 VP1-2A-VP3-S - CAGAACCGCTACTTACTACTTCGCCGACTTGGAGGTCGCCGTTAAGCATG -250 | || || ||||||||||| || || | ||||| || || || || | VP1-2A-VP3-T - TCGTACTGCCACTTACTACTTTGCTGATCTAGAGGTGGCAGTGAAACACG -250 VP1-2A-VP3-S - AAGGCGATCTGACATGGGTCCCAAACGGAGCCCCGGAGGCAGCACTGGGT -300 VP1-2A-VP3-T - AGGGGGATCTCACCTGGGTACCAAATGGAGCACCTGAGGCAGCCTTGGGT -300 VP1-2A-VP3-S - AACACCACTAACCCTACCGCGTACCACAAGGCTCCCCTCACACGCCTGGC -350 | || ||||| || ||||| ||||| ||||| || |||||||| ||||| || ||||| ||||| || || |||||||| || || ||||| || || || VP1-2A-VP3-T - AATACCACCAACCCAACGGCATACCACAAAGCGCCACTCACTCGGCTTGC -350 VP1-2A-VP3-S - ACTCCCTTACACGGCACCACATCGTGTGTTGGCAACTGTCTACAACGGTA -400 ||| ||||||||||||||||| ||||| |||| || || |||||||| | VP1-2A-VP3-T - ACTGCCTTACACGGCACCACACCGTGTTCTGGCTACCGTTTACAACGGGA -400 VP1-2A-VP3-S - ACTGCAAGTACGCCGGTGGTCCACTGACTAACGTCAGAGGTGACCTGCAA -450 ||||||| ||||| || ||||||||||| ||||| ||||| || || || VP1-2A-VP3-T - ACTGCAAATACGCTGGGGGTCCACTGACCAACGTGAGAGGCGATCTCCAG -450 ===02-SEP-2016===========RESTRI===========================PC/GENE=== ***************************** * RESTRICTION-SITE ANALYSIS * ***************************** Done on DNA sequence VP1-2A-VP3-Sau TU+Res sites, total number of bases: 1382 - The sequence was considered to be: LINEAR - The analysis was done on bases to 1382 13 - Danh sách trình tự enzyme cắt gen VP1-2A-VP3 List of cuts by enzyme ====================== AatII : 499 AccI : 401 AciI : 218 686 845 887 329 483 487 583 612 767 804 1375 1379 AclI : 1241 AcyI : 93 496 683 842 884 1312 AeuI : 358 528 698 745 818 1088 AflIII : 107 959 1205 AluI : 562 1117 1216 1371 ApaLI : 595 ApoI : 707 AsuI : 279 430 700 756 1042 1106 AsuII : 1331 AvaII Bam HI : 279 : 430 756 1106 BbvI : 313 465 476 800 961 1104 BcgI : 1345 BetI : 42 636 1009 1150 BglI : 298 520 985 BinI : 15 34 BsgI : 853 BsiYI : 372 703 781 BsmFI : 265 871 1159 BsmAI : 70 875 Bsp1407I : 545 BspMI : 464 1031 BsrI : 311 715 930 989 BsrBI : 585 BssHII : 203 BssKI : 293 356 526 696 702 743 816 BstEII : 451 CauII : 295 194 923 704 14 1086 1121 1195 CfrI : 674 977 1226 1376 Cfr10I : 424 676 Csp6I : 333 420 546 993 1013 1065 DdeI : 211 536 902 1139 1163 1336 DpnI : 41 269 605 917 DraII : 279 1106 DraIII : 385 DrdI : 244 DsaI : 1346 Eco57I Eco RI : 1133 : EcoRII : 356 526 696 743 816 1086 Esp3I : 70 875 Fnu4HI : 208 302 479 490 814 950 1118 1121 FnuDII : 205 331 1054 1207 FokI : 103 564 1117 1363 HaeIII : 676 1043 1228 1285 1378 HgaI : 87 HgiAI : 167 HgiCI : 375 HgiJII : 294 HhaI : 205 207 Hin6I Hind III : : 203 1369 205 HinfI : 31 141 910 1154 HpaII : 43 295 425 637 677 704 980 1010 HphI : 463 651 691 1303 MaeI : MaeII : 107 161 443 496 579 683 842 884 893 1241 MaeIII : 45 138 310 409 451 531 679 691 733 39 267 603 915 1209 1196 1376 1379 701 101 467 743 1060 979 1301 1303 599 1151 1061 1355 894 1291 MboI : McrI : 1229 1379 MluI : 1205 15 747 MnlI : 130 155 237 934 1109 158 254 291 358 442 733 809 843 847 870 MseI : 134 MslI : 106 MwoI : 298 475 520 985 1204 1213 NlaIII : 15 262 278 813 857 963 1035 1071 1138 NlaIV : 280 281 291 344 377 513 702 758 1108 NotI : 1376 NspI : 813 857 963 NspBII : 489 769 PleI : 135 904 PpuMI : 279 1106 PshAI : 82 277 442 RsaI : 334 421 547 994 1014 1066 1210 ScaI : 994 ScrFI : 295 358 528 698 704 745 818 SduI : 167 294 467 599 SecI : 293 527 696 702 848 1102 1346 SfaNI : 164 1139 1341 SgrAI : 424 StuI : 743 StyI : 1102 TaqI : 122 167 659 686 839 875 935 TfiI : 31 Tsp509I : 626 670 707 1178 XcmI : 972 XhoII : 39 XmaIII : 1226 1376 Total number of cuts is : 1097 1148 1088 1331 339 Sorted list of enzymes by number of cuts ======================================== + + + 16 + + | MnlI : 13 | MboI : | HgiAI : | BcgI : : 12 | Tsp509I : | BsmFI : | Eco57I : : 12 | HgaI : | XmaIII : | AccI : : 11 | BetI : | BspMI : | HgiCI : : 11 | BinI : | Cfr10I : | AsuII : : 10 | BsrI : | PpuMI : | DraIII : : | AatII : | Hin6I : | Bsp1407I : : | SduI : | CauII : | StuI : : | CfrI : | Esp3I : | MluI : : | AvaII : | XhoII : | NotI : : | AluI : | HhaI : | BsrBI : : | FokI : | MaeI : | ScaI : : | FnuDII : | BsmAI : | AclI : : | HphI : | DraII : | BstEII : : | HinfI : | ApoI : | EcoRI : : | PshAI : | NspBII : | XcmI : : | NspI : | McrI : | BsgI : : | PleI : | StyI : | SgrAI : | | MaeIII | | AciI | | Fnu4HI | | NlaIV | | MaeII | | HpaII | | NlaIII | | HaeIII | | ScrFI | | BssKI | | TaqI | | BbvI | | SecI | | Csp6I | | RsaI | | AsuI | | EcoRII | 17 | MwoI : | AflIII : | DsaI : | HindIII : : | BglI : | BssHII : | DrdI : : | MseI : | MslI : | ApaLI : : | SfaNI : | BamHI : | TfiI : : | BsiYI : | HgiJII : | | AeuI | | AcyI | | DdeI | | DpnI | | + + + + + List of non cutting selected enzymes ==================================== Acc65I , AflII , AgeI , AhaIII , AhyI , AlwNI , ApaI , AscI , AvaI , AvrII , BalI , BbeI , BbvII , BclI , BglII , BsaAI , BsaBI , BsmI , Bsp120I , BspHI BspMII , BsrDI , BstXI , ClaI , BspM90I , , Eam1105I, Ecl136II, Eco31I , Eco47III, Eco56I , Eco78I , EcoNI , EcoRV , EcoT22I , EspI , FseI , HaeII , HindII , HpaI , KasI , KpnI , Ksp632I , MboII , MfeI , MstI , NaeI , NarI , NcoI , NdeI , NheI , NruI , PacI , PflMI , PmaCI , PmeI , Ppu10I , PstI , PvuI , PvuII , RsrII , SacI , SacII , SalI , SapI , SauI , SexAI , SfeI , SfiI , SgfI , SmaI , SnaBI , SpeI , SphI , SplI , SrfI , Sse8387I, SspI , SwaI , Tth111I , VspI , XbaI , XhoI , XmnI , GsuI Total number of selected enzymes which not cut: 84 Sorted list of cuts =================== + + | D | ApoI + + 333 Csp6I | 698 AeuI | 1013 Csp6I 334 RsaI | 698 ScrFI | 1014 RsaI | | Tsp509I | | 18 + | EcoRI U | 344 NlaIV | 700 AsuI | 1031 BspMI D | | BinI | 356 EcoRII | 701 HaeIII | 1035 NlaIII MboI | 356 BssKI | 702 BssKI | 1042 AsuI | | | | BamHI U | 358 MnlI | 702 SecI | 1043 HaeIII XhoII D | 358 ScrFI | 702 NlaIV | 1054 FnuDII NlaIV | 358 AeuI | 703 BsiYI | 1060 HgaI DpnI | 372 BsiYI | 704 CauII D | 1061 MaeI 15 NlaIII | 375 HgiCI U | 704 HpaII | 1065 Csp6I 15 BinI | 377 NlaIV | 704 ScrFI | 1066 RsaI 31 TfiI U | | 1071 NlaIII | | | | | | D | | | | | | 385 DraIII U | 707 Tsp509I U | 707 ApoI | | 31 HinfI | 401 AccI D | 1086 BssKI 34 BinI | 409 MaeIII | 715 BsrI | 1086 EcoRII 420 Csp6I | 733 MnlI | 1088 AeuI | 733 MaeIII | 1088 ScrFI | | | | 39 XhoII D | | | 39 MboI | 421 RsaI 41 DpnI | 424 Cfr10I D | 743 StuI 42 BetI | 424 SgrAI U | 743 BssKI | 1102 StyI 43 HpaII | 425 HpaII | 743 HaeIII | 1102 SecI 45 MaeIII | 430 AsuI | 743 EcoRII | 1104 BbvI | | U | 1097 NlaIV | | U | | | | | 19 | 70 Esp3I D | 430 AvaII | 745 AeuI | 1106 PpuMI 70 BsmAI D | 442 MnlI | 745 ScrFI | 1106 DraII 82 PshAI | 442 PshAI | 747 MaeIII | 1106 AsuI 87 HgaI | 443 MaeII | 756 AsuI | 1106 AvaII 93 AcyI | 451 MaeIII | 756 AvaII | 1108 NlaIV 101 HgaI | 451 BstEII U | 758 NlaIV | 1109 MnlI 103 FokI | 463 HphI 767 AciI | 1117 AluI 106 MslI U | D | | D | | | | | | | | | | | | | 464 BspMI D | 769 NspBII D | 1117 FokI | | 107 AflIII | 465 BbvI | 781 BsiYI | 1118 Fnu4HI 107 MaeII | 467 HgiAI | 800 BbvI | 1121 Fnu4HI 122 TaqI | 467 SduI | 804 AciI | 1121 AciI 130 MnlI | 475 MwoI | 809 MnlI | 1133 Eco57I 134 MseI | 476 BbvI | 813 NlaIII | 1138 NlaIII 135 PleI | 479 Fnu4HI | 813 NspI | 1139 DdeI 138 MaeIII | 483 AciI | 814 Fnu4HI | 1139 SfaNI 141 HinfI | 487 AciI | 816 EcoRII | 1148 PleI 155 MnlI | 489 NspBII D | 816 BssKI | 1150 BetI 158 MseI | 490 Fnu4HI | 818 AeuI | 1151 HpaII | | | | | | U | | | | | | | | | | | | | 20 | 161 MaeII | 496 AcyI | 818 ScrFI | 1154 HinfI 164 SfaNI | 496 MaeII | 839 TaqI | 1159 BsmFI 167 SduI | 499 AatII | 842 MaeII | 1163 DdeI 167 TaqI | 513 NlaIV | 842 AcyI | 1178 Tsp509I 167 HgiAI | 520 MwoI | 843 MnlI | 1195 AciI 194 BbvI | 520 BglI | 845 AatII | 1196 Fnu4HI | | | | | | | | | | | | 203 Hin6I D | 526 BssKI | 847 MnlI | 1204 MwoI 203 BssHII U | 526 EcoRII | 848 SecI | 1205 MluI 205 FnuDII | 527 SecI | 853 BsgI U | 1205 AflIII 205 HhaI D | 528 AeuI | 857 NspI | 1207 FnuDII 205 Hin6I D | 528 ScrFI | 857 NlaIII | 1209 Csp6I 207 HhaI D | 531 MaeIII | 870 MnlI | 1210 RsaI | 871 BsmFI | 1213 MwoI | 1216 AluI | | U | | | | | | | | | | 208 Fnu4HI | 536 DdeI 211 DdeI | 545 Bsp1407I U | 875 TaqI 218 AciI | 546 Csp6I | 875 BsmAI D | 1226 XmaIII 237 MnlI | 547 RsaI | 875 Esp3I D | 1226 CfrI 244 DrdI U | 562 AluI | 884 MaeII | 1228 HaeIII 254 MseI | 564 FokI | 884 AcyI | 1229 McrI | | | | D | | | | | | D | 21 | 262 NlaIII | 579 MaeII | 887 AatII | 1241 AclI 265 BsmFI | 583 AciI | 893 MaeII | 1241 MaeII 267 MboI | 585 BsrBI U | 894 MaeIII | 1285 HaeIII 269 DpnI | 595 ApaLI U | 902 DdeI | 1291 MaeIII 277 PshAI | 599 HgiAI | 904 PleI | 1301 HgaI 278 NlaIII | 599 SduI | 910 HinfI | 1303 HgaI 279 PpuMI D | 603 MboI | 915 MboI | 1303 HphI 279 AvaII | 605 DpnI | 917 DpnI | 1312 AcyI 279 AsuI | 612 AciI | 923 BinI | 1331 TaqI 626 Tsp509I | 930 BsrI | 1331 AsuII U | | | | | | | | | | | | | | | | | | 279 DraII D | 280 NlaIV | 636 BetI | 934 MnlI | 1336 DdeI 281 NlaIV | 637 HpaII | 935 TaqI | 1341 SfaNI 291 NlaIV | 651 HphI | 950 Fnu4HI | 1345 BcgI 291 MnlI | 659 TaqI | 959 AflIII | 1346 DsaI 293 BssKI | 670 Tsp509I | 961 BbvI | 1346 SecI 293 SecI | 674 CfrI | 963 NlaIII | 1355 MaeI U | 676 HaeIII | 963 NspI | 1363 FokI | 676 Cfr10I D | 972 XcmI U | 1369 HindIII U | | | | | | U | | U | | | | D | | 294 HgiJII | | 294 SduI U | 22 | 295 ScrFI | 677 HpaII | 977 CfrI | 1371 AluI 295 HpaII | 679 MaeIII | 979 HaeIII | 1375 AciI 295 CauII D | 683 MaeII | 980 HpaII | 1376 XmaIII | | | | D | | 298 BglI | 683 AcyI | 985 BglI | 1376 Fnu4HI 298 MwoI | 686 TaqI | 985 MwoI | 1376 CfrI 302 Fnu4HI | 686 AatII | 989 BsrI | 1376 NotI 310 MaeIII | 691 HphI | 993 Csp6I | 1378 HaeIII 311 BsrI | 691 MaeIII | 994 ScaI U | 1379 McrI | 313 BbvI | 696 BssKI | 994 RsaI | 1379 AciI | 329 AciI | 696 SecI | 1009 BetI | 1379 Fnu4HI | 331 FnuDII | 696 EcoRII | 1010 HpaII | | | | | U | | | | D | + + - + - + U: Unique restriction site for this enzyme (on the complete sequence) D: Enzyme with two restriction sites (on the complete sequence) ===02-SEP-2016==================RESTRI=========================PC/GENE=== ===31-AUG-2016==================PALIGN=========================PC/GENE=== *************************************** Kết so sánh trình tự protein suy diền gen VP1-2A-VP3 trước sau tối ưu codon *************************************** The two sequences to be aligned are: VP1-2A-VP3-S Total number of residues: 451 VP1-2A-VP3-T Total number of residues: 451 23 + Comparison matrix : Structure-genetic matrix Open gap cost : Unit gap cost : The character to show that two aligned residues are identical is '|' VP1-2A-VP3-S - MTTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRHHTDVSFILDRFVKVTPQDQIN -50 VP1-2A-VP3-T |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VP1-2A-VP3-S - MTTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRHHTDVSFILDRFVKVTPQDQIN -50 - VLDLMQTPPHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGDLTWVPNGAPEAALG -100 VP1-2A-VP3-T |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VP1-2A-VP3-S - VLDLMQTPPHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGDLTWVPNGAPEAALG -100 - NTTNPTAYHKAPLTRLALPYTAPHRVLATVYNGNCKYAGGPLTNVRGDLQ -150 VP1-2A-VP3-T |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VP1-2A-VP3-S - NTTNPTAYHKAPLTRLALPYTAPHRVLATVYNGNCKYAGGPLTNVRGDLQ -150 - VLAQKAARPLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLLAVHPDQA -200 VP1-2A-VP3-T |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VP1-2A-VP3-S - VLAQKAARPLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLLAVHPDQA -200 - RHKQKIVAPVKQSWKFDLLKLAGDVESNPGPGIFPVACSDGYGGLVTTDP -250 VP1-2A-VP3-T |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VP1-2A-VP3-S - RHKQKIVAPVKQSWKFDLLKLAGDVESNPGPGIFPVACSDGYGGLVTTDP -250 - KTADPVYGKVFNPPRNMLPGRFTNFLDVAEACPTFLHFEGDVPYVTTKTD -300 VP1-2A-VP3-T |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VP1-2A-VP3-S - KTADPVYGKVFNPPRNMLPGRFTNFLDVAEACPTFLHFEGDVPYVTTKTD -300 - SDRILAQFDLSLAAKHMSNTFLAGLAQYYTQYSGTINLHFMFTGPTDAKA -350 VP1-2A-VP3-T |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VP1-2A-VP3-S - SDRILAQFDLSLAAKHMSNTFLAGLAQYYTQYSGTINLHFMFTGPTDAKA -350 - RYMIAYAPPGMEPPRTPEAAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYLSAADYAY -400 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 24 VP1-2A-VP3-T - RYMIAYAPPGMEPPRTPEAAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYLSAADYAY -400 VP1-2A-VP3-S - TASDTAETTNVQGWVCLFQITHGKADGDALVVLASAGKDFELRLPVDARQ -450 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| VP1-2A-VP3-T - TASDTAETTNVQGWVCLFQITHGKADGDALVVLASAGKDFELRLPVDARQ -450 VP1-2A-VP3-S - Q -451 | VP1-2A-VP3-T Identity - Q -451 : 451 (100.00%) Number of gaps inserted in VP1-2A-VP3-S: Number of gaps inserted in VP1-2A-VP3-T: ===31-AUG-2016==================PALIGN=========================PC/GENE=== 25 ... LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GUYỄN P NGHIÊN CỨU T? ?O HẠT VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG HỆ BIỂU HIỆN BACULOVIRUS TẾ B? ?O CÔN TRÙNG ĐỊNH HƯỚNG SẢN XUẤT VACCINE. .. t? ?o hạt giả virus VLP hướng tới mục tiêu sản xuất vaccine LMLM Với lý nêu trên, tiến hành thực đề tài:? ?Nghiên cứu t? ?o hạt giả virus Lở mồm long móng type O hệ biểu Baculovirus tế b? ?o côn trùng định. .. cao hiệu kinh tế Hiện nay, hướng nghiên cứu t? ?o hạt giả virus (Virus like particle-VLP) xem bước đột phá công nghệ sản xuất vaccine hệ VLP t? ?o protein cấu trúc virus, có cấu trúc tương tự hạt virus