so sánh một số phương pháp phòng thí nghiệm chẩn đoán virus lở mồm long móng tại việt nam

luận văn thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, luận văn

B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I ========== ========== TR N ðÌNH LĂNG SO SÁNH M T S PHƯƠNG PHÁP PHỊNG THÍ NGHI M CH N ðỐN VIRUS L M M LONG MÓNG T I VI T NAM LU N VĂN TH C SĨ NÔNG NGHI P Chuyên ngành : Thú y Mã s : 60.62.50 Ngư i hư ng d n khoa h c: TS NGUY N VĂN C M HÀ N I - 2009 L I C M ƠN Trong trình th c t p th c hi n lu n văn này, s c g ng n l c c a b n thân, tơi đư c s hư ng d n tr c ti p c a TS Nguy n Văn C m Tơi xin đư c bày t lòng bi t ơn sâu s c nh t t i th y hư ng d n TS Nguy n Văn C m, ngư i ñã giành nhi u th i gian q báu t n tình giúp đ tơi su t trình th c hi n hồn thành lu n văn Tơi xin chân thành c m ơn t i: - Ban Giám ñ c, t p th phịng Virus, Trung tâm Ch n đốn Thú y TƯ - Lãnh đ o tồn th cán b , nhân viên Trung tâm Ki m nghi m Thu c Thú y TƯ1 - Vi n ðào t o sau ð i h c, Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Gia đình, b n bè, đ ng nghi p ðã ln t o ñi u ki n, ñ ng viên, giúp đ tơi su t q trình h c t p, nghiên c u hoàn thành lu n văn Nhân d p này, tơi xin bày t lịng bi t ơn t i TS Tô Long Thành, PGS TS Ph m Ng c Th ch giúp đ tơi q trình nghiên c u hồn thành lu n văn Hà N i, ngày 19 tháng năm 2009 H c Viên Tr n ðình Lăng Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nơng nghi p ………………………i L I CAM ðOAN T«i xin cam đoan l công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn l trung thực v cha đợc công bố công trình n o khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn đ đợc rõ nguồn gốc Tỏc gi Tr n ðình Lăng Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………ii DANH M C CÁC B NG STT Tên B ng Trang B ng 4.1: Ch t lư ng m u b nh ph m LMLM năm (2007-4.2009) 41 B ng 4.2: K t qu ch n đốn b ng phương pháp ELISA 45 10 11 12 13 14 B ng 4.3: K t qu ch n đốn b ng phương pháp Realtime PCR B ng 4.4: K t qu ch n đốn b ng phương pháp phân l p môi trư ng t bào BHK21 B ng 4.5: Th i gian ch n đốn b ng phương pháp ELISA B ng 4.6: Th i gian ch n ñoán b ng phương pháp Realtime PCR B ng 4.7: Th i gian ch n đốn b ng phương pháp phân l p môi trư ng t bào BHK21 B ng 4.8: So sánh th i gian ch n ñoán c a phương pháp B ng 4.9: So sánh ñ nh y tương ñ i gi a phương pháp B ng 4.10: Chi phí xét nghi m cho m t m u b nh ph m LMLM b ng phương pháp ELISA B ng 4.11: Chi phí xét nghi m cho m t m u b nh ph m LMLM b ng phương pháp Realtime PCR B ng 4.12: Chi phí xét nghi m cho m t m u b nh ph m LMLM b ng phương pháp phân l p t bào BHK21 B ng 4.13: So sánh chi phí gi a phương pháp cho m t m u xét nghi m B ng 4.14: Năng l c th c hi n phương pháp ch n đốn virus LMLM c a m t s ñơn v 47 49 53 54 56 57 58 61 62 64 65 66 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………iii DANH M C CÁC CH BHK 21 B-ME BSC CEF CPE CQTY DMSO DNA dNTP EDTA ELISA FAO FCS FMD FMDV GSO KHKT LMLM MDBK MEM MHC-II OIE OPD PBS RNA RT-PCR TTCðTYTƯ Vero VNT VI T T T VÀ ðƠN V Baby Hamster Kidney 21 B-Mercaptoethanol Bio Safety Cabinet Chicken Embryo Fibroblast Cyto Pathic Effect Cơ Quan Thú y Dimethylsulfoxide Dinucleotide Acid DeoxyriboNucleotide Triphosphate Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid Emzyme - Linked Immunosorbent Assay Food and Agriculture Organization Foetal Cafl Serum Foot and Mouth Disease Foot and Mouth Disease Virus General Statistics Office Khoa H c K Thu t L M m Long Móng Madin-Darby Bovine Kidney Minimum Essential Medium Major Histocompatibility Complex class II International Office des Epizootics (nay World Organisation for Animal Health) Ortho- Phenylenediamine Phosphate Buffer Saline Ribonucleotide Acid Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Trung tâm Ch n đốn Thú y TƯ African green monkey kidney Virus Neutralization Test Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………iv VP1 WTO µ g l M ml N UI ρ Varial Protein World Trade Organization Micro Gram Lít Mol Millilít ðương lư ng gram ðơn v qu c t (International Unit) Picro Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………v M CL C PH N I M ð U i 1.1 TÍNH C P THI T C A ð TÀI 1.2 M C TIÊU C A ð TÀI .2 PH N II T NG QUAN TÀI LI U 2.1 CĂN B NH 2.1.1 Phân b serotype virus LMLM th gi i 2.1.2 Hình thái, c u trúc c a virus LMLM 2.1.3 Phân lo i bi n type c a virus 2.1.4 ð c tính ni c y c a virus LMLM 2.1.5 S c ñ kháng 2.1.6 ð c l c c a virus LMLM .8 2.1.7 Cơ ch sinh b nh 2.1.8 S mang trùng c a ñ ng v t m n c m 2.2 TÌNH HÌNH B NH LMLM TRÊN TH GI I .10 2.3 D CH T H C B NH LMLM .14 2.3.1 Loài v t m c b nh 14 2.3.2 L a tu i 15 2.3.3 Mùa v .15 2.3.4 Kh lây lan .16 2.3.5 T l m ch t 16 2.3.6 ðư ng truy n b nh .16 2.4 TRI U CH NG VÀ B NH TÍCH B NH LMLM .17 2.4.1 Tri u ch ng lâm sàng 17 2.4.2 B nh tích 18 2.5 CH N ðOÁN B NH LMLM .19 2.5.1 Ch n ñoán lâm sàng 19 2.5.2 Ch n đốn phịng thí nghi m 20 2.6 PHÒNG B NH .22 2.6.1 Khi chưa có d ch x y 22 2.6.2 Khi d ch x y 24 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nơng nghi p ………………………vi 2.7 TÌNH HÌNH VÀ NGHIÊN C U B NH LMLM VI T NAM 24 2.7.1 Tình hình b nh LMLM Vi t Nam 24 2.7.2 Nh ng nghiên c u v b nh LMLM Vi t Nam 26 PH N III ð I TƯ NG, N I DUNG, ð A ðI M, V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 27 3.1 ð I TƯ NG, N I DUNG VÀ ð A ðI M NGHIÊN C U .27 3.1.1 ð i tư ng nghiên c u 27 3.1.2 N i dung nghiên c u 27 3.1.3 ð a ñi m nghiên c u 27 3.2 V T LI U NGHIÊN C U 28 3.2.1 Máy móc 28 3.2.2 D ng c 28 3.2.3 Hoá ch t .29 3.2.4 Nguyên li u 29 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 30 3.3.1 Phương pháp l y m u, b o qu n, v n chuy n b nh ph m phát hi n virus LMLM 30 3.3.2 Phương pháp nuôi c y virus LMLM môi trư ng t bào BHK21 31 3.3.3 Phương pháp ELISA xác ñ nh type virus LMLM .33 3.3.4 Phương pháp Real-time PCR 36 3.3.4.2 Ti n hành 37 3.3.5 X lý s li u .39 PH N IV K T QU VÀ TH O LU N 40 4.1 CH T LƯ NG M U B NH PH M NH N VÀ M U B NH PH M ðI L Y T I TRUNG TÂM CH N ðOÁN THÚ Y TƯ .40 4.2 K T QU CH N ðOÁN PHÁT HI N VIRUS LMLM 43 4.2.1 K t qu ch n ñoán b ng phương pháp ELISA 43 4.2.2 K t qu ch n đốn b ng phương pháp Real-time PCR 46 4.2.3 K t qu ch n đốn b ng phương pháp phân l p môi trư ng t bào BHK21 .48 4.3 SO SÁNH TH I GIAN CH N ðOÁN C A CÁC PHƯƠNG PHÁP 51 4.3.1 Th i gian ch n đốn b ng phương pháp ELISA 52 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………vii 4.3.2 Th i gian ch n đốn b ng phương pháp Real-time PCR 54 4.3.3 Th i gian ch n đốn b ng phương pháp phân l p môi trư ng t bào BHK21 .55 4.3.4 So sánh th i gian ch n đốn c a phương pháp .57 4.4 SO SÁNH ð NH Y TƯƠNG ð I GI A CÁC PHƯƠNG PHÁP 58 4.5 SO SÁNH V HI U QU KINH T GI A CÁC PHƯƠNG PHÁP 60 4.5.1 Chi phí xét nghi m cho m t m u b nh ph m LMLM b ng phương pháp ELISA 60 4.5.2 Chi phí xét nghi m cho m t m u b nh ph m LMLM b ng phương pháp Real-time PCR .62 4.5.3 Chi phí xét nghi m cho m t m u b nh ph m LMLM b ng phương pháp phân l p t bào BHK21 63 4.5.4 So sánh chi phí gi a phương pháp cho m t m u xét nghi m 65 4.6 NĂNG L C TH C HI N CÁC PHƯƠNG PHÁP .66 PH N V K T LU N VÀ ð NGH 68 5.1 K T LU N 68 5.2 ð NGH 69 TÀI LI U THAM KH O 70 PH L C 78 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………viii PH N I M ð U 1.1 TÍNH C P THI T C A ð TÀI Nông nghi p chi m 60% t tr ng n n kinh t nư c ta Chăn ni, đ c bi t chăn ni gia súc ñóng góp lư ng th c ph m l n cho nhu c u th t c a toàn dân Theo T ng C c Th ng kê (GSO) năm 2007 [62], t ng ñàn trâu 2,99 tri u con, ñàn bò 6,72 tri u con, ñàn l n 26,56 tri u con, ñàn gia c m 226 tri u con, dê c u 1,77 tri u Trong nh ng năm g n ñây, ñư c s quan tâm ch ñ o sát c a ð ng Nhà nư c, ngành Nơng nghi p nói chung ngành Chăn ni Thú y nói riêng có nh ng bư c chuy n bi n rõ r t Tuy nhiên tình hình d ch b nh v n di n bi n h t s c ph c t p, b nh L M m Long Móng (LMLM) v n liên ti p x y nư c khu v c B nh ñư c t ch c Thú y Th gi i (OIE) đưa vào v trí đ u tiên danh m c b nh truy n nhi m nguy hi m c a gia súc B nh virus FMDV (Foot and Mouth Disease Virus) gây ra, thư ng th c p tính; lây lan nhanh, m nh; cịn đư c g i d ch LMLM Các lồi đ ng v t gu c ch n trâu, bị, l n, dê c u đ u m c B nh gây thi t h i l n v kinh t nh hư ng ñ n thương m i, ñ c bi t vi c buôn bán gia súc s n ph m gia súc Ngoài nh ng thi t h i vi c tri n khai ch ng d ch, b nh LMLM tr c ti p gây s y thai kho ng 25% ch a, làm gi m 25% s n ph m th t, 50% s n lư ng s a 25% s n lư ng lông c u [19], [1] Phòng ch ng d ch b nh LMLM ln sách c a m i Qu c gia Th gi i Virus gây b nh LMLM thu c lo i RNA virus, h Picornaviridae, có hư ng thư ng bì Virus đư c chia thành serotype: O; A; C; SAT 1; SAT 2; SAT Asia 1, có 70 subtype khác [22], [31] Trong nh ng năm g n ñây Vi t Nam, type O, type A, Asia l n lư t Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………1 phân l p môi trư ng t bào s 570 nghìn đ ng Như v y ñ ñi ñ n k t qu cu i ch n đốn virus LMLM đ nh type virus, phương pháp ELISA phương pháp nhanh nh t, chi phí nh t; hai phương pháp cịn l i th i gian chi phí xét nghi m đ u cao Khơng nh ng v y kh ph bi n c a phương pháp ELISA d dàng hơn, trang thi t b không ph c t p, d ñào t o xét nghi m viên 4.6 NĂNG L C TH C HI N CÁC PHƯƠNG PHÁP B ng 4.14: Năng l c th c hi n phương pháp ch n đốn virus LMLM c a m t s đơn v Có ngư i chuyên trách Phương pháp ðơn v ELISA Real-time PCR Phân l p t bào Có TT Ch n đốn TYTW + + + + CQ TY Vùng - - - + CQ TY Vùng - - - + CQ TY Vùng - - - + CQ TY Vùng - - - + CQ TY Vùng - - - + CQ TY Vùng + + + CQ TY Vùng - - - Khơng + + (+): Có đ y đ trang thi t b , ngư i chuyên trách, làm thư ng xuyên (-): Thi u trang thi t b c n thi t, khơng làm Nh m đánh giá v kh th c hi n phương pháp ch n đốn b nh LMLM, chúng tơi ti n hành kh o sát l c th c hi n phương pháp Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………66 ch n đốn virus LMLM t i m t s ñơn v K t qu ñư c trình bày t i b ng 4.14 Qua b ng 4.14 chúng tơi th y, ch có đơn v có kh làm ñư c c phương pháp ch n đốn phát hi n virus LMLM Trung tâm Ch n đốn Thú y TƯ mi n b c Cơ quan Thú y vùng mi n nam Hai quan đ u có ngư i chun trách ñ m nhi m vi c xét nghi m m u b nh ph m LMLM Trang thi t b , nguyên li u ñư c ñ u tư hi n ñ i, ñ ng b cho phịng thí nghi m ch n đốn s d ng phương pháp Cịn phịng thí nghi m thu c Cơ quan Thú y Vùng khác không th c hi n ñư c Nguyên nhân ñây t i phịng thí nghi m ho c h khơng có trang thi t b , máy móc c n thi t, đ ng b ho c khơng có ngư i đư c đào t o chuyên trách v lĩnh v c xét nghi m Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………67 PH N V K T LU N VÀ ð NGH 5.1 K T LU N T nh ng k t qu nghiên c u trình bày trên, chúng tơi rút m t s k t lu n sau: - Ch t lư ng m u xét nghi m quan tr ng K thu t l y m u, b o qu n m u, lư ng m u ñư c l y y u t quy t ñ nh ñ n ch t lư ng - Trong ba phương pháp trên, hi n ch có phương pháp ELISA có th v a phát hi n virus v a ñ nh type virus LMLM - ð nh y tương ñ i c a phương pháp ELISA 96,55%, phân l p môi trư ng t bào 72,41% so v i phương pháp real-time PCR xét nghi m phát hi n virus LMLM - Th i gian có đư c k t qu c a phương pháp real-time PCR nhanh nh t sau đ n ELISA, cu i phân l p virus mơi trư ng t bào - Chi phí cho m t m u xét nghi m phát hi n virus LMLM b ng phương pháp real-time PCR ñ t nh t - Các quan tr c thu c C c Thú y, hi n ch có Trung tâm Ch n đốn Thú y TƯ Cơ quan Thú y vùng th c hi n ch n đốn phát hi n virus LMLM b ng c ba phương pháp Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………68 5.2 ð NGH T k t lu n trên, chúng tơi có m t s đ ngh sau: - Nên t ch c nhi u khóa t p hu n n a cho cán b thú y v phương pháp l y m u xét nghi m nói chung l y m u dùng xét nghi m ch n đốn virus LMLM nói riêng - Áp d ng phương pháp ELISA cho ch n đốn b nh LMLM t i phịng thí nghi m ch n đốn b nh LMLM t i Vi t Nam - Trong ph m vi c a ñ tài, chúng tơi chưa làm đư c c ba phương pháp v i dung lư ng m u l n, ñ ngh ti n hành phương pháp v i dung lư ng m u l n đ có đư c k t qu đ nh y xác Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………69 TÀI LI U THAM KH O TÀI LI U TI NG VI T Blancou J., Ozawa Yoshiro (1995), B nh l m m long móng ðơng Nam Á- Tình hình k ho ch phòng ch ng (tài li u Thanh Thu n d ch), T p chí KHKT Thú y, 2, 83-89 Công ty Marial - Pirbright (2004), Tiêm ch ng nh c l i vacxin ch t kháng ngun tinh t vơ ho t đ m đ c không t o kháng th kháng protein không c u trúc c a virus l m m long móng (tài li u Hoàng Th Xuân Mai d ch), T p chí KHKT Thú y, 10, 82-88 H ðình Chúc, Ngơ Thanh Long (2003), Phát hi n trâu bị nhi m virus l m m long móng b ng KIT ELISA CHEKIT- FMD- 3ABC, T p chí KHKT Thú y, 10, 14-32 C c Thú y, S tay phòng ch ng b nh l m m long móng (2003), nhà Xu t B n Nơng Nghi p 1-90 C c Thú y (2005), Chương trình Qu c Gia kh ng ch toán b nh l m m long móng giai đo n 2006-2010, T p chí KHKT Thú y 7, 1-51 ðào Tr ng ð t (2000), Góp ph n vào vi c ñ u tranh phòng ch ng b nh l m m long móng, T p chí KHKT Thú y, 7, 6-7 Doel T.R.(2003), “Mi n d ch l m m long móng t nhiên tiêm phịng, nh ng tri n v ng c i ti n vacxin” (tài li u Nguy n Thiên Dũng d ch), T p chí KHKT Thú y, 10, 75-85 Donalsson A.I (2000), “B nh lý h c d ch t h c c a b nh l m m long móng” (tài li u Lê Minh Hà d ch), T p chí KHKT Thú y, 7, 43-47 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………70 Nguy n Ti n Dũng (2000), B nh l m m long móng (bài t ng h p), T p chí KHKT Thú y, 7, 8-16 10 Nguy n Vi t Không (2006), Phát hi n type Asia virut LMLM l n ñ u tiên t i Khánh Hòa b ng k thu t RT - PCR, T p chí KHKT Thú y, 4, 9697 11 R.P Kitching (2008), Kh ng ch b nh LMLM toàn c u ph i m t s l a ch n?, T p chí KHKT Thú y, 15, 78-85 12 R.P Kitching (2000), “Di n bi n g n ñây c a b nh l m m long móng” (Tài li u Tơ Long Thành d ch), T p chí KHKT Thú y, 7, 48-67 13 Văn ðăng Kỳ (1998), K ho ch kh ng ch toán b nh l m m long móng t i ðơng Nam Á, T p chí KHKT Thú y, 5, 78-85 14 Văn ðăng Kỳ (2008), M t s ñ c ñi m b nh LMLM bi n pháp phòng ch ng, t ng h p, T p chí KHKT Thú y, 7, 63-69 15 Ph m S Lăng, Nguy n Thi n (2002), M t s b nh m i virus gia súc, gia c m nh p n i bi n pháp phòng tr , Nhà xu t b n Nông nghi p, 14-18 16 M.F Lombard, C.G Schermbrucker (2000), “Vacxin ch ng b nh l m m long móng toàn c u: s n xu t, l a ch n hi u xu t ngo i th c đ a” (tài li u Tơ Long Thành d ch), T p chí KHKT Thú y, 7, 36-43 17 Hồng Văn Năm (2002), “Tình hình d ch l m m long móng th gi i năm 2001”, T p chí KHKT Thú y, 10, 74-77 18 Lê Văn Phan (2004), Tách dịng gi i trình t ño n gen mã hóa cho serotyp O c a virus gây b nh LMLM thu th p t i t nh Qu ng Tr , Vi t Nam, Các báo cáo khoa h c 2001-2004, Vi n Thú y 35 năm xây d ng phát tri n Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………71 19 Nguy n Vĩnh Phư c (1978), B nh truy n nhi m gia súc, Nhà xu t b n Nông nghi p Hà N i, 185-203 20 Thái Th Thu Phu ng, Lê Thanh Hoà (2006), Phát hi n Topotype khác bi t c a virus LMLM t b lai F1 ð ng Tháp qua giám ñ nh phân t b ng ch th 5’ URT, T p chí KHKT Thú y, 13, 5-18 21 Thái Th Thu Phu ng, Lê Thanh Hoà (2007), ð nh type vius LMLM heo, bò t i Ti n Giang ð ng Tháp qua s d ng ch th phân t gene kháng nguyên 1D-2A-2B (VP1-2A-2B), T p chí KHKT Thú y, 14, 12-20 22 Tơ Long Thành (2000), Cơ s phân lo i virus l m m long móng, T p chí KHKT Thú y, 7, 22-28 23 Tô Long Thành, Bùi Quang Anh (2006), K t qu ch n đốn b nh, giám sát s lưu hành c a virus l a ch n vacxin phòng b nh LMLM c a C c thú y 1985-2006, T p chí KHKT Thú y, 13, 70-74 24 Tô Long Thành, Nguy n Th Nguy t, Lê Văn Phan, Trương Văn Dung (2005), Phân l p virus LMLM t d ch t i t nh Qu ng Tr , T p chí KHKT Thú y, 11, 15-21 25 Tơ Long Thành, T Hồng Long (2008), Thu th p, b o qu n v n chuy n b nh ph m trâu bò, l n nghi m c b nh LMLM t d ch, T p chí KHKT Thú y, 15, 96-98 26 Tơ Long Thành, Truơng Văn Dung, Lê Tr n Phan, ðinh Duy Kháng, Dương H ng Quân (2004), Thi t l p phuơng pháp RT-PCR đ ch n đốn, đ nh type l m m long móng t b nh ph m th c đ a, T p chí KHKT Thú y, 9, 15-21 27 Nguy n Như Thanh, Nguy n Bá Hiên, Tr n Th Lan Huơng (1997), Giáo trình vi sinh v t, Nhà xu t b n Nông nghi p, 154-159 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………72 28 Nguy n Như Thanh (2001), Giáo trình vinh sinh v t thú y, Nhà xu t b n Nông nghi p, 254-259 29 Tr n ðình T (2000), Phương pháp b o qu n s d ng vacxin LMLM, T p chí KHKT Thú y, 7, 103-104 30 Trí Lê Minh, Tr n H u C n (1997), Phân b ñ a lý b nh type virus LMLM th gi i nh ng năm g n ñây chi n l ơc phòng ch ng, T p chí KHKT Thú y, 1, 75-79 TÀI LI U TI NG NƯ C NGOÀI 31 Aftosa F (2000), Foot and Mouth Disease (FMD), World Organization for Animal Health (OIE) Foot and mouth disease, Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines Paris: OIE, 92 32 AIH (2006), Foot and Mouth Disease Vius www.pathport.vbi.vt edu/pathinfo/pathogens/FMDV2 html 33 Alex Dnalson (1999), Airborne spread of foot and mouth disease Microbiology today, 26 34 Alexandersen S (2008), RT-PCR probing-ELISAs for the diagnosis and typing of foot-and-mouth disease using our newly developed SNAP (Simple and Aqueous Phase) hybridization Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Pirbright, Woking, Surrey 173-178 35 Aliasghar Bahari (2007), Application of nested- PCR for detection of foot and mouth disease viral sequences in tonsil of slaughtered with clinicaly normal appearance in Iran, Junior school of veterinary medicine, Bu- Ali Sina University, Hamadan, Iran Vet Arhiv 77, 299-306 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………73 36 Bao H.F (2007), A highly sensitive and specific multiplex RT-PCR to detect foot and mouth disease virus and tissue and foot samples J Vet Diagn Invest 37 Brown C (2001), Update foot and mouth disease in swine Journal of swine heath and production 9, 239-242 38 Callens M (1997), Differentiation of the seven serotypes of foot-andmouth disease virus by reverse transcriptase polymerase chain reaction J Virol Methods, 67, 35-44 39 Callahan JD, Brown F, Osorio FA, Sur JH, Kramer E, Long GW, Lubroth J, Ellis SJ, Shoulars KS, Gaffney KL, Rock DL, Nelson WM Use of portable real-time RT- PCR assay for rapid detection of foot and mouth disease virus J Am Vet Med Assoc 2002 June 1; 220 (11): 1636- 42 40 Cunliffe H.R (1962), Antibody Response in a Group of Swine After Infection with Foot and Mouth Disease Virus Can J Comp Med Vet Sci 26, 182-185 41 Eble.P.L (2007), Serological and mucosal immune responses after vaccination and infection with FMDV in pigs Epub 25, 1043-1054 42 Eble P.L (2006), Comparison of immune responses after intra-typic heterologous and homologous vaccination against foot-and-mouth disease virus infection in pigs Epub, 24, 1274-1281 43 Edwin H., Lennette H (1964), Diagnostic Procedures for viral and ricketsial diseases American Public Health Association 723-726 44 Feng Q (2003), Serotype and Gene VP1 sequence of a foot-and-mouth disease virus from Hong Kong (2002) Biochem Biophys Res Commun, 302, 715-721 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………74 45 Health Inspection Service United States Department of Agriculture (1991) Foot and Mouth Disease Emergency Disease Guideline Foot and Mouth Disease Emergency Disease Guideline 46 Knowles N.J (2003), Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus Virus Res, 91, 65-80 47 Konig G.A (2007), Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus types A and O isolated in Argentina during the 2000-2002 epizootic Vet Microbiol, 124, 1-15 48 Kumar S.S (2008), Partial sequence analysis of VP1 of Indian isolates of foot-and-mouth disease virus type Asia-1 Virus Genes 37, 60-68 49 Mason P.M (2003), Comparisons of the complete genomes of Asian, African and European isolates of e reFcent foot-and-mouth disease virus type O pandemic strain (PanASIA) Journal of General Virology 84, 15831593 50 Mohapatra J.K (2004), Sequence variability in the structural proteinencoding region of foot-and-mouth disease virus serotype Asia1 field isolates Res Vet Sci 77, 153-161 51 Nagendrakumar S.B (2005), Molecular Characterization of Foot and Mouth Disease Virus Type C of Indian Origin Journal of clinical mirobimology 966-969 52 Nick J.Knowles (2008), Global Molecular Epidemiology of Foot and Mouth Disease Virus Type C FAO World Refernce Laboratory for Foot and mouth Disease Insitute for Animal Heath, Pirbright laboratory Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………75 53 Ochoa W.F (2000), A multiply substituted G-H loop from foot-and-mouth disease virus in complex with a neutralizing antibody: a role for water molecules J Gen Virol, 81, 1495-1505 54 OIE (2000), Manual diagnosis test and vaccin for terrestrial animals Chapter 2.1.1 Foot and Mouth disease, 77-92, OIE 55 Paprocka G (2004), Genetic analysis of serotype O of foot and mouth disease Virus Bull Vet Int Pulawy 48, 177-181 56 Reid SM, Hutchings GH, Ferris NP, Zhang Z, Belsham GJ, Alexandersen S Detection of all seven serotypes of foot and mouth disease virus by real time PCR, Flourogenic RT- PCR assay J Virol Methods 2002 Aug; 105 (1): 67- 80 57 Riemann H (2008), The epidemiology of FMD Potential impact of foot and muoth disease in California University California Issuses cente 7-12 58 Rodriguez A (1994), Direct PCR detection of foot-and-mouth disease virus J Virol Methods 47, 345-349 59 Saiz J (1991), Identification of neutralizing antigenic sites on VP1 and VP2 of type A5 foot-and-mouth disease virus, defined by neutralizationresistant variants J Virol 65, 2518-2524 60 Sanz-Parra A (1998), Infection with foot-and-mouth disease virus results in a rapid reduction of MHC class I surface expression J Gen Virol 79, 433-436 61 Sobrino F., Esteban Domingo (2001), Foot and mouth disease in Europe Eurropean Molecular Biology Organization TÀI LI U T INTERNET 62 http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=390&idmid=3&ItemID=7425 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………76 63 http://www.virology.wisc.edu/virusworld/images/fmdv-1qgc.jpg) 64 http://www.biochemsoctrans.org/bst/035/0594/bst0350594f01.htm 65.http://www.fao.org/corp/google_result/en/?cx=018170620143701104933 %3Aqq82jsfba7w&q=FMD+stituation+map+2008&cof=FORID%3A9&x=1 2&y=7#1247 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………77 PH L C Công th c pha dung d ch b o qu n Na2HPO4.2H2O 3,05 g KH2PO4 0,39 g Nư c c t 500 ml Phenol red 1% ml Penicilline 1000 UI/ml Mycostatine 100 UI/ml Neomycine 100 UI/ml Polymicine - PBS 0,04 M: 50 UI/ml - Kháng sinh: Sau pha ki m tra pH 7,2-7,6, ch nh pH v i NaOH ho c HCl 1N Chú ý: Khi dùng pha dung d ch b o qu n v i Glycerine t l 1:1 Công th c pha dung d ch coating buffer Carbonate/bicarbonate buffer 0,05 M, pH 9,6: NaHCO3 2,93 g/l Na2CO3 1,59 g/l Công th c pha PBS 0,04 M pH 7,4 Na2HPO4 4,84 g/l KH2PO4 0,80 g/l NaCl 32,00 g/l KCl 0,80 g/l Công th c pha buffer A PBS 0,01 M + 0,05 % Tween 20 Na2HPO4 1,21 g/l KH2PO4 0,20 g/l NaCl 8,00 g/l KCl 0,20 g/l Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………78 Công th c pha buffer B PBS 0,01 M + 0,05 % Tween 20 + 5% s a b t tách bơ Na2HPO4 1,21 g/l KH2PO4 0,20 g/l NaCl 8,00 g/l KCl 0,20 g/l Pha Primer - Primer ñông khô ph i ñư c ly tâm ng n ñ ch c ch n r ng h t RNA ñư c l ng xu ng ñáy ng trư c m hồn ngun L n đ u tiên nên dùng đ m TE đ hồn ngun primer n ng đ 200 ρmol/µl làm g c - Primer s d ng n ng đ 20 ρmol/µl: pha lỗng primer g c b ng nư c khơng có nuclease Primer g c 10 µl Water free RNA 90 µl T ng lư ng 100 µl Pha B-Mercaptoethanol (B-ME) b sung vào dung d ch RNeasy RLT trư c dùng v i yêu c u 10 µl B-ME/ml dung d ch RLT Dung d ch RLT v n n ñ nh vòng tháng sau b sung B-ME Dung d ch RLT 50 ml B-ME 500 µl Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………79 i ... ng phương pháp Real-time PCR 54 4.3.3 Th i gian ch n đốn b ng phương pháp phân l p môi trư ng t bào BHK21 .55 4.3.4 So sánh th i gian ch n đốn c a phương pháp .57 4.4 SO SÁNH... Ch n đốn phát hi n virus LMLM b ng phương pháp ELISA - Ch n đốn phát hi n virus LMLM b ng phương pháp Real-time PCR - Ch n đốn phát hi n virus LMLM b ng phương pháp phân l p virus t bào BHK21... phương pháp phịng thí nghi m ch n đốn virus L M m Long Móng t i Vi t Nam? ?? 1.2 M C TIÊU C A ð TÀI ðánh giá, so sánh ñ nh y tương ñ i, th i gian xét nghi m, chi phí gi a phương pháp d a k t qu ñ