Ở Việt Nam, bệnh ủược ghi nhận ủầu tiờn tại Nha Trang (1989) [6]. Trước ủõy, bệnh thường thấy ở cỏc tỉnh miền Trung và miền Nam, giỏp với biờn giới Camphuchia và Lào. Ở miền Bắc, bệnh ủược ghi nhận trong thời gian dài từ những năm 1921-1963. Bệnh khụng xảy ra ở khu vực cỏc tỉnh phớa Bắc từ 1963-1992. Năm 1993, dịch bệnh xuất hiện ở cỏc tỉnh Quảng Ninh, Hà Tĩnh, Quảng Bỡnh, Thừa Thiờn Huế. Năm 1995, bệnh xảy ra ở 107 huyện thuộc 26 tỉnh làm nhiều trõu, bũ, lợn bị chết. Diễn biến bệnh LMLM ngày càng trở nờn phức tạp, hàng năm bệnh xảy ra ở diện rộng với số lượng lớn gia sỳc bệnh [4].
Theo số liệu của Cục Thỳ y [5], năm 1999, trong khi vẫn chưa chấm dứt cỏc ủợt dịch từ cỏc tỉnh miền Trung và miền Nam thỡ ở miền Bắc, ủợt dịch mới từ Trung Quốc tràn sang tấn cụng hàng loạt cỏc tỉnh giỏp biờn. Cao Bằng là ủiểm dịch ủầu tiờn, từ ủú dịch lan sang cỏc tỉnh khỏc. ðến 10/3/2000 ủó cú 58 tỉnh bị dịch, 297.808 trõu, bũ và 36.530 lợn mắc bệnh.
Năm 2001, bệnh xảy ra ở 16 tỉnh thành với 3.976 trõu, bũ mắc bệnh. Năm 2002, bệnh xảy ra ở 26 tỉnh thành với 10.287 trõu, bũ mắc bệnh. Năm 2003, 38 tỉnh thành cú dịch, trong ủú 28 tỉnh thành cú dịch ở trõu, bũ và 28 tỉnh cú dịch ở lợn, với tổng số 20.303 trõu, bũ; 1.178 dờ và 3.533 lợn mắc bệnh, chủ yếu ở cỏc tỉnh: Quảng Trị, Phỳ Yờn, Khỏnh Hoà, Gia Lai, Hà Giang.
Theo Tụ Long Thành và cộng sự, tỡnh hỡnh dịch bệnh LMLM trong mấy năm gần ủõy diễn biến hết sức phức tạp và cú chiều hướng gia tăng.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………25
Năm 2004, số tỉnh cú dịch LMLM là 24 tỉnh, trong ủú cú 9 tỉnh do virus LMLM serotype A (phỏt hiện lần ủầu tiờn tại Ninh Thuận và Bỡnh ðịnh vào 8/2004), 12 tỉnh do virus LMLM serotype O và 3 tỉnh do cả 2 virus LMLM serotype O và A. Nguyờn nhõn của việc xuất hiện virus LMLM type A cú thể
là do việc nhập lậu bũ từ Camphuchia.
Năm 2005, số tỉnh cú dịch LMLM là 37 tỉnh với 28.241 trõu, bũ, 3.976 lợn mắc bệnh, trong ủú cú 3 tỉnh do virus LMLM serotype A, 13 tỉnh do virus LMLM serotype O, 3 tỉnh do cả 2 virus LMLM serotype O và A, 2 tỉnh do virus LMLM serotype Asia 1 (Lào Cai và Khỏnh Hoà vào thỏng 10/2005).
Năm 2006, số tỉnh cú dịch LMLM là 27, trong ủú 26 tỉnh là type O và Hà Giang là type Asia 1 (phỏt hiện thỏng 5/2006 bằng kớt 3ABC và giỏm ủịnh bằng phương phỏp RT-PCR) với tổng số 9.271 trõu bũ và 12.461 lợn bị bệnh.
Năm 2007 cú 37 tỉnh cú dịch, chủ yếu xảy ra ở trõu bũ, với tổng số
11.355 trõu bũ ốm và phải xử lý, chết là 3.765 con trong 225 huyện, 294 xó cú dịch LMLM. Cú 172 xó thuộc 71 huyện cú dịch LMLM trờn lợn với tổng số
con ốm là 12.386 con và phải xử lý là 11.122 con. Cỏc type virus lưu hành là type O, A và Asia1.
Tỡnh hỡnh dịch bệnh LMLM trong năm 2008 cú giảm so với cỏc năm trước, 43 huyện cú dịch trờn trõu bũ, 2.408 trõu bũ mắc bệnh, số trõu bũ chết, tiờu hủy là 218 con. Type O vẫn là type virus xuất hiện nhiều nhất trong cỏc ổ
dịch bờn cạnh type A và Asia1.
ðến ngày 15 thỏng 9 năm 2009 ủó cú 21 tỉnh cú dịch LMLM trờn trõu, bũ và lợn, số mắc ở trõu là 1.439 con, bũ là 1.768 con và lợn là 238 con. Những tỉnh cú số trõu bũ lợn mắc và tiờu hủy nhiều là Kon Tum, Quảng Bỡnh, Quảng Ngói, Sơn La…
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………26
2.7.2. Những nghiờn cứu về bệnh LMLM ở Việt Nam
Năm 2003, Hồ ðỡnh Chỳc và Ngụ Thanh Long ủó sử dụng kit ELISA CHECKIT - FMD- 3ABC ủể phỏt hiện trõu bũ nhiễm virus LMLM [3].
Năm 2004, Tụ Long Thành và cộng sự ủó phõn lập thành cụng virus LMLM trờn tế bào BHK21. Sử dụng kỹ thuật RT- PCR với cặp mồi chung 1F/1R ủặc hiệu cho 7 type của virus LMLM gõy bệnh LMLM và cặp mồi P33/P38 ủặc hiệu cho type O ủó ủược xỏc ủịnh virus LMLM phõn lập ủược là virus LMLM type O [27].
Năm 2005, Lờ Văn Phan và cộng sự ủó tỏch dũng và giải mó thành cụng
ủoạn mó hoỏ cho serotype O của virus LMLM gõy bệnh LMLM thu thập tại Quảng Trị [18].
Thỏng 10/2005, Nguyễn Viết Khụng và cộng sự ủó phỏt hiện type Asia1 của virus LMLM tại Khỏnh Hũa. Như vậy, ở Nha Trang ủược ghi nhận cú 3 type virus LMLM là O, A và Asia1 [10].
Năm 2006, Thỏi Thuỷ Phượng và Lờ Thanh Hoà ủó tỏch dũng, giải trỡnh tự và phõn tớch chuỗi gene từ cỏc mẫu bệnh phẩm từ bũ lai và lợn ðồng Thỏp
ủó phỏt hiện ra topotype khỏc biệt của virus LMLM [20].
Năm 2007, Thỏi Thủy Phượng, Lờ Thanh Hoà ủó ủịnh type virus LMLM trờn heo, bũ tại Tiền Giang và ðồng Thỏp qua sử dụng chỉ thị phõn tử gene khỏng nguyờn 1D- 2A- 2B (VP1-2A-2B) [21].
Như vậy ở nước ta hiện nay cú 3 serotype virus LMLM gõy bệnh LMLM O, A, Asia1. Virus LMLM serotype O cú 3 topotype: Topotype SAE (South- EAST), topotype Cathay, topotype ME-SA (Trong ủú topotype Cathay và topotype ME-SA là phổ biến nhất trong cỏc ổ dịch).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………27
PHẦN III
ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, ðỊA ðIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.1. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ ðỊA ðIỂM NGHIấN CỨU 3.1.1. ðối tượng nghiờn cứu
Gia sỳc nghi mắc bệnh LMLM, mẫu bệnh phẩm nghi cú virus LMLM.
3.1.2. Nội dung nghiờn cứu
- Nhận xột, ủỏnh giỏ chất lượng mẫu bệnh phẩm ủược gửi ủến Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ và mẫu bệnh phẩm do cỏn bộ Trung tõm ủi lấy.
- Chẩn ủoỏn phỏt hiện virus LMLM bằng phương phỏp ELISA.
- Chẩn ủoỏn phỏt hiện virus LMLM bằng phương phỏp Real-time PCR. - Chẩn ủoỏn phỏt hiện virus LMLM bằng phương phỏp phõn lập virus trờn tế
bào BHK21.
- Thu thập kết quả, ủỏnh giỏ, so sỏnh ủộ nhạy tương ủối, thời gian chẩn ủoỏn, chi phớ giữa cỏc phương phỏp dựa trờn kết quả ủạt ủược. Kiến nghị phương phỏp chẩn ủoỏn phỏt hiện virus tối ưu.
- Khảo sỏt năng lực thực hiện ba phương phỏp chẩn ủoỏn trờn tại một số ủơn vị.
3.1.3. ðịa ủiểm nghiờn cứu
- Một số tỉnh cú dịch.
- Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………28
3.2. VẬT LIỆU NGHIấN CỨU 3.2.1. Mỏy múc
- Tủ lạnh õm - Tủ lạnh thường - Tủấm 37oC
- Mỏy lắc ủĩa (orbital shaker) - Mỏy lắc trộn (vortex mixer) - Nồi ủun cỏch thuỷ (water bath) - Mỏy ủọc ELISA với kớnh lọc 492 nm - Mỏy rửa ủĩa ELISA.
- Buồng cấy vụ trựng (BSC-Biosafety cabinet) - Mỏy ly tõm, mỏy ly tõm lạnh
- Mỏy real-time PCR Smart Cycler
3.2.2. Dụng cụ
- Bỡnh tam giỏc cỏc cỡ: 100, 200, 500 và 1000 ml
- Ống ủong thuỷ tinh cỏc cỡ: 50, 100, 200, 500 và 1000 ml - Cốc cú mỏ cỏc cỡ: 100, 200, 500 và 1000 ml
- Ống nghiệm
- Lọ nhỏ chắt huyết thanh
- Mỏng trộn chất phản ứng (reagent trough) - Pipette thuỷ tinh: 1, 5 và 10 ml
- Micropipette ủơn: 0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 àl - Micropipette ủa kờnh (8-12): 5-50, 50-300 àl
- Bộ cối, chày sứ
- Cỏt sạch ủể nghiền bệnh phẩm - Khăn bụng
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………29
3.2.3. Hoỏ chất
- Nước cất hoặc nước khử ion - Water free RNA
- Dung dịch ủệm Phosphate/citrate
- Chất phỏt màu OPD (ortho-phenylenediamine) - Cơ chất (H2O2) - Viờn Carbonate/bicarbonate - ðỏ phenol 1% - Tween 20 - Axit citric - HCl - H2SO4 1,25M - Na2HPO4.2H2O - KH2PO4 - KCl - NaCl. - Ethanol 100% - Dung dịch TE - Dung dịch TAE 50X. - B-Mercaptoethanol 3.2.4. Nguyờn liệu
3.2.4.1. Bộ kit ELISA phỏt hiện khỏng nguyờn LMLM (Pirbright- Anh Quốc) 3.2.4.2. Bộ kit Qiagen và primer phỏt hiện khỏng nguyờn LMLM (Qiagen- Hàn Quốc)
3.2.4.3. Nguyờn liệu cho phõn lập tế bào
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………30
- Mụi trường cơ bản RPMI 1640, MEM (Minimum Essential Medium), MEM non essential amino acid solution 100x, MEM amino acid solution 50x, Foetal Bovine (Cafl) Serum, Dimethylsulfoxide (DMSO), L - Glutamine, Sodium pyruvate, Penicilline - Streptomycine, Amphotericin, Trypsin, Trypan blue, Hepes free acid, NaHCO3, PBS Ca2+, Mg2+ free, HCl 1N, NaOH 1N…
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.3.1. Phương phỏp lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm phỏt hiện virus LMLM Mẫu bệnh phẩm ủể phỏt hiện bệnh và ủịnh type virus là cỏc mẫu biểu mụ, nơi cú bệnh tớch ở lợi, lưỡi, mộp, chõn, vỳ … ; dịch mụn nước lấy từ cỏc mụn nước chưa vỡở cỏc tổ chức trờn. Cỏch lấy: - Dựng panh, kộo cắt vựng cú bệnh tớch mới vỡ, lấy phần biểu mụ. Lượng biểu mụ lấy ớt nhất là 2 g cho vào lọ cú dung dịch bảo quản.
- Nếu mụn nước chưa vỡ cú thể dựng bơm tiờm 5 ml hỳt dịch bờn trong cho vào lọ ủựng bệnh phẩm sạch (khụng cú dung dịch bảo quản), lấy ớt nhất 2ml dịch mụn nước.
Bảo quản:
- Mẫu tổ chức biểu mụ sau khi lấy ủựng trong lọ thuỷ tinh dày, cú nỳt vặn kớn với dung dịch bảo quản ớt nhất là 20 ml. Phớa ngoài lọ ủựng bệnh phẩm phải ghi nhón về chủ gia sỳc, loại gia sỳc, loại bệnh phẩm, nơi lấy mẫu...
- Bờn ngoài lọủựng bệnh phẩm phải khử trựng.
- Lọ mẫu bệnh phẩm sau khi lấy nếu chưa kịp gửi ủến phũng xột nghiệm cần bảo quản ngay trong ngăn ủỏ tủ lạnh hoặc tủ lạnh õm.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………31
Vận chuyển:
Khi gửi mẫu cần quấn bụng thấm nước quanh lọ ủể chống vỡ và cho vào 2 lượt tỳi nilon bờn trong cú phiếu gửi bệnh phẩm, buộc kớn. Mẫu bệnh phẩm ủược ủể vào hộp giữ lạnh cú ủủủỏ trong quỏ trỡnh vận chuyển, ủậy nắp, gắn nhón bờn ngoài, ghi rừ tờn và ủịa chỉ nơi gửi và gửi nhanh ủến phũng chẩn ủoỏn xột nghiệm.
Ghi phiếu gửi bệnh phẩm (cần cú những thụng tin sau):
- Tờn và ủịa chỉ nơi gửi - Tờn và ủịa chỉ chủ gia sỳc
- Số lượng, loài, và giống gia sỳc mắc bệnh trờn tổng số
- Bệnh phẩm: loại bệnh phẩm, ngày lấy mẫu, ngày gửi mẫu - Tuổi của ủàn mắc bệnh
- Ngày mắc bệnh, mức ủộ lõy lan
- Lịch sử bệnh: ủó từng mắc bệnh hay ủó tiờm phũng, loại vacxin…
3.3.2. Phương phỏp nuụi cấy virus LMLM trờn mụi trường tế bào BHK21 BHK21
3.3.2.1. Hồi phục tế bào BHK21 từ nguồn giống bảo quản ở tủ õm sõu
- Giống tế bào BHK21 ủược giữ tại Bộ mụn Virus, Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ.
- Cỏc bước tiến hành hồi phục tế bào BHK21:
+ Bước 1: Giải ủụng: Lấy 1 ống tế bào ra khỏi tủ õm sõu (-800C), cho vào cốc nước sạch và ủểở nhiệt ủộ phũng, quan sỏt ủến khi ống tế bào chuyển màu và tan ủụng.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………32
+ Bước 2: Cõn bằng mụi trường: Thờm 1ml mụi trường ủầy ủủ (10% FCS) (ủó làm ấm ở 37oC trước khi giải ủụng tế bào) vào ống tế bào. Nhẹ nhàng dựng pipette chuyển huyễn dịch tế bào sang ống ly tõm 15ml.
+ Bước 3: Ly tõm loại bỏ dung dịch bảo quản: Ly tõm 700 vũng/phỳt trong 5 phỳt, dựng pipette loại bỏ phần dung dịch ở trờn (giữ lại cặn tế bào màu trắng).
+ Bước 4: Hoà tan trong mụi trường nuụi cấy tế bào: Thờm vào ống 1-2 ml mụi trường ủầy ủủ (10% FCS), sau ủú nhẹ nhàng dựng pipette hoà tan tế bào. + Bước 5: Cấy tế bào vào chai nuụi (T25): Chuyển huyễn dịch trờn sang chai nuụi cấy tế bào T25 ( ủỏy 25 cm2) ủó cú sẵn 4-5 ml mụi trường ủầy ủủ (10% FCS). Ghi tờn tế bào, ngày, giờ nuụi.
+ Bước 6: Theo dừi tế bào phỏt triển: Giữ ở 37oC, 5% CO2. Quan sỏt tế bào phỏt triển trờn kớnh hiển vi ủến khi ủạt mật ủộ cần thiết.
3.3.2.2. Nuụi trờn ủĩa nhựa 6 giếng và 24 giếng
+ Loại bỏ mụi trường cũ. Trỏng chai bằng dung dịch PBS (-) hoặc bằng Trypsin: 0,1- 0,2 ml/cm2.
+ Cho 0,1 ml/cm2 trypsin vào chai, ủể từ 3-5 phỳt hoặc trong tủấm 37oC (nếu nhiệt ủộ thấp).
+ Sau khi tế bào bong ra bổ sung ngay từ 5-7 ml mụi trường cú chứa huyết thanh, vỗ vào thành chai.
+ Dựng pipette làm tan cỏc tế bào, sau ủú hỳt hết tế bào vào ống ly tõm 15ml và ly tõm ở 700 vũng/phỳt trong 5 phỳt.
+ Ly tõm xong, bỏ dịch nổi phớa trờn, lấy cặn tế bào.
+ Hoà tan cặn tế bào trong 2-3 ml mụi trường ủầy ủủ, pipette ủể tỏch rời tế
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………33
+ Bổ sung mụi trường ủầy ủủ tới lượng cần thiết. Dựng pipette 10ml hỳt mụi trường cú chứa tế bào ở trờn và cho vào cỏc giếng của ủĩa nuụi cấy ủược xếp theo bố trớ thớ nghiệm: 3ml/giếng (ủối với ủĩa 6 giếng), 1ml/giếng (ủối với ủĩa 24 giếng).
+ Ghi tờn tế bào nuụi, ngày, giờ, nồng ủộ pha loóng… trờn cỏc ủĩa.
+ Theo dừi tế bào phỏt triển: Giữở 37oC, 5% CO2. Quan sỏt sự phỏt triển của tế bào trờn kớnh hiển vi ủến khi ủạt mật ủộ cần thiết.
3.3.2.3. Phõn lập virus LMLM trờn tế bào BHK21
Xử lý bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm là biểu mụ của mụn nước ủược nghiền trong cối chày sứ với dung dịch PBS 0,04M tỷ lệ 1:10. Ly tõm huyễn dịch bệnh phẩm 2.000 vũng/10 phỳt. Lấy dịch nước trong ở trờn, xử lý khỏng sinh.
Phõn lập trờn mụi trường tế bào BHK21
Chuyển 1ml huyễn dịch bệnh phẩm ủó ủược xử lý ở trờn vào chai tế
bào (T25) hoặc ủĩa 6 giếng, 0,5ml/ giếng với ủĩa 24 giếng.
- Ủ ở nhiệt ủộ 37oC/60 phỳt, sau cho dung dịch MEM (Eagle’s) khụng cú huyết thanh nuụi tiếp.
- Theo dừi hàng ngày kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE: Cytopathic Effect): theo dừi ủến 96 giờ.
Nếu xuất hiện CPE: dương tớnh
Nếu sau 96 giờ khụng cú CPE xuất hiện: õm tớnh (khụng cú virus LMLM).
3.3.3. Phương phỏp ELISA xỏc ủịnh type virus LMLM
3.3.3.1. Nguyờn lý
Khỏng nguyờn tương ứng sẽủược gắn với khỏng thểủặc hiệu cho từng type virus ủó ủược hấp phụ lờn bề mặt cỏc giếng của ủĩa phản ứng, khỏng thể
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………34
sẽủược gắn vào cỏc lỗ của ủĩa, mẫu khỏng nguyờn khụng tương ứng sẽ bị rửa