Trong xột nghiệm và chẩn ủoỏn, mẫu và mẫu bệnh phẩm là yếu tố ủầu tiờn quyết ủịnh ủến tớnh chớnh xỏc của kết quả. Nếu mẫu bệnh phẩm khụng
ủạt yờu cầu xột nghiệm thỡ sẽ khụng thực hiện ủược xột nghiệm ủú. Mẫu bệnh phẩm khi ủến ủược phũng xột nghiệm thỡ phải qua ba cụng ủoạn: Lấy mẫu, bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu. Thực chất của quỏ trỡnh này là lấy mẫu, bảo quản tạm thời, vận chuyển ủến phũng xột nghiệm và bảo quản. Bảo quản cuối cựng là bảo quản ủể lưu mẫu. Ta cú thể bảo quản ở tủ lạnh õm -200C hoặc -800C. Mẫu bảo quản này cú thể dựng vào nhiều mục ủớch khỏc nhau.
Lấy mẫu bệnh phẩm: mẫu bệnh phẩm nờn ủược lấy từ những con vật
ủang trong giai ủoạn nung bệnh hoặc ủang phỏt bệnh, biểu hiện cỏc triệu chứng lõm sàng rừ ràng như sốt cao, hỡnh thành mụn loột ở miệng, lợi, nhai nhúp nhộp, chảy nước dói, sưng cỏc kẽ múng chõn, ăn uống, ủi ủứng khú khăn. Khi cỏc mụn nước vỡ ra cú dịch màu vàng nhạt, mụn nước vỡ ủú tạo thành cỏc vết loột. Cỏc loại mẫu bệnh phẩm thường ủược lấy là biểu mụ từ
mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ, dịch từ mụn nước chưa vỡ, mỏu, huyết thanh, sữa, dịch hầu họng. Khi lấy mẫu bệnh phẩm dựng trong chẩn ủoỏn núi chung và chẩn ủoỏn virus LMLM núi riờng, người lấy mẫu cần lưu ý tuyệt ủối khụng dựng cỏc loại dung dịch sỏt trựng vị trớ lấy mẫu hoặc mẫu bệnh phẩm, nếu cần thiết chỉ nờn dựng nước sinh lý ủể rửa. Sau khi lấy mẫu bệnh phẩm, cần phải bảo quản mẫu ủỳng phương phỏp. Tựy từng loại bệnh phẩm mà cần hay khụng cần dung dịch bảo quản, khối lượng, thể tớch mẫu bệnh phẩm là bao nhiờu. ðối với bệnh phẩm là dịch từ cỏc mụn nước, mỏu, sữa thỡ khụng
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………41
cần dung dịch bảo quản, dựng bơm tiờm vụ trựng hỳt ớt nhất 2 ml dịch mụn nước, sữa rồi cho vào lọ ủựng mẫu vụ trựng. ðối với bệnh phẩm là biểu mụ, lấy ớt nhất 2 g cho vào lọ cú chứa 10 ml dung dịch bảo quản. Cú thể cạo cỏc tổn thương ở kẽ múng rồi bỏ vào lọ ủựng mẫu cú dung dịch bảo quản như
trờn. Nếu là dịch hầu họng thỡ lấy ớt nhất 2 ml dịch rồi cho vào lọ thủy tinh 5ml cú nỳt vặn chứa 2 ml dung dịch bảo quản. Nếu như chỉ cũn thõn thịt thỡ lấy hạch lõm ba trước vai, tuyến thượng thận, thận và tuyến giỏp trạng rồi cũng cho vào dung dịch bảo quản mẫu. Sau khi cho mẫu vào trong lọ ủựng mẫu, vặn chặt nắp nhụm. Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải ủược ủể ngay vào hộp giữ lạnh cú ủủ ủỏ trong quỏ trỡnh vận chuyển. Trờn mỗi lọ ủựng mẫu bệnh phẩm phải ủược dỏn nhón bờn ngoài, ghi:
- Tờn và ủịa chỉ chủ gia sỳc. - Loài, giống gia sỳc mắc bệnh.
- Bệnh phẩm: loại bệnh phẩm, ngày lấy mẫu, ngày gửi mẫu.
Sau ủú cho vào thựng ủựng mẫu chuyờn dụng cú ủỏ hoặc bảo ụn bờn trong, gửi nhanh ủến phũng chẩn ủoỏn xột nghiệm.
Bảng 4.1: Chất lượng mẫu bệnh phẩm LMLM trong 3 năm (2007-4.2009) Mẫu bệnh phẩm nhận
(mẫu)
Mẫu bệnh phẩm ủi lấy (mẫu) Năm ðạt Khụng ủạt ðạt Khụng ủạt Tổng số (mẫu) 2007 69 15 47 0 131 2008 55 6 32 0 93 4.2009 14 0 9 0 23 Tổng 138 21 (15%) 88 0 247
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………42 ðể ủỏnh giỏ chất lượng mẫu bệnh phẩm dựng trong chẩn ủoỏn bệnh LMLM, chỳng tụi ủó thống kờ tỡnh trạng mẫu bệnh phẩm ủược gửi ủến và mẫu bệnh phẩm ủi lấy của Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ qua 3 năm, kết quả ủược trỡnh bày ở bảng 4.1. Cỏc mẫu bệnh phẩm khụng ủạt yờu cầu xột nghiệm thường là: khụng ủủ về trọng lượng hoặc thể tớch cho xột nghiệm, bảo quản khụng ủỳng kỹ thuật làm chất lượng mẫu kộm.
Qua bảng 4.1 chỳng tụi nhận thấy 100% mẫu bệnh phẩm do cỏn bộ
Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ ủi lấy ủạt yờu cầu xột nghiệm. Trong khi ủú mẫu bệnh phẩm do cỏc nơi khỏc gửi ủến Trung tõm cú tới 15% khụng ủạt yờu cầu xột nghiệm chẩn ủoỏn bệnh LMLM. Năm 2007, tổng số 84 mẫu ủược gửi
ủến xột nghiệm virus LMLM thỡ cú tới 15 mẫu khụng ủạt yờu cầu. Bốn thỏng
ủầu năm 2009, 23 mẫu xột nghiệm LMLM ủều ủạt yờu cầu xột nghiệm. Nguyờn nhõn mẫu bệnh phẩm khụng ủạt yờu cầu xột nghiệm cú thể do kỹ
thuật của một số cỏn bộ thỳ y cơ sở, trại chăn nuụi chưa ủược tốt, chưa nắm
ủược tầm quan trọng của mẫu bệnh phẩm trong xột nghiệm, thiếu cỏc trang thiết bị cần thiết trong quỏ trỡnh lấy mẫu, bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu. Thống kờ của chỳng tụi cho thấy, phần lớn cỏc mẫu bệnh phẩm khụng ủạt yờu cầu xột nghiệm là do cỏch lấy, bảo quản và vận chuyển. Cú mẫu bệnh phẩm
ủược gửi ủến mà vẫn cũn màu xanh của dung dịch thuốc sỏt trựng xanh metylen dớnh ở biểu mụ, cú khi cũn phai màu ra cả dung dịch bảo quản mẫu trong lọ ủựng bệnh phẩm. ðiều này làm chết hoặc giảm hàm lượng virus trong mẫu bệnh phẩm rất nhiều. Cú mẫu lại ủược gửi ủến trong tớnh trạng mẫu khụng cũn lạnh nữa, cú trường hợp bệnh phẩm cũn thối rữa, bốc mựi. Bờn cạnh ủú cú mẫu bệnh phẩm lại lấy khụng ủỳng thời ủiểm gia sỳc ủang sốt, cỏc triệu chứng ủiển hỡnh xuất hiện mà gia sỳc ủang ở trong tỡnh trạng hồi phục do chủ gia sỳc ủó dựng thuốc can thiệp ủiều trị triệu chứng, nhiễm trựng kế phỏt. Ở giai ủoạn này, hàm lượng virus trong mẫu bệnh phẩm ớt. Cũng cú
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………43
mẫu khụng ủạt mức ủộ vụ trựng cần thiết nờn chỉ cú thể làm ủược phương phỏp real-time PCR và ELISA chứ khụng làm ủược phương phỏp phõn lập trờn mụi trường tế bào. Cú khi mẫu bệnh phẩm lại quỏ ớt, chỉ ủủ phục vụ cho một phương phỏp, thậm chớ cũn khụng ủủ làm cho bất kỳ phương phỏp nào. Cỏc nguyờn nhõn trờn ủều làm ảnh hưởng ủến chất lượng mẫu bệnh phẩm.
Thống kờ trờn cũng giống với kết quả nghiờn cứu của hai tỏc giả Tụ Long Thành và Tạ Hoàng Long năm 2008 [25]. Cỏc tỏc giảủưa ra rất chi tiết cỏch thu thập, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm trõu, bũ, lợn nghi mắc bệnh LMLM từ cỏc ổ dịch. Theo ủú, mẫu bệnh phẩm phải ủược lấy từ cỏc con vật cú triệu chứng ủiển hỡnh của bệnh LMLM và ủang trong giai ủoạn nung bệnh và phỏt bệnh. Số lượng và thể tớch mẫu bệnh phẩm phải ủủ cho cỏc xột nghiệm cần thiết và ủể lưu trữ dựng cho cỏc thớ nghiệm khỏc nếu cần. Cỏc tỏc giả cũng ghi nhận cỏc mẫu bệnh phẩm do Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ và Trung tõm Thỳ y Vựng TP Hồ Chớ Minh (nay là Cơ quan Thỳ y Vựng VI) cú chất lượng tốt, ủược bảo quản trong quỏ trỡnh vận chuyển ủỳng yờu cầu kỹ
thuật, ủảm bảo yờu cầu chẩn ủoỏn, phõn lập. Cỏc mẫu do Chi cục Thỳ y gửi tới thường chỉủạt yờu cầu cho phương phỏp PCR. Cỏc tỏc giả giải thớch, cú lẽ
là do mẫu lấy khụng ủỳng thời ủiểm, khụng ủạt mức ủộ vụ trựng cần thiết. Một số mẫu gửi ủến, hộp xốp bảo quản mẫu bờn trong chỉ cũn mỏt, ủiều ủú hiển nhiờn ảnh hưởng ủến chất lượng của bệnh phẩm.
4.2. KẾT QUẢ CHẨN ðOÁN PHÁT HIỆN VIRUS LMLM 4.2.1. Kết quả chẩn ủoỏn bằng phương phỏp ELISA
ELISA là kỹ thuật lần ủầu tiờn ủược sử dụng vào năm 1972, hiện nay
ủược sử dụng khỏ phổ biến tại cỏc phũng thớ nghiệm chẩn ủoỏn trờn toàn thế
giới. Với những bệnh phẩm nghi mắc bệnh LMLM, ngoài việc kết luận là dương tớnh hay õm tớnh tức là gia sỳc mắc hay khụng mắc bệnh, phương phỏp
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………44
này cũn cho biết ủược bệnh sỳc ủú ủang mang virus LMLM type gỡ. Dựa trờn sựủặc hiệu của khỏng nguyờn mỗi type virus với khỏng thể tương ứng của nú. Cỏc type virus này khụng miễn dịch chộo cho nhau nờn với mỗi loại khỏng thể sẽ phỏt hiện ủược một loại khỏng nguyờn tương ứng nhờ sự phỏt màu của chromogen. Từ kết quả này, cú thể biết ủược một vựng bất kỳ nào ủú ủang lưu hành virus LMLM thỡ mang những type virus nào? Cú xuất hiện thờm type virus mới tại vựng ủú khụng? ðiều này khụng những cú ý nghĩa trong chẩn ủoỏn mà cũn cú ý nghĩa rất quan trọng trong thống kờ dịch tễ học cũng như việc quyết ủịnh sử dụng vacxin loại nào (vacxin ủơn giỏ hay ủa giỏ, chứa những type virus nào) cho vựng ủú. Từ ủú tiến ủến khống chế và thanh toỏn dịch bệnh này.
Qua bảng 4.2 chỳng tụi thấy, trong 3 năm, tỷ lệ gia sỳc nhiễm virus LMLM type O là cao nhất 120 mẫu trong 144 mẫu cho kết quả dương tớnh với virus LMLM bằng phương phỏp ELISA, chiếm tỷ lệ 83,33%. Virus LMLM type O ủều xuất hiện liờn tục trong 3 năm 2007, 2008 và ủầu năm 2009. ðiều ủú chứng tỏ rằng, type O là type xuất hiện thường xuyờn trong cỏc gia sỳc nhiễm virus LMLM. Trong khi ủú virus LMLM type Asia 1 lại ớt thấy xuất hiện hơn, chỉ cú 17 trong 144 mẫu xột nghiệm cho kết quả dương tớnh. Chỳng tụi cũng ghi nhận ủược sự lưu hành virus LMLM type A ở Việt Nam. Số mẫu dương tớnh là 7 trong tổng số 60 mẫu xột nghiệm cho kết quả dương tớnh trong năm 2008. Trong khi ủú số lượng mẫu cho kết quả dương tớnh với type O là 45 trong 60 mẫu. Bốn thỏng ủầu năm 2009, chỳng tụi cũng chưa ghi nhận ủược trường hợp dương tớnh nào với 2 type Asia 1 và type A trong cỏc mẫu xột nghiệm tại Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ. Kết quả trờn cũng phự hợp với kết quả ủiều tra dịch tễ học bệnh LMLM của Cục Thỳ y. Type O là type phõn bố rộng rói nhất trong hầu hết cỏc ổ dịch LMLM ở nước ta [14].
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………45
Bảng 4.2: Kết quả chẩn ủoỏn bằng phương phỏp ELISA Kết quả (mẫu)
Type O Type Asia1 Type A
Năm (+) (-) (+) (-) (+) (-) Tổng số (mẫu) 2007 60 33 9 14 0 0 116 2008 45 16 8 5 7 6 87 4.2009 15 8 0 0 0 0 23 Tổng số (mẫu) 120 57 17 19 7 6 226 Hỡnh 4.1: Kết quả phản ứng ELISA
- Dương tớnh: cú virus LMLM, cơ chất ủược gắn, tạo mầu vàng - Âm tớnh: khụng cú virus, cơ chất bị rửa trụi, khụng tạo mầu
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………46
4.2.2. Kết quả chẩn ủoỏn bằng phương phỏp Real-time PCR
Real-time PCR là phương phỏp xột nghiệm hiện ủại, mới ủược ủưa vào
ứng dụng trong chẩn ủoỏn thỳ y tại nước ta trong vài năm trở lại ủõy. Cũng như cỏc phương phỏp sinh học phõn tử khỏc, kỹ thuật này yờu cầu phải cú trang thiết bị mỏy múc, húa chất ủắt tiền kốm theo. Khụng những vậy, trong quỏ trỡnh thực hiện cỏc thao tỏc kỹ thuật, người làm xột nghiệm cần phải tuõn thủ nghiờm ngặt, chớnh xỏc cỏc bước của quy trỡnh kỹ thuật. Húa chất dựng trong phản ứng PCR núi chung thường là một lượng rất nhỏ (tớnh bằng micro lớt-àl). ðặc biệt người thực hiện thao tỏc luụn phải dựng găng tay một lần nhằm trỏnh lẫn tạp từ bờn ngoài vào mẫu. Tất cả những thao tỏc kỹ thuật khụng chuẩn hoặc do sơ suất trong một bước nào ủú của phản ứng cũng ủều cú thể là nguyờn nhõn gõy sai lệch kết quả. Tuy vậy phương phỏp này cú ưu
ủiểm là thời gian chẩn ủoỏn nhanh, chỉ cần vài giờ là ủó cú kờt quả. Do ủú real-time PCR vẫn ủược ứng dụng trong cỏc phũng thớ nghiệm chẩn ủoỏn núi chung.
Kết quả chẩn ủoỏn phỏt hiện virus LMLM bằng phương phỏp real-time PCR ủược thể hiện ở bảng 4.3. Trong 3 năm, cú tổng số 226 mẫu bệnh phẩm xột nghiệm bệnh LMLM bằng phương phỏp này. Trong ủú số mẫu cho kết quả dương tớnh là 181 mẫu chiếm tỷ lệ 80,89%, tỷ lệ này là 19,91% tương
ứng với 45 mẫu cho kết quả õm tớnh. Năm 2008, tỷ lệ mẫu cho kết quả xột nghiệm dương tớnh cao nhất là 87,36%. Tỷ lệ mẫu cho kết quả xột nghiệm õm tớnh cao nhất là 4 thỏng ủầu năm 2009 chiếm 30,43%. Qua bảng 4.3 chỳng tụi cũng thấy ủược, phương phỏp real-time PCR chỉ phỏt hiện ủược mẫu bệnh phẩm ủú là cú virus hay khụng chứ khụng ủịnh type virus. Cặp mồi mà chỳng tụi dựng hiện nay là cặp mồi ủặc hiệu cho tất cả cỏc virus LMLM. Do ủú cỏc mẫu này sau ủú thường lại ủược ủịnh type bằng phương phỏp ELISA hoặc
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………47
RT-PCR, nhằm xỏc ủịnh type virus lưu hành tại vựng ủú ủể cú ủược kế hoạch sử dụng vacxin phũng bệnh.
Bảng 4.3: Kết quả chẩn ủoỏn bằng phương phỏp Real-time PCR Kết quả Năm Dương tớnh (mẫu) Tỷ lệ (%) Âm tớnh (mẫu) Tỷ lệ (%) Tổng số (mẫu) 2007 89 76,72 27 23,28 116 2008 76 87,36 11 12,64 87 4.2009 16 69,57 7 30,43 23 Tổng 181 80,09 45 19,91 226
Hỡnh 4.2: ðường cong biểu thị kết quả real-time PCR
- Dương tớnh: Khi 35 ≥ Ct ≥ 20.
- Âm tớnh: Khi khụng cú ủường cong ủồ thịủi lờn
Trờn thế giới, kỹ thuật này cũng ủó ủược Callanhan và cộng sự, 2002 [39]; Reid và cộng sự, 2002 [56] ỏp dụng trong chẩn ủoỏn phỏt hiện virus LMLM.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………48
4.2.3. Kết quả chẩn ủoỏn bằng phương phỏp phõn lập trờn mụi trường tế bào BHK21
Phõn lập virus trờn mụi trường tế bào là phương phỏp ủược sử dụng lần
ủầu tiờn vào những năm 40 của thế kỷ trước và hiện tại vẫn là kỹ thuật ủược ỏp dụng trong nghiờn cứu và chẩn ủoỏn cỏc bệnh do virus. Ban ủầu virus
ủược nuụi cấy trờn cỏc mụ bào sống, cỏc tế bào xơ phụi như CEF, CEK... Sau
ủú, người ta ủó tỏch, tạo ra tế bào dũng thớch ứng với một (một số) loại virus nhất ủịnh dựng ủể nuụi cấy, phõn lập loại virus ủú như BHK21, Marc145, Vero, MDBK,... Ngoài mục ủớch là chẩn ủoỏn, phõn lập virus, với nhiều loại tế bào dũng thớch ứng với từng chủng virus khỏc nhau, ủõy cũn là phương phỏp ủể nhõn số lượng virus nhiều lờn phục vụ cho cỏc mục ủớch khỏc. Chớnh vỡ tế bào là mụi trường sống ủể virus cú thể nhõn lờn, nờn phương phỏp phõn lập virus LMLM trờn tế bào BHK21 cũng chỉ phỏt hiện ủược những mẫu bệnh phẩm mà RNA của virus chưa bị biến tớnh. Nếu mẫu bệnh phẩm cú virus